宋韶鶴,苗晉鑫,王 崢,張春敭,苗明三

(1.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,鄭州 450000;2.河南中醫(yī)藥大學,鄭州 450046;3.鄭州大學第一附屬醫(yī)院,鄭州 450052)

食管癌(esophageal cancer,EC)是消化道常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率分別居全球惡性腫瘤的第8位和第6位,且逐年上升和趨于年輕化[1]。我國是食管癌高發(fā)地區(qū),食管癌發(fā)病率和死亡率均居世界首位,且新發(fā)病例占據(jù)世界新發(fā)食管癌病例一半以上[2]。食管癌主要有兩種病理組織類型,食管腺癌(esophageal adeno-carcinoma,EAC)和食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinaoma,ESCC)[3],我國食管癌類型主要是食管鱗癌[4]。盡管現(xiàn)代治療技術取得了新的進展,但是食管癌預后仍然很差,5年生存率不足20%[5-6]。現(xiàn)今,中藥防治腫瘤受到更多關注,臨床研究顯示中藥能顯著提高食管癌患者免疫能力、逆轉(zhuǎn)化療藥物的耐藥性以及改善預后[7-8]。但是,中藥防治食管癌的分子機制尚不完全清楚。因此,了解這些機制對中藥改善食管癌患者的預后至關重要。食管癌小鼠模型是研究EC發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和治療腫瘤策略進行臨床前測試重要的實驗工具。本文回顧了目前常用的EC小鼠模型,包括化學誘導性食管癌模型、移植性食管癌模型、基因工程小鼠模型。對每種EC小鼠模型的制備方法、模型特點及使用范圍進行闡述和比較,為食管癌小鼠模型的發(fā)展和中醫(yī)藥防治食管癌的研究提供科學依據(jù)。

1 誘發(fā)性食管癌小鼠模型

誘發(fā)性食管癌小鼠模型多為致癌因素與動物的食管直接或間接接觸,使食管發(fā)生癌變,形成食管癌動物模型?；瘜W法是誘發(fā)動物食管癌常用的方法之一,通過化學致癌物使小鼠致癌,建立化學誘導小鼠食管癌模型?；瘜W致癌物的劑量、給藥方案、小鼠品系和年齡等諸多因素影響化學致癌物誘發(fā)腫瘤發(fā)生率。亞硝胺類致癌物是食管癌誘發(fā)模型的誘癌劑,但是相關法律規(guī)定亞硝胺類化學物不在用于動物實驗。本文重點介紹,4-硝基喹啉-N-氧化物(4-NQO)誘發(fā)小鼠食管癌以及致癌物結合轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究食管癌。

4-NQO是一種水溶性的喹啉衍生物,在體內(nèi)4-NQO主要在還原酶的作用下引起DNA單鏈斷裂、堿基缺失和氧化堿基等DNA的損傷而產(chǎn)生癌變。由于食管分布較多的4-NQO還原酶,所以食管是4-NQO作用的主要靶器官之一。Tang等[9]首先用100μg/mL的4-NQO放入水中,使C57BL/6或CBA小鼠自由飲水16周,然后用正常水繼續(xù)喂養(yǎng)12周,28周病理組織觀察所有的小鼠食管出現(xiàn)扁平的鱗狀異型增生,外生性乳頭鱗狀腫瘤和浸潤性鱗狀細胞癌等食管鱗癌特征。杜展等[10]用同樣的方法建立食管癌模型,利用食管拉網(wǎng)的方法檢測12周的小鼠食管,病理組織學發(fā)現(xiàn)食管上皮不典型增生,且分別在第16、20和24周觀察到浸潤性食管鱗癌的發(fā)生。研究人員利用復方化濁潤燥降氣方能有效減輕4-NQO誘導的小鼠食管癌前病變模型的病理損害程度,確定復方化濁潤燥降氣方能夠預防和治療小鼠食管癌前病變[11]。Zheng等[12]在飲水中用18μg/mL 4-NQO處理雌雄各8只129J/C57B6/L小鼠8周,然后換成常規(guī)飲用水處理10周,結果在第18周結束時,小鼠食管既有腺癌又有鱗狀細胞癌兩種類型,且雄性小鼠對ESCC的腫瘤發(fā)生更敏感。呂翠田等[13]利用六君子湯對4-NQO誘導的食管癌小鼠干預,六君子湯組小鼠活動較正常,體重下降不明顯;與模型組相比,六君子湯組顯著提高CD4+/CD8+T細胞比例,提高IL-10等細胞因子水平提升機體免疫功能,糾正CD4+/CD8+T細胞比例改善免疫功能失衡及免疫抑制。

許多基因工程小鼠對4-NQO誘導的食管癌變表現(xiàn)出更高的敏感性。王立群等[14]利用4-NQO誘導SLC39A5基因敲除的C57BL/6小鼠和野生C57BL/6小鼠食管癌模型的成瘤情況,SLC39A5基因敲除小鼠誘導成瘤率低于野生小鼠,確定SLC39A5基因?qū)κ彻馨┌l(fā)生有影響。另外,miR-31過表達轉(zhuǎn)基因小鼠模型和Cyclin D1過表達轉(zhuǎn)基因小鼠,Nrf2基因敲除小鼠模型和p53突變小鼠模型結合4-NQO飲水誘導更易于誘發(fā)食管鱗狀細胞癌[15]。以上研究提示,誘發(fā)性食管癌模型制備方法穩(wěn)定,致癌部位集中在上消化道,成模率高,模擬了食管癌動態(tài)發(fā)展過程,有助于食管癌變機制與形態(tài)學的研究。但是化學誘導的食管癌病變演變迅速和成瘤部位難確定,需要控制造模時間。

2 移植性食管癌小鼠模型

移植性食管癌小鼠模型是將食管癌組織或細胞系接種于小鼠體內(nèi)形成食管癌動物模型。根據(jù)不同的移植部位,分為異位移植(皮下或腹腔)與原位移植(食管)[16-17];根據(jù)不同的移植腫瘤處理方式,分為細胞移植和組織塊移植。同種移植(動物之間)模型在食管癌中研究很少,我們不做闡述。異種移植(人與動物之間)食管癌小鼠模型是目前應用最多的食管癌動物模型,主要將人食管癌細胞或人食管癌組織接種于免疫缺陷小鼠而建立的模型。本文主要介紹皮下異種移植瘤模型與原位異種移植瘤模型。

2.1 皮下異種移植瘤模型

皮下異種移植瘤是指將人的食管癌細胞系或患者食管癌組織接種于免疫缺陷小鼠的皮下,使免疫缺陷小鼠皮下形成腫瘤。多種人食管鱗癌細胞株KYSE-270、KYSE-70、KYSE-30以及食管腺癌細胞株OACM5.1和SK-GT-4等用于皮下細胞系異種移植(cell-line-derived xenograft,CDX)模型的建立[18]。彭海燕等[19]將食管鱗癌Eca109細胞接種裸鼠皮下,建立食管鱗癌移植瘤模型,體內(nèi)評價槲寄生堿抑制食管癌移植瘤生長和延長荷瘤小鼠的生存期。利用Eca109建立裸鼠皮下異種移植瘤模型評價啟膈化痰合劑對順鉑治療小鼠有增效作用[20]。Crescenzi等[21]將1×106食管鱗癌Kyse-30細胞皮下接種重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠雙背外側,成功建立了ESCC皮下移植瘤模型。Ma等[22]利用食管Eca109細胞皮下異種移植裸鼠建立食管癌小鼠模型,通過體內(nèi)模型闡明雙氫青蒿素(青蒿素衍生物)可能通過細胞阻滯誘導自噬。柏文等[23]利用綠色熒光蛋白(GFP)和熒光素酶(Luc)雙標記ECA109細胞建立光學EC腫瘤模型,動態(tài)觀察ECA109食管癌細胞在裸鼠皮下生長過程。雖然遠處轉(zhuǎn)移是EC的常見現(xiàn)象,但是極少有研究報道食管癌皮下異種移植模型發(fā)生遠端轉(zhuǎn)移。Liu等[24]比較了8種食管癌細胞分別接種4種不同類型的免疫缺陷小鼠,發(fā)現(xiàn)5×106的食管腺癌FLO-1細胞皮下接種12只NOD-SCID IL-2RγKO(NSG)小鼠和5只NOD-SCID小鼠均能皮下成瘤,但只有11只NSG小鼠發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移。細胞系移植皮下腫瘤生長速度快且可以直接評估腫瘤的生長,但是細胞系缺乏腫瘤異質(zhì)性,無法反應有限數(shù)量細胞引起的人類腫瘤發(fā)展等局限性。

由于皮下CDX移植模型的局限性,研究人員開發(fā)患者來源的異種移植(patient-derived tumor xenograft,PDX)模型用于腫瘤的研究。Zou等[25]利用EC患者手術切除的新鮮食管鱗癌組織皮下植于SCID小鼠,成功建立ESCC PDX移植小鼠模型,結果發(fā)現(xiàn)ESCC PDX在組織病理學特征和化學敏感性與原發(fā)性腫瘤高度吻合。PDX保留了人類腫瘤的原始結構和基質(zhì)成分,并保留了人腫瘤的異質(zhì)性,產(chǎn)生PDX的原始組織可以在體內(nèi)連續(xù)擴增等優(yōu)勢。但是較長的模型建立時間和需要免疫缺陷宿主限制了該動物模型的擴大應用。

2.2 原位異種移植瘤模型

皮下移植瘤模型不是自然形成的腫瘤,難以模擬人類食管癌原位生長的情況以及遠處轉(zhuǎn)移的特征,與皮下模型相比,原位移植模型是研究EC更好的選擇。原位移植是在食管接種人的食管癌細胞或組織,數(shù)周后腫瘤形成并發(fā)生腫瘤侵襲及遠處器官轉(zhuǎn)移。Gros等[26]利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法獲得GFP穩(wěn)定表達的人食管腺癌PT1590細胞,將PT1590-GFP細胞皮下注射裸鼠,腫瘤發(fā)生后無菌切除、破碎,通過手術將1 mm3的腫瘤塊植入小鼠腹部食管胞漿,建立模擬EAC患者原發(fā)腫瘤生長以及肝、肺和淋巴結轉(zhuǎn)移模型。另有研究利用熒光素酶標記人食管鱗癌TE8細胞,2×106細胞注射裸鼠腹段食管,利用小動物活體成像發(fā)現(xiàn)3周開始出現(xiàn)食管腫瘤,表明成功建立了ESCC原位移植模型[27]。有報道利用生物發(fā)光成像技術建立ESCC原位移植模型,用于評價藥物作用[28]。原位移植模型模擬了患者食管癌發(fā)生的局部和轉(zhuǎn)移特征,且能夠短期內(nèi)檢測藥物的療效及治療策略。但是由于解剖部位特殊和移植手術的復雜,此模型應用受到限制。另外,由于是免疫缺陷小鼠,無法研究腫瘤與宿主相關因素。

3 基因工程食管癌小鼠模型

誘發(fā)性食管癌小鼠模型是研究環(huán)境因素的必要動物模型,而腫瘤的發(fā)生和發(fā)展還受體內(nèi)多基因的變化和多因素的累積等綜合影響。因此,需要基因工程小鼠模型的建立,該模型加強了對癌癥生物學的理解,可用于明確基因功能以及鑒別新的癌癥基因和腫瘤生物標志物在食管癌的作用,提高對食管癌發(fā)病機制的認識[29]?；蚓庉嫾夹g可構建基因敲入和敲除以及條件/誘導動物模型[30-31]。本文主要闡述轉(zhuǎn)基因食管癌小鼠模型和基因敲除食管癌小鼠模型(表1)。

表1 化學誘導和基因工程改造的食管癌小鼠模型Table 1 Comparison of mouse models of esophageal cancer

3.1 轉(zhuǎn)基因食管癌小鼠模型

不同組織和細胞的特異性啟動子已被用于研究食管功能。皰疹病毒(EBV)的ED-L2啟動子在上皮細胞中表達,尤其在食管的基底層的分化細胞中更具活性。E D-L2在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中靶向細胞周期蛋白D1(CyclinD1),導致食管鱗狀細胞發(fā)育不良和食管的癌前病變[35]。此小鼠模型具有嚴重的不典型增生特點,其核細胞質(zhì)比例異常,導致口腔和食道發(fā)育異常,這是癌癥的重要前兆。與p53基因缺失的小鼠雜交的ED-L2/Cyclin D1小鼠發(fā)生食管鱗癌,其中約三分之一的小鼠發(fā)現(xiàn)淋巴結轉(zhuǎn)移[32]。Tetreault等[33]采用ED-L2啟動子在小鼠食管上皮細胞中過表達Krüppel樣因子4(Klf4)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,建立轉(zhuǎn)基因食管癌小鼠模型。該小鼠模型出現(xiàn)食管鱗狀上皮不典型增生和鱗狀細胞癌。除了轉(zhuǎn)基因ESCC小鼠模型,研究人員還開發(fā)了轉(zhuǎn)基因EAC小鼠模型。Quante等[34]構建ED-L2啟動子驅(qū)動的細胞因子1β(IL-1β)在食管過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠,發(fā)現(xiàn)IL-1β過表達的小鼠在6個月時出現(xiàn)中度炎癥,在12~15個月時出現(xiàn)巴雷特化生,到20~22個月時,小鼠會發(fā)展為高度不典型增生或食管腺癌。這些轉(zhuǎn)基因小鼠模型可以準確地概括人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)的遺傳改變,并研究相關基因與食管癌發(fā)生的相互作用。

3.2 基因敲除食管癌小鼠模型

Stairs等[35]使用ED-L2啟動子和條件性敲除p120-catenin基因的小鼠,在9~12個月時會導致食管、前胃和口腔發(fā)生不典型增生和浸潤性鱗狀細胞癌的形成。最早在L2Cre;p120ctnloxP/loxP小鼠4月齡時,即可發(fā)生食管癌浸潤。p120-catenin基因敲除小鼠模型概括了人類的ESCC特征,同時驗證了p120-catenin的抑癌作用。研究提示,該模型為食管和口腔鱗狀細胞癌早期診斷與治療策略提供新的動物模型。

4 其他

食管癌轉(zhuǎn)移動物模型報道數(shù)量有限。靜脈內(nèi)注射癌細胞是通常用于癌細胞進入遠端器官的造模方法。Wang等[36]通過小鼠尾靜脈注射1×106食管鱗癌KYSE150細胞建立食管癌肺轉(zhuǎn)移小鼠模型,發(fā)現(xiàn)注射腫瘤細胞35 d后出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。在肺轉(zhuǎn)移模型中,云南藤黃提取的天然化合物oblongifolin C能有效抑制肺轉(zhuǎn)移[36]。另一項研究將5×106YES-2食管鱗癌細胞腹腔注射SCID小鼠,導致食管鱗癌細胞在腹膜腔中定植并產(chǎn)生血性腹水,建立腹膜轉(zhuǎn)移小鼠模型[37]。該模型用于評價三萜類化合物和抗癌藥物的組合治療效果,結果表明三萜類化合物增強5-氟尿嘧啶對食管癌的化療作用。這些模型雖然不能模擬發(fā)生在患者上的完整轉(zhuǎn)移過程和可能掩蓋對轉(zhuǎn)移生物學的理解,但是可用于評價抗轉(zhuǎn)移中藥及其化學成分的驗證。

5 結論與展望

中醫(yī)藥對改善食管癌患者生存質(zhì)量,提高生存預后有較好的作用。食管癌小鼠模型對中醫(yī)理論的實踐和中藥抗食管癌的評價至關重要。比較分析食管癌小鼠模型特征發(fā)現(xiàn)(表2),誘發(fā)性食管癌小鼠模型能很好模擬人類食管癌發(fā)生和發(fā)展病理過程,是良好的食管癌及其癌前病變的誘發(fā)性食管癌模型,用于研究特定化學物對食管的致癌作用及多種中醫(yī)藥(化濁潤燥降氣方、六君子湯)抗食管癌及癌前病變的研究[13,38];移植性食管癌小鼠模型較好模擬食管癌的主要臨床特征,可用于研究食管癌生長和轉(zhuǎn)移研究以及為食管癌開發(fā)新的療法,為臨床實踐做出貢獻;基因工程食管癌小鼠模型可用于研究特定基因功能對食管癌的影響,以及食管癌發(fā)生的細胞與分子機制,有助于了解腫瘤生物學特性。移植性小鼠模型是腫瘤研究、開發(fā)和評價中醫(yī)藥抗腫瘤應用最多的動物模型[39-42]。皮下移植模型易操作、成瘤快和成功率高,但較少的轉(zhuǎn)移限制其應用;原位移植模型模擬食管癌體內(nèi)發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的過程,符合食管癌臨床實際。以上常見的食管癌小鼠模型各具特色,應根據(jù)實驗目的選擇合適的小鼠模型。最大化的發(fā)揮食管癌小鼠模型的潛力,多種模型相結合,更好地了解食管癌發(fā)病機理及中藥防治抗腫瘤的分子機制。隨著對食管癌研究的不斷深入和技術的進步,食管癌小鼠模型能更好的模擬人類患者食管癌,探索食管癌發(fā)病及中藥治療機制。為食管癌小鼠模型的開發(fā)及抗食管癌中藥的評價提供理論基礎和科學依據(jù)。

表2 食管癌小鼠模型Table 2 Mouse models of esophageal cancer