田全發(fā)鄭衛(wèi)華王子航李朋飛張俊晶

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科,呼和浩特 010030;2.山西省汾陽(yáng)醫(yī)院泌尿男科,山西 汾陽(yáng) 032200;3.呼和浩特市第一醫(yī)院肝膽外科,呼和浩特 010030)

正常肝由門靜脈和肝動(dòng)脈雙重血液供應(yīng)。將肝動(dòng)脈血保持不變,門靜脈血完全或部分被動(dòng)脈血替代灌注入肝稱之為肝雙重動(dòng)脈血供(liver double artery blood supply,LDABS)。此術(shù)式是門靜脈動(dòng)脈化的一個(gè)分支(portal vein arterialization,PVA),最早由Qiao等[1]提出。LDABS目前主要應(yīng)用于急性肝功能衰竭、原位肝移植以及輔助肝移植前后的門靜脈血栓形成等[2-4],已顯示較好的效果,且可維持肝功能和形態(tài)[5-7]。但LDABS畢竟改變了正常的生理解剖關(guān)系,特殊情況下應(yīng)用產(chǎn)生的良好效果是否說(shuō)明該技術(shù)可常規(guī)應(yīng)用于此類患者,需要臨床前的深入研究[8-9]。因此,建立適宜的動(dòng)物模型,對(duì)于解決上述問(wèn)題具有重要的意義。目前有關(guān)LDABS模型制備方法少有系統(tǒng)文獻(xiàn)闡述,尤其在模型中涉及血流控制、血管吻合等問(wèn)題更是讓研究者望而卻步。本研究旨在建立一種成熟穩(wěn)定、易于操作的LDABS動(dòng)物模型,在此基礎(chǔ)上,探討其理論應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6~8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠76只,體重300~330 g,購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(浙)2019-0001]。本課題組適應(yīng)性飼養(yǎng),無(wú)菌手術(shù)在上海懿貝瑞生物醫(yī)藥科技有限公司中心屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行[SYXK(滬)2017-0014],飼養(yǎng)環(huán)境:溫度21℃~24℃,濕度40%~50%,光照:12 h/12 h明暗交替,噪聲＜50 dB,IVC籠內(nèi)飼養(yǎng),自由飲食。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中按“3R”原則給予人道的關(guān)懷。手術(shù)顯微鏡(Leica M 525 F20)雙人配合完成,本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)倫理審查(YKD2015102)。

1.2 主要試劑與儀器

0.9%氯化鈉注射液,山東齊都藥業(yè)有限公司;碳酸氫鈉注射液,山西省芮城科龍獸藥有限公司;肝素鈉,上?；瘜W(xué)試劑廠;低分子肝素鈣,兆科藥業(yè)(合肥)有限公司;5%葡萄糖注射液,廣東圣戈生物科技有限公司;異氟烷,深圳市瑞沃德生命科技有限公司;注射用青霉素鈉,華北制藥股份有限公司;10-06-04-0縫合線,寧波醫(yī)用縫線有限公司;醫(yī)用紗布敷料,南昌市恩惠醫(yī)用衛(wèi)生材料有限公司;醫(yī)用棉簽,湖南永康醫(yī)療器械有限公司;M525F20萊卡顯微鏡,長(zhǎng)沙醫(yī)療器械廠;小動(dòng)物氣體麻醉呼吸機(jī),上海玉研科學(xué)儀器有限公司;顯微鑷、顯微血管夾,上海醫(yī)療器械(集團(tuán))有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

(1)100%O22~4 L/min混合異氟烷吸入麻醉,濃度3.5%~5%誘導(dǎo),1.5%~2.5%吸入維持。麻醉成功后取仰臥位,將大鼠四肢固定于自制固定板,術(shù)野常規(guī)脫毛消毒處理。采用腹正中切口,逐層進(jìn)腹,自制拉鉤暴露手術(shù)視野。

(2)血管夾阻斷門靜脈2 min,4-0線結(jié)扎肝左外葉及中葉,開(kāi)放門靜脈,可見(jiàn)剩余肝葉充血性改變(圖1A),沿結(jié)扎線切除肝左外葉、中葉(圖1B),可見(jiàn)殘腹腔(圖1C)。

(3)下腔靜脈下方作隧道放4-0線預(yù)防出血。剝除下腔靜脈與門靜脈外膜,分離右腎動(dòng)脈(圖1D),斜形半剪開(kāi)右腎動(dòng)脈(圖1E),插入聚乙烯管(管內(nèi)充滿肝素水,長(zhǎng)度23 mm,內(nèi)直徑0.5 mm)后再離斷右腎動(dòng)脈,6-0線固定管。

(4)將門靜脈骨骼化(圖1F),沖洗腹腔。顯微鑷夾閉門靜脈遠(yuǎn)端,調(diào)整脾靜脈端在顯微鑷最里側(cè),定為“0”點(diǎn)。斜形45°半剪開(kāi)門靜脈(圖2A),插入聚乙烯管另一端,6-0線綁定,再離斷門靜脈。門靜脈開(kāi)放過(guò)程不超過(guò)1 s。

圖1 肝雙重動(dòng)脈血供手術(shù)步驟Note.A,Results showed that the right lobe,papillary lobe and caudate lobe were congestive.B,Liver tissue removed.C,Abdominal cavity after partial hepatectomy.D,Separation of right renal artery.E,Catheterization of right renal artery.F,Skeletonization of portal vein.Figure 1 Operative steps for the liver arteral blood supply

(5)4-0線阻斷下腔靜脈兩端。顯微鑷尖端提起下腔靜脈,剪成魚(yú)口狀,修剪魚(yú)狀口直徑與門靜脈斜形斷端直徑大致相等,肝素水沖洗斷端。可將門靜脈近脾靜脈端、下腔靜脈近心端定為0點(diǎn),門靜脈遠(yuǎn)離脾靜脈端、下腔靜脈遠(yuǎn)心端定位為6點(diǎn)。“米”字形八個(gè)點(diǎn)使用找中點(diǎn)法按門靜脈定點(diǎn)9-10.5-7.5-6-0-3-1.5-4.5順序依次縫合(圖2B)。每一針按“血管外-里-里-外”用10-0線與相對(duì)應(yīng)點(diǎn)縫合,“0”“6”兩點(diǎn)拐角位置,采用拐角水平褥式縫合(圖2C)。拐角即血管吻合形成折角的位置。縫合最后一針前短暫開(kāi)放門靜脈使高凝血流出,再大量肝素水沖洗管腔,在肝素水里縫合最后一針。開(kāi)放下腔靜脈兩端及門靜脈,觀察吻合口是否漏血及狹窄(圖2D)。

(6)術(shù)畢檢驗(yàn)聚乙烯管是否通暢。一是觀察肝顏色判斷管是否通暢,如肝顏色鮮紅則通。如肝發(fā)黃或暗黃難判定時(shí),顯微鑷從遠(yuǎn)心端朝近心端夾閉并擼、刮聚乙烯管,人為制造小氣泡觀察管是否通暢(圖2E)。如通,小氣泡被快速推走,如不通,小氣泡在原處。

(7)觀察如無(wú)活動(dòng)性出血,6-0連續(xù)縫合肌肉層連同腹膜,4-0間斷縫合大鼠皮層,動(dòng)物模型成功。

3.3 入庫(kù)：徹底清潔后將機(jī)子開(kāi)進(jìn)機(jī)庫(kù)，無(wú)機(jī)庫(kù)的要加蓋防雨淋，日曬的簡(jiǎn)易棚，用塑料袋將柴油、機(jī)油的加油口、空濾器、排氣管口包扎，以防塵土進(jìn)入。

1.3.2 圍手術(shù)期處理

術(shù)前12 h禁食,不限飲水。術(shù)前1 h稱重,低分子肝素鈣100 U/kg皮下注射,阿托品0.03 mg/kg肌注,同時(shí)頸部皮下注射生理鹽水、5%葡萄糖及5%碳酸氫鈉共4 mL(比例3∶3∶1配置)。術(shù)中根據(jù)大鼠呼吸頻率判斷麻醉深度以便調(diào)節(jié)異氟烷濃度,術(shù)畢停止吸入麻醉藥,大鼠在術(shù)后4 min內(nèi)蘇醒,可翻身活動(dòng)。術(shù)后暖光照射1 h,自由進(jìn)水,術(shù)后第1天給食。術(shù)后前3 d青霉素肌注10000 U/100(g·d),皮下注射低分子肝素鈣100 u/kg,q12 h。

1.4 觀察內(nèi)容

記錄手術(shù)時(shí)間,計(jì)算造模成功率,觀察大鼠術(shù)后一般情況,包括毛發(fā)、色澤、尿液顏色、體重、肝體積變化及色澤改變。術(shù)后24 h采用Vero 2100超高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)(加拿大Visual Sonics)檢測(cè)大鼠門靜脈靜脈及吻合口血流情況。

2 結(jié)果

共納入76只大鼠,40只作為訓(xùn)練組,36只大鼠作為模型組。訓(xùn)練組動(dòng)物術(shù)中門靜脈出血3只,吻合口縫合完有滲血數(shù)量為10只;術(shù)后死亡尸檢出血8只,肺栓塞10只,肝壞死4只,腸壞死5只。模型組大鼠死亡4只,尸檢:肺栓塞2只,肝壞死1只,腸道壞死1只。模型組手術(shù)時(shí)間為(65.3±6.56)min,血管吻合時(shí)間(11.1±2.53)min。術(shù)中無(wú)明顯副損傷,出血量(0.6±0.21)mL,術(shù)后存活超過(guò)24 h標(biāo)志造模成功,成功率100%(36/36),相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生率為0%。大鼠術(shù)后能自由進(jìn)食水,警覺(jué),活動(dòng)如常,毛發(fā)光澤略暗。術(shù)后24 h尿液呈淡紅色,48~72 h后尿液顏色恢復(fù)正常色澤。術(shù)后24 h超聲檢測(cè)門靜脈血流(5.8±1.5)mL/(min·g)肝重(與原門靜脈血流量相似),吻合口血流通暢,無(wú)明顯狹窄。1周后造模成功率88.9%(32/36),相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生率為11.1%。1周后大鼠取材,剖腹探查發(fā)現(xiàn)肝呈鮮紅色色澤改變,肝體積飽滿及增大明顯,右腎實(shí)質(zhì)發(fā)黃萎縮,吻合口愈合良好,通暢無(wú)狹窄(圖2F)。

3 討論

3.1 手術(shù)操作技巧及改進(jìn)

此模型術(shù)式主要包括三個(gè)步驟:肝切除、門腔靜脈吻合及門靜脈動(dòng)脈化。70%肝切除是經(jīng)典肝再生研究模型,其手術(shù)技巧大多文獻(xiàn)談及[10]。此不再贅述,但得需注意以下問(wèn)題:在結(jié)扎肝葉前阻斷門靜脈2 min,可使血量丟失更少。結(jié)扎位置較深肝葉時(shí),避免撕扯、牽拉肝組織。打結(jié)時(shí)盡量靠近被切除的肝葉,避免結(jié)扎下腔靜脈。門靜脈動(dòng)脈化指將門靜脈改道,門靜脈遠(yuǎn)端注入下腔靜脈,近端引入右腎動(dòng)脈血。

血管吻合口漏血及狹窄是主要并發(fā)癥[11-13],這也是早期模擬訓(xùn)練需解決的主要問(wèn)題之一。因門靜脈及腔靜脈位置固定、內(nèi)徑小、壁薄、位置深,門腔吻合在技術(shù)上更具有挑戰(zhàn)性。吻合方式方法有多種,但至今沒(méi)有一個(gè)理想的方法可供借鑒,完美的微血管縫合技術(shù)應(yīng)具備吻合方式易操作、血管缺血時(shí)間短、血管壁損傷小及最佳的近遠(yuǎn)期通暢率等優(yōu)點(diǎn)。陳永亮等[14]運(yùn)用縫合的方式,將門靜脈端側(cè)與肝動(dòng)脈吻合,側(cè)側(cè)吻合連接下腔靜脈與門靜脈制作完全門靜脈動(dòng)脈化(CPVA)大鼠模型。此方法對(duì)于外科手術(shù)者操作要求較高且穩(wěn)定性較差,手術(shù)時(shí)間長(zhǎng),血液形成逆流,易致大量血栓形成,且創(chuàng)傷大。陳鵬等[15]通過(guò)切除左腎,利用同種異體材料作為套管,將左腎動(dòng)脈與原有門靜脈血共同匯入門靜脈制作門靜脈動(dòng)脈化,優(yōu)點(diǎn)是術(shù)式簡(jiǎn)單,手術(shù)時(shí)間短。但缺點(diǎn)也明顯:門靜脈屬支有發(fā)生回流受阻的可能,易形成免疫反應(yīng),術(shù)后隨時(shí)間推移發(fā)生血管扭轉(zhuǎn),引起狹窄的可能性較傳統(tǒng)術(shù)式高?；谖墨I(xiàn)和課題組前期的工作基礎(chǔ)[16-17],針對(duì)門腔靜脈解剖特點(diǎn),課題組再次對(duì)血管吻合進(jìn)行了改進(jìn)與創(chuàng)新。吻合口修剪為魚(yú)口狀,以脾靜脈匯合處作為參照,按照特定的順序進(jìn)行(圖2B),特定順序能夠在不必牽引血管情況下,保證外翻縫合。Qiao等[17]多采用定點(diǎn)縫合,反復(fù)牽引、調(diào)整位置用來(lái)保證外翻縫合,增加了血管壁損傷的概率,牽引張力不均勻亦出現(xiàn)針距的不均勻。而本研究提出的“米”吻合順序無(wú)需反復(fù)翻轉(zhuǎn)血管牽引縫合,可以避免上述情況發(fā)生。門腔靜脈吻合時(shí)需將系膜組織以及腸管整體向左側(cè)翻轉(zhuǎn),血管吻合時(shí)存在一定的張力,“米”順序吻合時(shí)“0”“6”兩點(diǎn)拐角位置尤為明顯,當(dāng)恢復(fù)正常解剖位置時(shí),容易滲、出血。前期訓(xùn)練組常規(guī)方法吻合拐角,有滲血數(shù)量為10只,需用壓迫3 min;術(shù)后出血死亡數(shù)為8只,尸檢發(fā)現(xiàn)大部分是因兩拐角出現(xiàn)問(wèn)題,這種現(xiàn)象與門腔靜脈血管解剖位置、吻合手法技巧有關(guān)。在此,筆者課題組創(chuàng)新性采用拐角兩點(diǎn)水平褥式縫合法,既有利于外翻縫合,又讓拐角結(jié)合處受力均勻,避免血管牽張力不均而形成漏,又使吻合口出血極少。36只模型組大鼠使用拐角兩點(diǎn)水平褥式縫合法后實(shí)現(xiàn)了術(shù)中吻合口出血極少,術(shù)后出血死亡數(shù)為零。但需注意水平褥式縫合時(shí)緣距及針距不可過(guò)大,否則易狹窄。

圖2 肝雙重動(dòng)脈血供手術(shù)步驟及手術(shù)技巧簡(jiǎn)圖Note.A,Oblique 45°half cut open-door vein.B,Oblique 45°cut open-door vein,the circle is the cross-section of blood vessel.The number in the tube wall represents the time of the clock and the number outside the tube wall indicates the suture sequence.C,Schematic diagram of portal vein anastomosis.a,Horizontal mattress suture at two points at the corner.D,Portal vena cava anastomosis(0 h).E,Unobstructed anastomosis(168 h).F,Artificially made small bubbles to observe whether the tube is unobstructed.Figure 2 Schematic diagram of the operative steps and surgicaltechnique for the liver dual arterial blood supply

門靜脈動(dòng)脈化時(shí),因動(dòng)脈壁厚且直徑小,靜脈壁薄且直徑大,如直接吻合并發(fā)癥多,且不易控制血流量。既往文獻(xiàn)研究證實(shí),門靜脈壓力過(guò)高過(guò)低都會(huì)抑制肝再生[18-20]。本研究借助內(nèi)徑0.5 mm聚乙烯管將右腎動(dòng)脈血液引入門靜脈,形成肝雙重動(dòng)脈血供。此管內(nèi)徑出血量與門靜脈原有血流量相似,且可避免血管吻合所帶來(lái)并發(fā)癥。門靜脈血流通暢是保證模型成功的基礎(chǔ),既往有文獻(xiàn)報(bào)道,門靜脈動(dòng)脈化后肝萎縮,考慮與門靜脈架橋血流不通暢有關(guān)[18]。架橋血管是否通暢,包含腎動(dòng)脈側(cè)因素、架橋血管因素以及門靜脈側(cè)因素。腎動(dòng)脈側(cè)需注意假道,腎動(dòng)脈插入聚乙烯管時(shí)易把動(dòng)脈內(nèi)膜或肌層強(qiáng)推到管徑內(nèi)人為造成堵塞。此時(shí)手法技巧很重要,本研究首次使用斜形半剪開(kāi)腎動(dòng)脈后,鑷子輕提腎動(dòng)脈斷端的全層,管旋轉(zhuǎn)插入可避免。

門靜脈側(cè)置管,是本研究的創(chuàng)新點(diǎn)之一,本研究首次提出利用自身牽引法,斜形45°半剪開(kāi)門靜脈方法(圖2A注意角度及位置)置管,然后離斷,避免了門靜脈回縮。45°斜切可使吻合口面積擴(kuò)大2倍,不至于產(chǎn)生吻合口狹窄。此外,還需觀察右腎動(dòng)脈血液流出情況?？梢远虝洪_(kāi)放右腎動(dòng)脈,如血流速度快,呈噴射狀,可以置入;如血流速度較慢,注意觀察右腎動(dòng)脈有無(wú)分支。如有,需結(jié)扎腎動(dòng)脈分支,否則會(huì)影響血流速度。操作過(guò)程中,保持肝素水不定時(shí)沖洗聚乙烯管管腔,防止血栓形成。

3.2 并發(fā)癥的預(yù)防

血管吻合前已述及,是模型制備的關(guān)鍵,而由血管吻合導(dǎo)致的并發(fā)癥發(fā)生率可以通過(guò)大量的模擬訓(xùn)練降低或避免。除此而外,其他并發(fā)癥亦影響模型制備的效果和成功率,如模型操作過(guò)程中臟器功能保護(hù)、麻醉護(hù)理等等。通過(guò)前期模擬操作后,造模組仍有4只大鼠死亡,其原因考慮如下。

3.2.1 出血

分術(shù)中出血及術(shù)后出血,術(shù)后出血在門腔靜脈吻合處已經(jīng)談及,此處不再贅述。術(shù)中出血多發(fā)生在門靜脈骨骼化過(guò)程中,由于門靜脈解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜,門靜脈下方緊貼肝固有動(dòng)脈,左側(cè)有脾動(dòng)靜脈分支,且無(wú)明顯分離界限,由纖維組織纏繞相連。因此,術(shù)中動(dòng)作盡量輕柔,必要時(shí)可用顯微剪刀剪斷纖維組織,不可強(qiáng)撕扯,易造成血管壁破裂。本組沒(méi)有術(shù)中出血導(dǎo)致的死亡,但術(shù)中出血影響術(shù)后存活。

3.2.2 肺栓塞

為最嚴(yán)重及最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。熟練顯微操作,縮短手術(shù)阻斷時(shí)間是關(guān)鍵因素之一,同時(shí)皮下注射低分子肝素鈣[21]。及時(shí)清理吻合口周圍微小雜物,縫合完畢前肝素水多次沖洗管腔。在吻合最后一針前,短暫開(kāi)放門靜脈釋放淤阻的高凝血液與血凝塊。通過(guò)改進(jìn),造模組此并發(fā)癥大大減少,但仍有2只動(dòng)物因此而死亡。

3.2.3 肝壞死

尸檢時(shí)發(fā)現(xiàn)肝土黃色改變,肝表面有散在出血點(diǎn)。前已述及,結(jié)扎肝蒂時(shí)線盡量靠近預(yù)切除的肝葉,同時(shí)注意不能結(jié)扎了肝葉后方的下腔靜脈。本組有1例動(dòng)物肝壞死死亡,考慮與此有關(guān)。

3.2.4 腸道壞死

避免腸管長(zhǎng)時(shí)間受到壓力,暴露視野時(shí),可暫將腸道置于腹腔外。每隔3 min暴露的腸管上滴加生理鹽水,腸管放回原位時(shí),采用棉簽輕撥、動(dòng)作輕柔,避免腸道折疊甚至打結(jié)造成腸梗阻。吻合口狹窄、血栓形成也是腸道壞死的重要原因,術(shù)后第1天內(nèi)禁食,可預(yù)防急性胃腸擴(kuò)張。通過(guò)模擬訓(xùn)練,此種情況在后期較為少見(jiàn)。

3.2.5 感染

由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境在相對(duì)無(wú)菌條件下進(jìn)行,加之術(shù)中及術(shù)后3 d常規(guī)應(yīng)用青霉素肌注,同時(shí)注意術(shù)中嚴(yán)格按照無(wú)菌操作進(jìn)行。本組大鼠均未因感染而死亡。

圍術(shù)期護(hù)理方面:(1)吸入性麻醉劑異氟烷在肝代謝率低,肝毒性小,對(duì)胃腸道機(jī)能影響小,是理想的麻醉劑[22]。術(shù)中麻醉劑攝入值越小,副作用越小。當(dāng)術(shù)中調(diào)整至濃度1.5%甚至更低時(shí),此時(shí)應(yīng)密切注意大鼠呼吸頻率及幅度。當(dāng)在大鼠出現(xiàn)首次驚厥,或呼吸頻率急促,表示大鼠即將蘇醒,說(shuō)明給的劑量低,大鼠會(huì)在3~5 min內(nèi)恢復(fù)意識(shí)。需立即調(diào)高流量0.3%~0.5%劑量。(2)術(shù)前肌注阿托品,可減少呼吸道分泌物、防止窒息等并發(fā)癥。(3)因門腔靜脈吻合時(shí)需阻斷門靜脈、下腔靜脈血液回流,時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易致缺氧性酸中毒,適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充碳酸氫鈉則可改善腸道缺血缺氧再灌注損傷形成的酸中毒。(4)皮下注射低分子肝素鈣可預(yù)防長(zhǎng)時(shí)間血流阻斷,細(xì)小血凝塊析出致肺栓塞發(fā)生的幾率。(5)術(shù)后24 h內(nèi)需禁食,進(jìn)食可能因手術(shù)、麻醉等致胃腸蠕動(dòng)功能降低,有可能導(dǎo)致急性胃腸擴(kuò)張,必要時(shí)可行胃插管進(jìn)行胃腸減壓對(duì)癥治療,可建議給予頸部皮下注射生理鹽水、5%葡萄糖及5%碳酸氫鈉共4 mL(比例3∶3∶1配置)進(jìn)行基礎(chǔ)能量補(bǔ)充。術(shù)后第1天再給予鼠糧進(jìn)食。

綜上所述,多種因素都能影響LDABS動(dòng)物模型的存活。因此,必須重視操作中所有細(xì)節(jié)。熟練進(jìn)行顯微外科操作,精準(zhǔn)手術(shù)是縮短操作過(guò)程及減少手術(shù)并發(fā)癥的前提;良好的麻醉控制,穩(wěn)定的血流動(dòng)力學(xué)及術(shù)后圍手術(shù)期精心護(hù)理等才能夠使手術(shù)成功率大大提高。