郝瑞瑞龐 菲靳洪濤

(1.中國醫(yī)學科學院藥物研究所,新藥安全評價研究中心,北京 100050;2.北京協(xié)和建昊醫(yī)藥技術開發(fā)有限責任公司,北京 100176)

過敏反應是一種Ⅰ型變態(tài)反應,就目前的認識而言,其發(fā)生機制主要為兩種,一種是以IgE抗體為主參與的IgE依賴性過敏反應,另一種是有IgG抗體參與的非IgE依賴性過敏反應[1-2]。IgE依賴性過敏反應發(fā)生分為2個階段,致敏階段:抗原初次進入機體,刺激機體產(chǎn)生免疫球蛋白 E(Immunoglobulin E,IgE)抗體,與體內(nèi)肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面IgE高親和力Fc受體(FcεRI)結合;激發(fā)階段:當致敏階段相同的抗原再次刺激機體時,抗原與IgE抗體的Fab段結合,兩個或兩個以上IgE抗體交聯(lián),進而FcεRI發(fā)生微集聚,啟動肥大細胞及嗜堿性粒細胞活化,釋放已儲存與新合成的生物活性物質(zhì),這些生物活性物質(zhì)會造成平滑肌收縮、腺體分泌增加、毛細血管擴張、通透性增加等一系列效應[3]。IgG抗體引起的過敏反應與IgE引起的被動全身皮膚過敏反應(PSA)相似,主要是低溫、血管擴張和心肺變化。其發(fā)生機制是在抗原進入機體后,刺激機體產(chǎn)生IgG抗體,IgG抗體與嗜堿性細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和肥大細胞表面IgG高親和力Fc受體(FcγR)形成交聯(lián),進而啟動上述細胞活化,釋放血小板活化因子(PAF)、半胱氨酰白三烯(CysLTs),進而引發(fā)全身過敏反應[1]。根據(jù)2013年世界變態(tài)反應組織白皮書[4],全球過敏性疾病的患病率約為10%~40%,其中有3億支氣管哮喘患者、4億過敏性鼻炎患者、1.5億藥物過敏患者以及大量蕁麻疹、濕疹、結膜炎、血管神經(jīng)性水腫、昆蟲過敏、結膜炎、過敏性休克患者。隨著城市化、工業(yè)化進程的不斷加快,過敏性疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢[5],因此,過敏性疾病探索研究與有效治療對于提高人類生存質(zhì)量顯得尤為重要。在過敏性疾病研究中,模型的構建極為重要。但當前對于過敏性疾病體內(nèi)、體外模型構建進行系統(tǒng)的總結、評價性文章并不多見,因此,本文分別從皮膚、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、藥物過敏不同系統(tǒng)過敏性疾病以及體內(nèi)外模型造模方式相結合的角度出發(fā),分別闡述并評價目前研究中所應用的各種不同模型的構建方法、優(yōu)勢與不足,以期對過敏性疾病研究模型的構建提供一定的啟發(fā)與幫助。

1 皮膚及其附件過敏性疾病模型

皮膚及其附件癥狀是機體發(fā)生過敏反應后最常見的表現(xiàn)之一,包括皮膚瘙癢、泛紅、水腫、疼痛等炎癥反應。皮膚過敏癥狀大多是由直接接觸藥物、粉塵等過敏原或紫外線照射等原因造成的,但也存在機體其他器官系統(tǒng)發(fā)生過敏反應后表現(xiàn)為皮膚癥狀[6-7]。皮膚及其附件的過敏癥狀原因不是單一的,在建模過程中,要根據(jù)實驗目的選擇最適模型。皮膚及其附件過敏型疾病模型主要分為兩大類,一是通過注射變應原引起皮膚過敏反應的相關模型,二是變應原通過直接接觸引起的皮膚過敏反應模型。

1.1 被動皮膚過敏反應模型

4-氨基吡啶(4-AP)致敏皮膚瘙癢模型[8]:KM小鼠背部皮下注射1 mL 4-AP(0.2 mg/kg),每隔10 min記錄用藥部位的舔舐頻率,使用舔舐頻率來表示小鼠背部皮膚的瘙癢程度。組胺誘導足腫脹模型[8]:KM小鼠右足皮下注射20μg/kg組胺生理鹽水(0.25 mg/kg),分別于注射15 min和60 min后用千分尺測定小鼠右足厚度,用注射組胺前后小鼠右足厚度差來表示腫脹度。角叉菜堿誘導小鼠皮下組織炎癥反應[9]:將角叉菜堿(每爪300μg)注射到ICR小鼠右后爪的足底表面,使用機械撤退閾值反應皮下組織炎癥嚴重程度。蜱幼蟲提取物誘導綿羊耳部皮膚過敏模型[10]:雌性綿羊在蜱蟲出沒的天然草原牧場放牧,推測其已預先致敏,測量每只綿羊耳朵厚度,并在每只綿羊右耳上側距耳緣1 cm處皮內(nèi)注射蜱幼蟲提取物制劑0.1 mL。分別在接種后1、6、24、48和72 h用電子卡尺測量母羊個體耳厚。蜱幼蟲提取物誘導Nguni牛皮膚超敏反應模型[11]:小牛提前1個月在已知有蜱蟲出沒的天然牧場上放牧。小牛左耳剃毛區(qū)域皮內(nèi)注射蜱幼蟲提取物,測量耳厚度。完全弗氏佐劑誘導大鼠后爪炎模型[12]:雌性SD(Sprague-Dawley)大鼠左后爪皮下注射50μL完全弗氏佐劑。通過爪式熱刺激系統(tǒng)測定熱敏性,從而判定炎癥程度。

上述幾種模型造模思路清晰簡單,但是通過舔舐頻率與耳足厚度來評估過敏反應嚴重程度只能簡單定性,而無法精確定量反應過敏原所引起過敏反應程度,需要更加精確的定量模型。

耳被動皮膚過敏反應模型[8]:KM小鼠雙耳皮下注射1∶10抗卵白蛋白血清(OVA)20μL,72 h后尾靜脈注射含OVA的伊文思藍溶液。30 min后頸椎脫位法處死小鼠,剪下耳廓藍色部分,加入0.75 mL 1 N KOH溶液,37℃過夜消化后加入3.5 mL 0.6 N磷酸溶液和丙酮混合物(按5∶13比例混合),用渦旋機搖床提取,離心,并于640 nm處測定光密度。DNP-人血清白蛋白(DNP-HSA)誘導小鼠耳被動皮膚過敏模型[13]:5周齡雌性BALB/c小鼠,DNP-IgE皮內(nèi)注射入耳致敏,24 h后,DNP-HAS的0.5%伊文思藍溶液100μL尾靜脈注射激發(fā)。30 min后,伊文思藍染色程度表示小鼠耳部皮膚反應嚴重程度。甲酰胺63℃隔夜孵育提取伊文思藍,595 nm處測定吸光度。抑制率=(對照組藍斑直徑-實驗組藍斑直徑)/對照組藍斑直徑×100%。弗氏完全佐劑誘導小鼠背部皮膚過敏模型[14-15]:6~8周齡18~22 g雌性BALB/c小鼠,第1天弗氏完全佐劑的生理鹽水溶液(50%)100μL小鼠背部皮下注射,第4、7、10天在小鼠背部皮膚上涂抹100μL弗氏完全佐劑的生理鹽水溶液(50%)繼續(xù)致敏,攻擊3 d后,所有小鼠CO2安樂死,在無菌環(huán)境中采集血液和腎臟進行HE染色、免疫比濁法和ELISA檢測血清IL-6含量。小鼠皮膚過敏評分為:0分,完全正常;1分,散發(fā)性紅斑或輕度紅腫;2分,中度紅腫或彌漫性紅腫;3分,重度紅斑或紅腫。將≥1評分定義為陽性致敏,計算致敏率。外源性低分子量化合物誘導小鼠超敏反應模型[16-17]:無特異性病原體(SPF)雌性6~8周齡20~22 g BALB/c小鼠,0.5或1 mg綠原酸溶于生理鹽水中皮下注射至小鼠右后足,頸椎脫位法處死小鼠,去除處理側和未處理側的小鼠腘窩淋巴結(PLN),放置于冰涼的1%BSA的PBS溶液中,切除多余脂肪組織后稱重,采用流式細胞儀對每個分離的PLN細胞同時進行三色分析,制備PLN淋巴細胞緩沖液,進行酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISPOT)檢測IgM、IgG1、IgG2a以及IgE。

上述四種被動皮膚過敏反應模型區(qū)別之處在于選用了不同的變應原刺激小鼠,測定耳部藍染的伊文思藍含量,免疫比濁法、ELISA法測定相關因子等都可以定量反映過敏嚴重程度,是較為精確的一種過敏反應模型,可應用于定量反應藥物治療皮膚過敏性疾病有效率。

1.2 皮膚及其附件接觸性過敏反應模型

小鼠耳接觸超敏反應模型[18]:6~8周齡BALB/cJ小鼠,手術膠帶去除小鼠耳垂絨毛,每隔2 d涂抹1%2,4-二硝基氯苯(DNCB),持續(xù)1個月。每次涂抹DNCB 24 h后測量耳厚度。ELISA法進行血清IgE濃度測定,第2周末取小鼠尾靜脈血使用ELISA試劑盒測定進行測定,稀釋200倍后測定血清IgE濃度。小鼠耳部制成6μm厚度切片,HE染色進行組織學觀察,顯微鏡下觀察淋巴細胞浸潤以及表皮增厚情況。制備單細胞懸液,分離總引流淋巴結細胞和CD4+T細胞,進行RNA提取及RT-PCR分析。2,4二硝基氟苯(DNFB)誘導局部接觸性過敏小鼠模型[19]:6~8周齡雌性野生型C57BL/6小鼠,每只小鼠剃去腹部毛發(fā),使用0.5%2,4-二硝基氟苯(DNFB)溶解于丙酮和橄欖油的混合物處理小鼠腹部皮膚。5 d后用0.2%DNFB每耳10μL刺激小鼠雙耳前后部。刺激48 h后用測微儀測量小鼠耳厚,判斷小鼠耳部局部接觸性過敏反應嚴重程度,并進行細胞分離和流式細胞術分析樹突細胞、T細胞以及巨噬細胞等各類免疫細胞數(shù)量在不同階段的變化情況[20]。氫醌(HQ)接觸性超敏反應小鼠模型[21]:將1%或更高濃度氫醌涂抹在小鼠耳廓上,第7天和第14天耳廓涂抹氫醌,可引起濃度依賴性耳腫脹。第二次刺激的接觸性超敏反應較第一次明顯更為嚴重,BALB/c小鼠對氫醌的敏感性高于C57BL/6小鼠。偏苯三酸酐(TMA)誘導小鼠接觸性皮膚過敏模型[22]:6~8周齡雄性BALB/c小鼠,第0天,50μL 10%TMA剃毛致敏;第5~10天開始,每天用20μL 3%小鼠左耳后部刺激;第5~7天,用數(shù)字千分尺測定耳廓腫脹度。通過左耳(過敏原激發(fā))減去右耳(溶劑對照)來計算耳腫脹的凈增加。鄰苯二甲酸酐(PA)誘導小鼠特應性皮炎[23]:HR-1小鼠,8周齡,將5%PA溶液100μL涂抹于小鼠耳背及背部皮膚,每周3次,持續(xù)4周。實驗過程中,電子天平每周測量1次小鼠體重。4周后處死小鼠,測定小鼠淋巴結重量,測厚儀測量耳厚,從而評估PA引起的過敏性皮膚炎癥的嚴重程度。取小鼠耳背部皮膚,切片,甲苯胺藍染色檢測肥大細胞脫顆粒情況;ELISA法測定血清IgE濃度、血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平。接觸型超敏反應評價[24]:SPF雄性6~10周齡BALB/c(H-2)小鼠,腹部胸部剃毛,25μL 0.5%二硝基氯苯(丙酮:橄欖油=4∶1)溶液涂抹,千分尺測量耳朵厚度,刺激24 h后再次測量。增加的耳朵厚度以平均數(shù)±標準差(±s)表示。測量耳重、血管通透性實驗、耳提取物中干擾素-γ體外測定、髓過氧化物酶(MPO)法間接定量嗜中性粒細胞等方式判定接觸性超敏反應發(fā)生程度。

上述幾種都是變應原直接涂抹于動物皮膚所構建的皮膚接觸性過敏反應模型,小鼠耳部皮膚是觀察皮膚反應的較為理想的位置,因此誘導皮膚接觸性過敏反應多選取小鼠耳部皮膚,通過耳部皮膚的腫脹度或耳厚度來評估過敏反應的強烈程度,但耳腫脹度與耳厚度作為定量指標仍然不夠嚴謹,同時可以通過采集模型動物血液、制備細胞懸液,制備切片等方式進行定量分析以及可視化觀察,從而更加準確的評估模型動物反應程度。上述模型詳細對比見表1。

表1 皮膚及其附件過敏反應模型對比Table 1 Comparison of allergic reaction models of skin and its accessories

2 呼吸系統(tǒng)過敏性疾病模型

呼吸系統(tǒng)的過敏性疾病主要包括吸入過敏原引起的咳嗽、氣道過敏以及哮喘等。檸檬酸誘導豚鼠咳嗽模型[25]:豚鼠暴露于檸檬酸環(huán)境下,0.5 mol/L霧化吸入10 min,豚鼠置于允許自由移動的室內(nèi),并配備內(nèi)部麥克風和壓力傳感器測量咳嗽,用氣速儀記錄呼吸和咳嗽引起的氣流變化,咳嗽聲被放大并記錄。雪松花粉誘導小鼠鼻內(nèi)過敏[13]:日本雪松花粉粒(0.5 mg懸浮于20 mL PBS中)鼻腔攻擊小鼠7次,每天1次,計數(shù)打噴嚏的次數(shù)。大鼠氣道超敏反應模型[26]:氣管內(nèi)滴注嗜酸性粒細胞顆粒或合成陽離子蛋白溶液0.1 mL,使用全細胞穿孔膜片鉗進行電生理記錄,測定給予刺激后不同時刻膜電位的變化、動作電位數(shù)目、膜電位峰值以及電流變化。煙曲霉菌提取物蛋白誘導小鼠氣道炎癥模型[27]:RK小鼠,5月齡,采用50 mg煙曲霉菌提取物蛋白加2 mg氫氧化鋁稀釋的煙曲霉IgE溶于PBS緩沖液中,分別于第0天和第10天皮下注射致敏RK小鼠。隨后,小鼠在第18天至第25天暴露于煙曲霉菌孢子污染的環(huán)境中,第25天處死小鼠,取支氣管肺泡灌洗液(BALF)和肺組織進行組織學分析,建模過程如圖1所示。熱凝固蛋清(HEW)誘導小鼠晚期反應(LPR)模型[6,28]:6周齡BALB/c小鼠,皮下注射HEW(40 mg),14 d后在足墊內(nèi)注射50μL熱聚卵白蛋白(20 mg/mL),立即出現(xiàn)以足墊腫脹和嗜酸性粒細胞浸潤為特征的超敏反應。

圖1 煙曲霉誘導小鼠氣道炎癥模型建模過程Figure 1 Modeling process of Aspergillus fumigatus-induced airway inflammation model in mice

呼吸系統(tǒng)過敏性疾病模型構建主要通過吸入變應原或直接氣管滴注的方式誘導動物發(fā)生呼吸系統(tǒng)過敏反應,取BALF和肺組織分析,測定咳嗽次數(shù)、氣流變化以及電生理指標等多適用于呼吸系統(tǒng)模型,同時也可以通過ELISA法檢測血清IgE濃度、各類細胞因子濃度等免疫相關指標,制備切片顯微鏡下觀察,流式細胞儀分析淋巴細胞等定性定量評估模型動物過敏反應嚴重程度。

3 消化系統(tǒng)過敏性疾病模型

口服藥物誘導大鼠胃腸超敏模型[29]:5周齡Brown Norway大鼠,將受試藥物混懸液或溶媒(0.5%甲基纖維素溶液)口服28 d,每日給藥量阿莫西林(AMX)和磺胺甲噁唑(SMX)為500 mg/kg,D-青霉素胺(D-Pen)和磺胺甲噁唑(SMX)為500 mg/kg、苯妥英鈉(PHT)為300或450 mg/kg,每周測量一次體重,每天記錄2次動物臨床體征,包括任何異常的外表或行為。大鼠安樂死,異氟醚吸入麻醉后腹主動脈采血,ELISA法測量血清IgE濃度,并檢測血液中白細胞、中性粒細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和大的未染色的細胞的數(shù)量,流式細胞儀對淋巴細胞進行分析;采血后,取脾、腸系膜淋巴結和小腸切片,蘇木精伊紅(HE)染色鏡檢。結腸過敏大鼠模型[30]:250~350 g雄性SD大鼠,腹腔注射1 mL溶有10μg卵白蛋白(抗原)和10 mg氫氧化鋁(佐劑)的生理鹽水溶液。注射后第3天至第5天,使用抗原液以50μL/min進行大鼠結腸灌流30 min,再使用30 mm級汞柱重復刺激大鼠結腸過敏5次,間隔為3 min?？乖河?0μg/mL卵白蛋白、40 mmol/L D-葡萄糖組成,與氯化鈉等滲。對三硝基苯磺酸(TNBS)誘導大鼠結腸炎模型[31]:180~200 g成年雄性SD大鼠,2%異氟醚麻醉,將TNBS(100 mg/kg)和50%乙醇(體積比2∶1)經(jīng)直腸注入遠端結腸腔(距肛門近端7 cm)。通過對體重、大便稠度和腸出血評分(0~4分),獲得疾病活動指數(shù)(DAI)。所有動物在TNBS后第7天和第14天進行評估;為評價TNBS灌服引起的軀體痛覺過敏,于第7天和第14天測定大鼠的機械和熱行為實驗,使用機械拔爪(PWL)時間和熱痛閾值來反應軀體痛覺過敏程度,從而反應內(nèi)臟超敏程度。對三硝基苯磺酸(TNBS)誘導小鼠結腸炎模型[32]:雄性18~20 g C57BL/6小鼠,麻醉條件下將TNBS(1.75 mg/只,含50%乙醇)經(jīng)距肛門近端4 cm的細導管一次性注入結腸,誘導小鼠結腸炎模型。經(jīng)TNBS處理后,小鼠倒立5 min。對小鼠結腸組織進行髓過氧化物酶檢測(MPO),并在誘導結腸炎后第7天取結腸組織進行HE染色。內(nèi)臟超敏反應程度(內(nèi)臟痛閾)利用腹壁退縮反射(AWR)程度來間接反映:肛門連接球囊擴張器,采用維持球囊擴張所需注氣量(0.1~1.0 mL)來反應AWR,即腹部離開平臺時突然而持續(xù)的腹部肌肉收縮。鋁誘導大鼠內(nèi)臟超敏模型[33]:大鼠口服1.5 mg/kg檸檬酸鋁,通過誘發(fā)痛覺過敏所需平均壓力不同來反應內(nèi)臟超敏反應嚴重程度。結直腸擴張(CRD)誘發(fā)大鼠內(nèi)臟超敏模型[34]:斷奶前雄性SD大鼠(小于8日齡),與成年雌性大鼠共同飼養(yǎng)至25日齡,體重到達200~250 g時分組,新生CRD模型構建:大鼠出生第8、10、12天使用插入降結腸和直腸上部的血管成形術球囊。球囊在60 mmHg壓力下用0.3 mL水膨脹1 min,然后放氣退出。間隔30 min,重復擴張兩次。假手術組除不施加壓力外,處理方式與CRD置入組相似。成年CRD組不進行擴張,8周后,將成年CRD應用于所有大鼠,其中80 mmHg(1 min)擴張2次,間隔5 min。通過腹部戒斷反射[35](AWR)評估大鼠膨脹痛閾值。將30日齡大鼠下丘腦組織切片進行免疫熒光標記。將下丘腦室旁核和垂體在50 mmol/L鹽酸緩沖液(pH=7.4)中勻漿,采取ELISA法測定促炎因子水平。

消化系統(tǒng)過敏性疾病造模主要通過腹腔注射、結腸灌流等方式誘導,由于消化系統(tǒng)器官的特點,無法直接觀察其過敏反應程度,需要一些間接的指標來反映,上述幾種消化系統(tǒng)過敏性疾病模型中,可間接通過對內(nèi)臟發(fā)生過敏反應后所產(chǎn)生痛覺的評估(如:機械拔爪時間、熱痛閾值和腹壁退縮反射等)或者疾病活動指數(shù),但這些間接指標仍無法精確定量,定量檢測仍需ELISA法檢測血清IgE濃度[36]、各類細胞因子濃度等免疫相關指標,流式細胞儀分析淋巴細胞等途徑評估模型動物過敏反應嚴重程度,隨著動物成像技術的進步和設備的應用,可以探索將成像技術用于消化系統(tǒng)病變的直接觀察。

4 神經(jīng)系統(tǒng)過敏疾病模型

脂多糖(LPS)誘導小鼠疼痛過敏、脊髓炎癥模型[37]:5日齡SD大鼠幼鼠腹腔注射LPS(2 mg/kg),注射LPS 5 min后,注射總體積為0.1 mL含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的無菌生理鹽水溶液。注射后24 h測量體重并測試記錄行為。每組16只幼鼠,斷頭處死8只,采集新鮮腰髓組織,剩余8只經(jīng)心臟灌注生理鹽水,制備脊髓切片進行免疫組化染色。采用馮弗雷纖維絲試驗[38-39](von fery filament test)評估大鼠機械性痛覺。搖尾實驗測定尾閃潛伏期平均值,評估大鼠熱傷害閾值。采用ELISA法檢測大鼠脊髓中IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、CORT和PGE濃度,并將上述指標作為炎癥反應標記物。辣椒素誘導小鼠機械過敏模型[40]:雄性CD-1小鼠,6~8周齡,右后掌足底中部注射辣椒素增敏,注射15 min后測定機械刺激的戒斷潛伏期。同樣采用馮弗雷纖維絲試驗評估小鼠機械性痛覺。芬太尼誘導大鼠超敏模型[41]:雄性SD大鼠,50~100 g,芬太尼(60 mg/kg)每隔15 min皮下注射,共注射4次,總劑量為240 mg/kg(為模擬人類手術中使用的大劑量阿片類藥物治療)。分別于給藥后第0、1、5、6、6.5、7、8 h,以及給藥后第1、2、3、4、5天測定機械刺激和熱刺激的傷害性閾值。機械敏感性評估采用馮弗雷纖維絲試驗;采用Hargreavs法[42]評估熱敏感性,即測量引起足底縮足所需的潛伏期(以s為單位)?？Х纫蛘T導大鼠腎上腺素(HPA)軸超敏模型[43]:無特定病原體(SPF)Wistar大鼠(8周齡雌性200~240 g,10周齡雄性260~300 g),實驗條件下適應一周,大鼠從妊娠第0天(GD)至出生后12周(PW)的處理如圖2所示。兩只雌性大鼠與一只雄性大鼠過夜,觀察到交配證據(jù)(即陰道栓或精細胞陰道圖片)的日期定位妊娠第0天(GD 0),從GD 9~GD 20對孕鼠進行灌胃咖啡因給藥120 mg/(kg·d)[44];16只孕鼠在GD 20異氟醚麻醉下安樂死,取出胎盤組織,稱量胎兒體重,斷頭處死胎鼠,取血離心備用,在解剖學范圍內(nèi)解剖并收集胎鼠腦組織(每性別4例)進行免疫熒光分析;其余孕鼠正常分娩,標準化幼仔數(shù)量為8只,出生后第1周(PW 1)稱重,評估幼鼠是否存在慢性應激;對照組和模型組進行冰水游泳試驗,取腦組織進行免疫組織化學和免疫熒光分析,血樣進行血清ACTH和皮質(zhì)酮(CORT)檢測,從而評估咖啡因?qū)PA軸活性產(chǎn)生的影響作用。白藜蘆醇(RTX)誘導神經(jīng)源性炎癥導致小鼠足水腫模型[45]:8周齡雄性ICR小鼠,腹腔注射RTX溶液,1小時后測量后爪厚度;為消除測量偏差,每隔5 min測量雙側后爪3次,后爪厚度用6個測量值的平均值表示。部分坐骨神經(jīng)結扎(PSNL)誘導小鼠機械超敏模型[46]:雄性DDY小鼠,25-35 g,腹腔麻醉注射0.4 mg/kg美地托咪啶、2.0 mg/kg咪達唑侖和5.0 mg/kg布托啡諾。根據(jù)Stelzer法[47],暴露左側坐骨神經(jīng),并用外殼縫線緊密結扎。同樣采用馮弗雷纖維絲試驗[36]評估大鼠機械性痛覺。結果的反應評分為0~3分(0:無反應,1:后足抬起,2:后爪快速拔除。3:后爪搖動和舔)。每次試驗間隔至少5~7 s的七項試驗總評分記錄為疼痛評分[48];取出腦組織,進行免疫組化可視化切片進行觀察。

圖2 大鼠從妊娠第0天(GD 0)至出生后12周(PW 12)的處理過程Figure 2 Treatment process of rats from the 0th day of pregnancy(GD 0)to 12 weeks after birth(PW 12)

上述神經(jīng)系統(tǒng)過敏性疾病模型通過外源性藥物、內(nèi)毒素或手術進行誘導,評估過敏反應程度多采用痛覺指標,通過馮弗雷纖維絲試驗評估機械刺激傷害閾值,通過Hargreavs法評估熱刺激傷害閾值。由于神經(jīng)系統(tǒng)的特殊性,想要通過模型定量精確評估過敏反應仍然存在一定的難度,動物模型與臨床疾病的對應性也需要科研工作者們繼續(xù)探索確證。

5 基因工程動物來源過敏性疾病模型

Il-36r拮抗劑缺陷型(IL-36R antagonistdeficient,Il-36rn-/-)銀屑病小鼠模型[49]:使用含咪喹莫特(IMQ)的乳膏局部涂抹Il-36r拮抗劑缺陷型(Il-36rn-/-)和Il-36r基因缺陷型(IL-36R-deficient,Il-36r-/-)小鼠耳部皮膚,兩種小鼠進行對比;觀察小鼠耳腫脹、棘皮病、紅斑、皮膚剝落和角化過度;采用流式細胞術對炎性耳浸潤進行定性與定量分析?；蚯贸蚀蠹毎毕菪托∈竽Ｐ蚚50]:6~8周齡C57BL/6背景的G蛋白偶聯(lián)受體X2(MRGPRB2)基因敲除(MUT)小鼠,腹腔注射70 mg/kg戊巴比妥鈉,實驗前靜脈注射50μL伊文思藍染液(12.5%生理鹽水,w/v),用游標卡尺測量足爪厚度,使用丙酮生理鹽水提取伊文思藍染料,于620 nm處測定OD值。體溫試驗:采用野生型(WT)或Mrgprb2基因敲除(MUT)6~8周齡小鼠,用生物功能實驗系統(tǒng)記錄小鼠體溫,并將探針插入小鼠肛門,得到直腸溫度,3 min測量1次,共持續(xù)30 min。血管活性腸肽(VIP)基因缺乏小鼠后足超敏模型[51]:成年C57BL/6Vip-/-小鼠,Vip+/+作為對照,小鼠接受不同的神經(jīng)損傷:備用神經(jīng)損傷(SNI)、正中神經(jīng)損傷(MNI),采用馮弗雷纖維絲試驗評估小鼠機械傷害閾值,并進行后足觸覺刺激;取脊髓進行促炎因子表達及淋巴細胞分析。不同基因缺陷小鼠脂質(zhì)過氧化過敏模型[52]:野生型(WT)、Xpa-/-、Ercc1-xpf內(nèi)切酶復合物基因(Ercc)亞純突變體(Ercc-/Δ,表達正常補體Ercc1-xpf的5%,但Ercc-/-小鼠壽命僅4周,而Ercc-/Δ小鼠壽命為7個月[53-57],小鼠皮下注射0.5 mL/kg CCL4,制成1∶1橄欖油懸浮液,每周2次,共5周;當小鼠被判定為晚期或自發(fā)活動減少時,處死、分離組織進行組織學分析,評估受試小鼠肝中脂質(zhì)過氧化水平,對小鼠肝、腎和胰腺切片并進行評分。2,4,6-三硝基氯苯(TNCB)誘導EomesGfp/tx Rorc(gt)-CreTgx Rosa26RYfp/t小鼠接觸性皮炎[58]:測定不同時間點耳腫脹反應、皮膚天然淋巴樣細胞(固有淋巴樣細胞,ILCs)數(shù)和細胞因子的產(chǎn)生;半抗原刺激小鼠誘導皮膚和耳部引流淋巴結中自然殺傷細胞的早期增加,分別與不同時間點耳部腫脹反應的峰值相對應。兩條曲線對比從而反映小鼠過敏反應過程中ILCs、細胞因子不同時刻的變化規(guī)律。

基因工程動物模型較之傳統(tǒng)動物模型目的性與針對性更強,但仍然不能完全模仿人類過敏性疾病的病理生理過程,相較于人類,基因工程動物模型不具有免疫細胞和因子的系統(tǒng)性改變,疾病的靶基因也不一定具有特異性,只有不斷期待基因工程技術的進步,爭取早日構建出更加貼合人類過敏特性的基因工程動物模型[59]。

6 體外模型

大鼠嗜堿性白血病細胞系(RBL-2H3細胞)模型[13]:10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,使用1.0 ng/mL抗二硝基苯酚(DNP)敏化RBL-2H3細胞,培養(yǎng)8 h,PBS去除未結合IgE,1.25 ng/μL DNP-BSA Tyrode’s緩沖液(MT緩沖液)加入細胞培養(yǎng)孔,孵育30 min,細胞經(jīng)4℃冷凍10 min,離心收集上清液。裂解細胞使細胞釋放組胺,使用組胺EIISA試劑盒檢測組胺含量,Wallac 1420 ARVOsx多標簽計數(shù)器測定RBL-2H3細胞脫顆粒后Ca2+內(nèi)流情況,在DNP-BSA刺激下,每隔1 min測定1次,共10 min。C48/80誘導小鼠腫瘤細胞肥大細胞株(P815肥大細胞)脫顆粒模型[60]:10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞48 h,Tyrode’s緩沖液沖洗3次,平衡10 min。以50μL C48/80(10μg/mL)進行刺激,45 min后離心收集上清液和細胞,測定生物活性介質(zhì)。采用組胺ELISA試劑盒測定并分析上清液中組胺水平。測定β-氨基糖苷酶濃度、染色測定細胞脫顆粒率。氟喹諾酮類藥物誘導人肥大細胞系2(LAD 2)超敏模型[50]:10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,以 每毫升2×106個細胞密度進行細胞培養(yǎng),并使用氟喹諾酮類藥物孵育建立LAD 2細胞超敏模型,進行細胞內(nèi)鈣動員實驗、β-己糖苷酶釋放實驗、組胺釋放實驗、小干擾RNA(siRNA)轉染實驗,從而判定LAD2細胞模型超敏反應程度。LPS刺激小鼠巨噬細胞株RAW 264.7模型[18]:使用添加10%胎牛血清改良和100 U/mL青霉素100μg/mL鏈霉素的10%胎牛血清Eagle’s培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞適應一段時間后,1 μg/mL LPS刺激8 h進行分析。采用臺盼藍染色法進行細胞毒性試驗,通過流式細胞術分析細胞內(nèi)TNF-α水平。半抗原特異性LN細胞模型[61-62]:加入0.5 mmol/L DNBS后培養(yǎng)LN細胞72 h,收集上清液進行ELISA檢測,采用流式細胞術分析細胞內(nèi)IL-36α表達水平。煙曲霉菌可溶性蛋白誘導肥大細胞脫顆粒模型[27]:3月齡SD大鼠,使用肝素化Hank’s平衡鹽溶液10 mL腹腔灌洗獲得新鮮肥大細胞,混合洗滌兩次,并在含10%胎牛血清的RPIM-1640培養(yǎng)基中以所需濃度懸浮,加入煙曲霉菌可溶性蛋白孵育15 min,固定細胞后使用0.1%甲苯胺藍染色測定肥大細胞脫顆粒百分率[63-64]。

過敏反應研究體外細胞模型大多使用肥大細胞模型,也有巨噬細胞、RBL-2H3細胞株等其他細胞模型,肥大細胞脫顆粒模型是一種能較為直觀反映細胞過敏程度的一種方法,P815細胞相較于RBL-2H3細胞適合作為一種早期、穩(wěn)定、敏感的肥大細胞脫顆粒體外檢測模型[59]。

總體來講,體外細胞模型的構建思路主要為選擇適宜的細胞株進行適應性培養(yǎng)后加入致敏原進行孵育,進而再通過染色,流式細胞術分析等檢測手段分析模型細胞相關檢測指標,從而反映該模型過敏程度和過敏機制。

研究中常用的過敏性疾病體內(nèi)外模型需要滿足以下幾點:①模型構建盡可能貼合人類過敏性疾病發(fā)生發(fā)展病理生理過程。②滿足研究所需的定性定量要求。③能夠確定反應過敏性疾病的相關免疫指標,并能夠找到一定的方法精確、經(jīng)濟的測量。④符合動物倫理、福利要求并進行評估。本文通過匯總、分析常用過敏性疾病研究模型,通過分析各類模型的異同與優(yōu)劣之處,希望為研究者選擇合適的過敏性疾病模型或者進行改進提供參考和啟發(fā)。