蘇偉怡，劉星，郝琪，郭攀，郝紅勛，李春利

（1河北工業(yè)大學化工學院，化工節(jié)能過程集成與資源利用國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 300130；2天津大學化工學院，天津 300072）

藥物多晶型是指同一物質具有兩種或兩種以上空間排列形式[1-2]。同一藥物不同晶型在溶解度、溶出速率等方面的差異會直接影響藥物療效。所以，藥物多晶型質量控制對保證藥品的穩(wěn)定性、安全性和有效性具有重要意義[3-5]。多晶型溶液結晶過程受很多因素的影響[6-11]，Kitamura[12-13]根據(jù)作用效果將其分為兩大類：主要因素包括過飽和度、溫度、攪拌速率、反應物的混合速度和晶種的加入；次要因素包括溶劑、添加劑、界面和pH等。

氨基酸是構成多肽和蛋白質的基礎物質，對生命的健康和生理平衡具有重要意義[14-15]，且普遍存在多晶型現(xiàn)象。其中，甘氨酸在水溶液中直接結晶可得到介穩(wěn)α晶型[16]，不易得到β和γ晶型。L-組氨酸純水溶液冷卻結晶僅可得到晶型A和B的混晶[17]。而L-谷氨酸的β晶型呈薄片狀，離心時易斷，過濾時易阻塞，所以工業(yè)上更傾向于得到流動性更強的介穩(wěn)α晶型，但在水溶液中β晶型極易在α晶型表面成核，從而加快α晶型向β晶型的轉化，因此不易得到純凈α晶型[18-19]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，合適的添加劑能有效調控多晶型結晶[10]，比如NaCl能促進甘氨酸γ晶型的成核[16]；溶液中加入甲醇、乙醇等有機溶劑能得到甘氨酸的β晶型[8]。因此，本文主要以上述三種氨基酸的溶液結晶過程為例，對不同添加劑的作用方式及機理進行綜述，以期為該類產品的生產控制提供參考。

1 電解質添加劑

電解質是以離子鍵或極性共價鍵結合的物質，溶于水中或在熔融狀態(tài)下能夠解離成自由移動的離子。氨基酸中有酸性中心和堿性中心，易受帶電基團或離子的影響，通常加入電解質后，能改變氨基酸帶電離子之間的連接方式，從而改變氨基酸的成核和生長過程。這里分別討論了無機酸和堿、無機鹽作添加劑對氨基酸不同晶型成核和生長的影響，最后從電荷補償?shù)慕嵌冉忉屃穗娊赓|影響成核和生長的機理。

1.1 無機酸和堿

在純水溶液中，氨基酸兩性離子以特定的方式結合、聚集，但加入酸或堿后，兩性離子變成氨基酸的陽離子或陰離子，因此之前的聚集體被破壞，從而可能對各晶型的成核和生長過程造成不同影響，下面將從成核和生長兩方面進行分析。

從影響成核的角度，無機酸或堿的加入可以影響溶液的pH，這對氨基酸類物質的成核有直接的影響。如Towler等[21]發(fā)現(xiàn)，在甘氨酸的溶液結晶中，當pH接近甘氨酸的等電點（pI=5.97）時得到α晶型；當加入酸或堿（氨、硫酸或乙酸）后，pH高于8.9或者低于3.8時能夠得到γ晶型。Han等[20]發(fā)現(xiàn)，溶液中酸堿（HCl、HNO3、NaOH、KOH）濃度很低時，α晶型因成核速率稍有增加而成為優(yōu)勢產品；但是，當酸堿的摩爾濃度大于0.5mol/kg時，γ晶型成核的介穩(wěn)區(qū)寬度變窄，因此只得到γ晶型。在水溶液中，甘氨酸分子中的羧基將質子轉移到氨基上形成甘氨酸兩性離子，這些兩性離子相互作用形成的環(huán)狀二聚體[圖1(a)]與α晶型內分子排列方式相似，因此更易形成α晶型。而加入酸或堿后，分別形成了甘氨酸陽離子（+H3NCH2COOH）和甘氨酸陰離子（H2NCH2COO-），這些離子可與溶液中的甘氨酸兩性離子結合形成與甘氨酸γ晶型結構類似的頭尾連接的開口二聚體[圖1(b)]，從而可以促進γ晶型的成核。

圖1 甘氨酸二聚體

圖2 甘氨酸晶體簡單結構

1.2 無機鹽

無機鹽由陰離子和陽離子構成，其對氨基酸多晶型溶液結晶過程的影響方式與酸堿相似，但是不同的是無機鹽陰陽離子的價態(tài)、組成都會對成核、生長及轉晶過程有不同的影響。

Han等[30]研 究 了 不 同 無 機 鹽[NaCl、KNO3、(NH4)2SO4、MgSO4、Ca(NO3)2]對甘氨酸α晶型向γ晶型轉變過程的影響，發(fā)現(xiàn)大部分鹽可大大縮短α晶型向γ晶型轉變的時間，但是因為鹽種類的不同，其影響程度又有所不同。Han等[31]通過測量甘氨酸α晶型和γ晶型單晶的生長速率，研究了一價陽離子 鹽[NaCl、Na2CO3、Na2SO4、KCl、KNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4]和 二 價 陽 離 子 鹽[MgSO4、Ca(NO3)2、Mg(NO3)2]對兩種晶型生長的影響，發(fā)現(xiàn)一價陽離子鹽能抑制兩種晶型c軸方向的生長，但同時又促進兩種晶型b軸方向的生長。而三種二價陽離子鹽都明顯地抑制了γ晶型的生長，但是對α晶型b軸方向生長的影響并不明顯，因此二價陽離子鹽存在時均得到α晶型。

Duff等[32]計算了NaCl對甘氨酸α晶型和γ晶型結晶過程界面能的影響，發(fā)現(xiàn)當NaCl濃度為80mg/mL時，γ-甘氨酸界面能降低7.7mJ/m2，而α晶核界面能則增大3.1mJ/m2。這進一步驗證了NaCl對γ晶型結晶的促進作用。由此可見，通過溶液中的分子模擬和計算可以解釋或者預判添加劑對氨基酸多晶型成核、生長的影響。這也成為添加劑分子設計及篩選的有效方式之一。

無論是無機酸、堿還是無機鹽，都是通過電荷的作用影響氨基酸的成核或生長。2013年，Renuka Devi等[33]首次通過電荷補償機制揭示了水溶液中α-甘氨酸和γ-甘氨酸的成核行為。電荷補償方式可分為兩種類型：一種類型是甘氨酸兩性離子通過自電荷補償構成環(huán)狀二聚體，有利于α晶型的成核；另一種類型是兩性離子通過側向氫鍵堆疊形成鏈狀結構，有利于γ晶型成核，但是只在誘導電荷補償劑（induced charge compensators，ICC）存在的條件下發(fā)生。ICC存在時，甘氨酸電荷補償類型從自電荷補償轉變?yōu)檎T導電荷補償。比如當乙酸鈉（CH3COONa）[34]、硝酸銨（NH4NO3）或氫氧化鈉（NaOH）[34]存在并且超過臨界濃度時，甘氨酸兩性離子的自電荷補償被抑制，最終形成γ多晶型。在乙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸和L-蘋果酸等誘導電荷補償劑存在時，緩慢蒸發(fā)水溶液同樣可以獲得γ-甘氨酸[35]。Renuka Devi等[36]也已證明在丙二酸存在且超過臨界濃度時，甘氨酸團簇整體呈陽離子化，因此最終得到純的γ晶型。所以在一定程度上，從電荷補償?shù)慕嵌瓤梢越y(tǒng)一解釋無機酸、堿、鹽對甘氨酸成核和生長的影響。

2 tailor-made添加劑

1997年，Liu[37]提出了設計定制（tailor-made）添加劑的概念，這些添加劑結構通常類似于宿主分子，因此可以影響晶體成核及生長過程。為控制多晶型而設計的tailor-made添加劑可分為兩類：抑制劑和促進劑[38]。Dowling等[39]提到的立體定向抑制劑就是一種tailor-made抑制劑，它由兩個部分組成：結合劑，用于黏附在晶體的表面；干擾劑，用于抑制分子的沉積。tailor-made添加劑用于產生特定的晶型或抑制不良晶型的生長已被證明是非常成功的策略，在晶體形態(tài)工程和多晶型控制領域有重要應用[40-41]。

2.1 tailor-made添加劑對結晶過程的影響

tailor-made添加劑具有與宿主分子相似的結構，當宿主分子形成晶核時，這些添加劑可能摻入宿主分子中，或者摻雜進已經形成的晶核內，影響成核。Dhanasekaran等研究了緩慢蒸發(fā)結晶過程中L-苯丙氨酸[42]和L-酪氨酸[43]對L-谷氨酸多晶型成核的影響。發(fā)現(xiàn)與純水溶液中僅得到β晶型不同，當添加劑L-苯丙氨酸的濃度在0.03～0.07g/100mL、L-酪氨酸的濃度在0.01～0.07g/100mL范圍內時，僅出現(xiàn)α晶型；L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的濃度超過0.07g/100mL時，溶液中的成核被完全抑制，α晶型和β晶型晶體均未出現(xiàn)。一般認為這兩種添加劑的影響機理如圖3所示，當溶液中沒有其他分子時，溶質分子可在過飽和溶液中形成(α)n和(β)n兩種晶核，最終穩(wěn)定的β晶型在系統(tǒng)中占主導；但如果在適當?shù)臅r間向溶液中添加可抑制β晶型成核的添加劑，它將選擇性地摻雜到β晶核中，阻礙(β)n的形成，最終則會得到亞穩(wěn)態(tài)α晶型[44]。更高濃度的添加劑阻止成核的原因可能是添加劑分子完全阻止宿主分子的聚集，(α)n和(β)n晶核均難以形成。與此類似，隨著添加劑L-苯丙氨酸和L-蛋氨酸濃度的增加，甘氨酸α晶型和β晶型的成核被抑制，最終可得到γ晶型[24]；DL-蛋氨酸冷卻結晶時，得到α晶型和β晶型的混合晶型，當加入一定量的DL-亮氨酸后，得到純凈的α晶型[45]；在γ-氨基丁酸的冷卻結晶中，不存在添加劑時得到的晶體為晶型Ⅰ，當加入一定的乙酸鈉、苯甲酸鈉、庚酸鈉、環(huán)己甲酸鈉則能得到純凈的晶型Ⅱ[46]。

圖3 添加劑控制L-谷氨酸多晶型的原理[45]

晶體不同晶面裸露不同的基團，tailor-made添加劑分子可能選擇性地吸附在晶體的某一表面上，阻止溶質分子在此晶面的堆積，從而導致晶體的形貌發(fā)生變化。Kitamura等[47]研究了L-苯丙氨酸對L-谷氨酸α晶型和β晶型生長動力學的影響，發(fā)現(xiàn)在純水溶液中，對于β晶型，不易觀察到β晶體(001)和(010)晶面的生長，而(101)面的生長速率則與時間呈指數(shù)關系，如圖4(a)所示。加入L-苯丙氨酸后，β晶型(101)面的生長速率減小，與時間的關系變?yōu)榫€性；L-苯丙氨酸濃度超過3.9×10-4mol/L時，生長速率變得不規(guī)則，(101)面甚至可能分叉，見圖4(b)；當L-苯丙氨酸的濃度增加到7.7×10-4mol/L時，生長停止。而對于α-L-谷氨酸，其結構如圖4(c)所示，在水溶液中A1、A2、A3和D1方向生長速率與時間呈線性關系；當L-苯丙氨酸濃度超過5.2×10-3mol/L時，D方向上的生長速率沒有明顯變化，但A方向上的生長速率顯著降低，最終(011)面消失，出現(xiàn)新的(110)面，如圖4(d)所示。同樣的晶體形態(tài)變化Cashell等[19]也提到過。

圖4 L-谷氨酸晶體結構[47]

Kitamura進一步分析了α-L-谷氨酸的晶面特征，指出(001)表面裸露羧酸基團，其與L-苯丙氨酸相互排斥，因此該晶面的生長不受影響；但是(110)、(111)和(011)面上卻可以吸附L-苯丙氨酸從而使生長被抑制。此外，Yani等[48]通過計算不同添加劑分子在晶體表面的均方位移，指出添加劑的分子在晶體表面的流動性是影響生長過程的關鍵參數(shù)。如Yang等[49-50]計算了L-纈氨酸分子在L-丙氨酸(011)面和(120)面的吸附能，發(fā)現(xiàn)其與(011)表面結合能較小，添加劑分子流動性較好，因此對(011)面的生長沒有明顯影響；但其在(120)表面上可強烈吸附，流動性較差，因此可通過排斥L-丙氨酸分子擾亂晶體的規(guī)則排列，從而強烈抑制(120)面的生長，最終使L-丙氨酸晶體形貌發(fā)生明顯的變化。與此相似，Torbeev等[24]發(fā)現(xiàn)在甘氨酸多晶型的溶液結晶過程中，當水溶液中存在較高質量分數(shù)的絲氨酸、賴氨酸、組氨酸和谷氨酸時，最終得到的α晶型與純水溶液中得到的α晶型形貌有明顯的差別；DL-蛋氨酸α晶體在DL-亮氨酸存在時，b軸和c軸方向的生長被抑制，只有a軸方向延長，形貌發(fā)生明顯改變[45]。

綜上所述，因為不同晶面裸露的官能團可能不同，tailor-made添加劑分子在晶面上的吸附作用明顯不同。吸附能較大的面生長被抑制，吸附能小的面生長速率變化較小，最終晶體形貌可能發(fā)生明顯變化。由于添加劑分子和溶質分子的作用，不同晶型的成核和生長過程也可能受到不同的影響。

2.2 添加劑結構的影響規(guī)律

tailor-made添加劑的設計通常參考宿主分子，而分子結構或官能團的微小變化可能對多晶型結晶及轉化過程產生不同的影響。

Davey等[55]首次利用分子構象選擇添加劑，發(fā)現(xiàn)與L-谷氨酸β晶型晶體中分子構象更相似的二甲基戊二酸能抑制β晶型的二次成核，因此最終得到了亞穩(wěn)的α-L-谷氨酸。Cashell等[56]研究了多種氨基酸添加劑對L-谷氨酸α晶型向β晶型轉變速率的影響，發(fā)現(xiàn)大部分氨基酸可抑制該轉晶過程，但結構不同的氨基酸作用效果不同，按抑制效果由強到弱排列，大致如圖5所示。由于L-酪氨酸具有較大的酚基，L-苯丙氨酸中的苯基也較大，所以兩者較其他氨基酸對轉晶的抑制作用更明顯，且由于前者比后者多一個羥基，作用更強。而L-賴氨酸和L-精氨酸結構相似，在濃度1×10-2mol/L及以上時作用效果相似。L-天冬氨酸有兩個羧基，且它更類似于L-谷氨酸的分子結構，容易吸附在L-谷氨酸晶體表面上，因此抑制作用相對較強。L-絲氨酸的結構比以上氨基酸添加劑的結構簡單，所以即使在濃度達到5×10-2mol/L時，也只能穩(wěn)定部分α晶型。雖然L-半胱氨酸比L-絲氨酸少一個羥基，但是多出一個巰基，抑制效果比L-絲氨酸好。但是任何濃度的L-蛋氨酸都不能穩(wěn)定L-谷氨酸的α晶型晶體。

圖5 不同結構氨基酸添加劑抑制L-谷氨酸轉晶效果排序（①～⑧為由強到弱）

在此基礎上，Mo等[57]使用其他氨基酸調控L-谷氨酸的α晶型向β晶型的轉化過程，同樣發(fā)現(xiàn)這些添加劑能阻止α晶型向β晶型的轉變，抑制能力強弱的順序為：L-色氨酸>L-組氨酸>L-蘇氨酸>L-纈氨酸>L-亮氨酸>L-丙氨酸。作用效果同樣與其分子結構復雜程度一致。

從Davey等[55]、Cashell等[56]、Mo等[57]及Dowling等[39]的研究可知，不同結構添加劑分子對轉晶過程的影響因結構的不同而不同。與晶體分子結構越相似，阻礙作用越明顯；添加劑結構越復雜，對轉晶的抑制作用越強。因此可推測tailor-made添加劑可通過結合劑（羧基、氨基）吸附到晶體表面，同時干擾劑（苯基、酚基、甲基等）占據(jù)晶體表面較大的空間，可阻礙宿主分子在晶體表面的堆積，從而阻礙新晶型的形成，表現(xiàn)為對轉晶過程的抑制。Kelleher等[58]使用5-氨基間苯二甲酸、5-氨基間苯二甲酸三聚體、5-氨基間苯二甲酸四聚體和5-氨基間苯二甲酸五聚體作為L-谷氨酸結晶的添加劑，結果表明，以上添加劑均可抑制β晶型，從而最終可得到α晶型，但是聚合物的效率要比單體高100～1000倍，進一步證明具有復雜分子結構的添加劑對轉晶的抑制作用更強。

但是與以上氨基酸添加劑的作用不同， L-甘氨酸作為最小的氨基酸分子，卻可以促進 L-谷氨酸β-晶型的成核，并且能加快α晶型向β晶型的轉化[59]。此外，Dowling等[39]發(fā)現(xiàn)甘氨酸的濃度越高，β晶型的成核和生長速率就越高，且谷氨酸β晶型在α晶型表面的二次成核越容易，因此可能導致轉晶越快。該影響可能與甘氨酸的結構最簡單有關。

綜上所述，結構簡單的甘氨酸能促進L-谷氨酸轉晶，得到穩(wěn)定晶型；結構復雜的氨基酸添加劑能夠抑制L-谷氨酸轉晶，且結構越復雜對轉晶的阻礙作用越明顯。羧酸鹽添加劑的官能團數(shù)量及R基團的親疏水性對其誘導γ-氨基丁酸晶型Ⅱ成核能力有明顯的影響，所以在設計用于控制氨基酸多晶型結晶過程的添加劑分子時，官能團的結構及R基團的親疏水性應該是重點考慮的內容。

3 混合溶劑對氨基酸多晶型結晶過程的影響

通過改變或混合不同溶劑，可促進或抑制某些晶型的形成，其作用機理與添加劑有一定相似之處[44]。此外，溶析結晶具有操作簡單、能耗相對較低、適用于熱敏性物質的優(yōu)勢，已廣泛應用于工業(yè)過程[60]。由于氨基酸大多易溶于水，不易溶于有機溶劑，因此常采用有機溶劑作溶析劑控制不同晶型的產生。如Punmalee等[61]發(fā)現(xiàn)，L-組氨酸在二元溶劑混合物中的溶解度順序為：（水-乙腈）>（水-丙酮）>（水-甲醇）。這表明與乙腈和丙酮相比，甲醇是L-組氨酸的最佳溶析劑。同時發(fā)現(xiàn)在溶析劑體積分數(shù)較低時，可得到L-組氨酸A和B晶型的混合物；而高溶析劑體積分數(shù)則可得到純凈的B晶型。Roelands等[62]通過控制溶析劑乙醇的用量控制溶液的過飽和度，發(fā)現(xiàn)當過飽和度比SA≤2.0時，可得到A晶型和B晶型的混晶；而當SA≥2.3時，可獲得純凈的B晶型。

Weissbuch等[8]的研究表明，在甘氨酸水溶液中，直接結晶可得到α晶型，而當加入甲醇或者乙醇后，β晶型則率先從溶液中析出。β晶型由單個分子通過氫鍵連接而成，而非環(huán)狀二聚體。甲醇或者乙醇的加入使得甘氨酸的溶解度降低，導致溶劑化甘氨酸分子單體濃度相對于氫鍵連接的環(huán)狀二聚體濃度增加，所以一定程度上促進了β晶型成核。從生長動力學的角度，一方面，溶劑化甘氨酸分子可通過N—H結合到極性晶面，類似Towler等[21]提出的self-poison理論，而β晶型只有一個小極性面，所以甘氨酸分子對其生長的抑制作用較弱，因此最終得到的晶體主要為β晶型。另一方面，當溶劑化甘氨酸分子結合到α晶型的極性表面，可阻止環(huán)狀二聚體在該表面的堆積，表現(xiàn)為抑制其生長，而非極性表面則繼續(xù)生長，這將導致在水-醇溶液中得到的α晶體非極性方向尺寸增加，與水溶液中的晶體形態(tài)明顯不同。此外，對γ晶型在醇-水溶液中生長的研究表明，乙醇和水分子在γ晶型晶體表面上的吸附作用較強，難以去掉，所以完全抑制了其生長，從側面說明了在醇-水溶液中不易得到γ晶型的原因。

綜上所述，從成核的角度考慮，不同組成的溶劑能影響溶液中分子聚集體的比例，因此傾向于得到不同晶型的晶核。從生長的角度考慮，晶體的生長速率和晶面上溶劑分子的脫落速度有關，而溶劑分子在不同晶型的不同晶面上吸附作用不同，最終可選擇性得到特定的晶型。因此，在調控氨基酸多晶型溶液結晶時，改變溶劑也是有效的方法之一。

4 結語

酸、堿、無機鹽、溶劑組成、tailor-made添加劑、聚合物等均能有效影響氨基酸多晶型溶液結晶過程。

（1）酸、堿、無機鹽等電解質添加劑能影響氨基酸的電荷結構，如可破壞甘氨酸分子的環(huán)狀二聚體，抑制α晶型成核，促進鏈狀二聚體的形成，從而促進γ晶型的成核。一價陽離子和二價酸根離子能促進晶體生長，而二價陽離子的抑制作用更明顯。從電荷補償?shù)慕嵌?，電解質能破壞甘氨酸分子的自電荷補償，破壞甘氨酸環(huán)狀二聚體，形成開口二聚體促進γ晶型的成核。

（2）tailor-made添加劑與宿主分子結構相似，在L-谷氨酸、DL-蛋氨酸等溶液結晶過程中，tailor-made添加劑不僅能影響多聚體的形成，而且能摻入晶核中，最終影響成核。添加劑通過選擇性地吸附在某一晶型的晶面上，可阻礙相應晶型的生長或向其轉晶的過程。此外，tailor-made添加劑的結構越復雜，抑制轉晶的作用越明顯，同時官能團種類及數(shù)量、側鏈基團的親水和疏水性都能影響添加劑的作用。

（3）甲醇、乙醇等有機溶劑加入氨基酸水溶液中，可以改變溶液中甘氨酸、組氨酸不同類型分子聚集體的數(shù)量，從而影響成核；溶劑分子在晶體表面的脫落速度是影響特定晶體生長的重要因素。

雖然對添加劑調控氨基酸多晶型溶液結晶的研究取得了顯著的成果，但是仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)。如：甘氨酸多晶型結晶過程中堿如何影響成核和生長；作為tailor-made添加劑，甘氨酸如何促進多晶型轉變等。隨著科技的發(fā)展，各種分子模擬技術已經成功應用到結晶領域，定量計算添加劑對結晶過程中分子聚集體、生長界面的影響或許能進一步解釋其對不同晶型成核和生長的影響規(guī)律，幫助研究者設計出更高效的添加劑分子，在未來取得更多的研究結果。