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        人胸腺基質(zhì)發(fā)育及退化的單細胞轉(zhuǎn)錄組分析

        2021-08-21 07:28:06李雨晨白麗蓮黃荷鳳劉欣梅
        關(guān)鍵詞:嬰兒期發(fā)育階段胸腺

        李雨晨,白麗蓮,黃荷鳳,劉欣梅

        上海交通大學醫(yī)學院附屬國際和平婦幼保健院婦產(chǎn)科,上海市胚胎源性疾病重點實驗室,上海 200030

        胸腺是建立適應(yīng)性免疫及自身免疫耐受的關(guān)鍵器官。T細胞在胸腺內(nèi)的分化有賴于以胸腺上皮細胞(thymic epithelial cell,TEC)、成纖維細胞(fibroblast,F(xiàn)b)和樹突狀細胞(dendritic cell,DC)等為代表的胸腺基質(zhì)細胞形成功能健全的微環(huán)境[1]。在胸腺內(nèi),分化中的T細胞在TEC誘導(dǎo)下完成T細胞受體(T cell receptor,TCR)基因重排形成TCR組庫,并識別由TEC和DC等抗原提呈細胞(antigen-presenting cells,APC)通過主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex,MHC)提呈的自身抗原肽,作出適當強度的免疫反應(yīng),完成陽性選擇和陰性選擇,獲得成熟的免疫反應(yīng)功能,并清除自身反應(yīng)性T細胞,建立免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)[2]。

        人類胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)TEC分化大約始于胚胎第8周,10~12周時皮、髓質(zhì)分界逐漸清晰;12~15周時,胸腺淋巴細胞數(shù)量達到高峰,T細胞在趨化因子作用下向外周淋巴組織遷移[3]。胸腺的體積于青春期達到高峰,并在成年后逐漸退化[4]。了解胸腺的發(fā)育和退化,對于研究機體免疫穩(wěn)態(tài)的維持、自身免疫疾病的發(fā)生規(guī)律和免疫功能重建等方面均有重要意義[5]。

        由于正常人類胸腺樣本不易獲取,過去對胸腺發(fā)育和退化的研究主要來自小鼠等模式生物,并且通常局限于整個組織水平或分選的特定細胞類型[6-7]。近年來,單細胞RNA測序(single-cell RNA-sequencing,scRNA-seq)技術(shù)的發(fā)展使得我們能從少量組織樣本中獲得單細胞分辨率的轉(zhuǎn)錄組圖譜,以揭示生物學過程中的細胞異質(zhì)性[8-10]。盡管目前已有針對人類胸腺的scRNA-seq研究發(fā)表,且覆蓋了從胚胎至成年的各個生命時期,但這些研究傾向于將來自不同發(fā)育時間點的樣本進行整合分析,而忽略了由發(fā)育階段變化造成的生物學差異[11-12]。

        為了探索人類胸腺基質(zhì)細胞在不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄動態(tài),我們利用ArrayExpress數(shù)據(jù)庫中的人類胸腺單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(E-MATB-8581)[12]進行生物信息學分析。根據(jù)樣本來源的孕周(post-conception weeks,PCW)和出生后年齡將其劃分為胚胎期、嬰兒期和成人期,分析不同類型的基質(zhì)細胞在各個發(fā)育階段的基因表達差異,并結(jié)合富集分析推測潛在的功能變化。

        1 資料與方法

        1.1 單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)準備

        從zenodo數(shù)據(jù)庫下載DOI編號為10.5281/zenodo.3572422的E-MATB-8581[12]的“細胞-基因”表達矩陣,根據(jù)原數(shù)據(jù)提供的細胞類型注釋,選取了DC細胞、TEC細胞、內(nèi)皮細胞(endothelial cell,Endo)和Fb細胞等亞群進行后續(xù)分析。該公共數(shù)據(jù)代表的胸腺樣本來自人類胚胎期(孕7~17周)、嬰兒期(3、6、10、15、30月齡)及成人期(13~35歲),包含的生命階段較完整,符合本研究的需要。

        1.2 細胞分群

        主要使用R語言Seurat對軟件包表達矩陣進行分析[13]。保留符合以下條件的細胞數(shù)據(jù):①檢測到基因數(shù)>500。②檢測到轉(zhuǎn)錄本數(shù)>2 000。通過Log-Normalize方法,設(shè)置10 000為放縮因子,對轉(zhuǎn)錄本計數(shù)進行歸一化。使用R語言RSCORE軟件包[14],參考蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)數(shù)據(jù)庫BioGRID(4.2.192)[15],對10 000個高可變基因構(gòu)建加權(quán)的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò),并根據(jù)相關(guān)性將多個基因模塊化,最終每個細胞的基因表達信息被轉(zhuǎn)換為基因模塊的評分值?;谠摗凹毎?模塊”矩陣進行主成分分析(principal components analysis,PCA)降維。根據(jù)碎石圖選取前25個主成分(principal components,PC),使用統(tǒng)一流形逼近與投影(uniform manifold approximation and projection,UMAP)進行非線性降維,在二維平面反映細胞間的相似程度[16]。

        1.3 差異表達分析

        對同一細胞亞型,以不同發(fā)育階段作為分組變量,使用Wilcoxon秩和檢驗鑒定各個時間點的差異表達基因。為了減少樣本間批次效應(yīng)的影響,將發(fā)育軌跡劃分為7~8孕周組(07-08PCW)、9~11孕周組(09-11PCW)、12~15孕周組(12-15PCW)、16~17孕周組(16-17PCW)、嬰兒期組(Infant)和成人期組(Adult)。使用Bonferroni校正法進行多重檢驗校正,修正后P值<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。選取各個階段中差異表達滿足|log2FC|>0.5的基因用于基因本體論(Gene Ontology,GO)功能分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome,KEGG)通路富集分析。

        1.4 GO功能及KEGG通路富集分析

        使用R語言clusterProfiler軟件包對各個階段富集表達的差異基因進行GO功能注釋和KEGG通路富集分析[17]。使用Benjamini-Hochberg校正法校正多重檢驗P值,修正后P值<0.05時認為富集分析結(jié)果有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 人胸腺基質(zhì)細胞的分群

        基于UMAP結(jié)果,幾種主要基質(zhì)細胞在二維平面上能相互區(qū)分(圖1A)。我們根據(jù)經(jīng)典的細胞亞型標記基因驗證了分群的可靠性(圖1B)。TEC高表達泛上皮細胞標記基因EPCAM和TEC標記基因FOXN1[3],其中皮質(zhì)TEC(cortical TEC,cTEC)表達PSMB11。DC的亞群分別高表達DC1標記基因CLEC9A、DC2標記基因CLEC10A和活化DC(activated DC,aDC)標記基因LAMP3[18]。Endo高表達標記基因CDH5[19]。Fb則高表達PDGFRA和COLEC11,以及2型Fb標記基因FBN1[20]。

        圖1 人類胸腺基質(zhì)細胞的UMAP分群圖Fig 1 UMAPplots of human thymic stromacells

        Fb主要來自胚胎階段和成人階段,并依據(jù)不同發(fā)育階段分成離散的2群細胞。然而,來自同一階段內(nèi)不同時間點、不同建庫策略的Fb細胞幾乎完全混合,提示這種離散分群可能來源于胚胎期和成人期的生物學差異,而非批次效應(yīng)。TEC主要以cTEC和Ⅰ型髓質(zhì)TEC(medullary TEC,mTEC)細胞為主,其次是高表達自身免疫調(diào)控基因AIRE(autoimmune regulator)的Ⅱ型mTEC。盡管相同TEC亞型的細胞形成了相對集中且連續(xù)的分群,但來自不同時間點的細胞并未完全混合。類似地,來自胚胎期和成年期的Endo也形成了連續(xù)但不混合的分群。DC1、DC2和aDC亞群之間能清晰地區(qū)分,但來自不同發(fā)育階段的同一亞群細胞則被均勻混合。以上結(jié)果提示,基于PPI構(gòu)建基因相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)的分析方式,既有效地區(qū)分了不同細胞類型,同時揭示了可能由發(fā)育階段造成的差異,且相比于DC,這種差異在TEC、Endo和Fb中更為顯著。

        2.2 APC隨發(fā)育進程的轉(zhuǎn)錄動態(tài)

        對差異基因的GO和KEGG分析顯示,cTEC在胚胎早期主要富集包括核糖體參與的蛋白合成和加工等功能,而自9周齡開始直到成年則主要富集抗原提呈、自身免疫疾病相關(guān)的信號通路(圖2A)。此外,在出生后,cTEC下調(diào)表達與黏著斑(focal adhesion)、PI3K-Akt信號通路相關(guān)的基因(圖2B)。與cTEC略有不同,Ⅰ型mTEC在胚胎和嬰兒期主要富集抗原提呈相關(guān)的信號通路,在成年期則富集與核糖體、mRNA代謝和細胞凋亡等有關(guān)的信號通路,并相應(yīng)下調(diào)多種自身免疫疾病相關(guān)通路的基因(圖3A)。Ⅱ型mTEC在胚胎期和嬰兒期的功能富集與Ⅰ型mTEC相似,但在成年期的差異表達基因未發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào)的信號通路,僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)下調(diào)的基因可能與糖代謝相關(guān)(圖3B)。

        圖2 人類cTECs差異基因的KEGG通路分析Fig 2 The KEGG pathway analysis of differentially expressed genesof human cTECs

        圖3人類mTECs差異基因的KEGG通路分析Fig 3 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes of human mTECs

        2類DC細胞自胚胎期至成人期均富集包括抗原提呈或多種自身免疫疾病相關(guān)的通路。其中,與其他時期相比,孕7~8周時的DC1細胞下調(diào)表達1型糖尿病等疾病相關(guān)的基因,而嬰兒期DC1細胞和胚胎期相比,還富集細胞凋亡相關(guān)的通路(圖4A);出生后的DC2細胞和胚胎期相比,還富集腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號相關(guān)的通路,并且下調(diào)表達和糖類或蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的基因(圖4B)。

        圖4 人類胸腺DCs差異基因的KEGG通路分析Fig 4 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes of human thymic DCs

        我們進一步關(guān)注MHC分子,即人白細胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)基因在各個時間點的表達差異。cTEC中的HLA基因大多在孕12周后表達上調(diào),此后的發(fā)育階段中無顯著差異(圖5A)。而早在孕9~11周時,Ⅰ型mTEC中的HLA基因即呈現(xiàn)表達上調(diào),并持續(xù)到嬰兒期;進入成年期后,Ⅰ型mTEC中的多種MHC-Ⅱ類分子基因,包括HLA-DQB1、HLA-DQA1、HLADRB5、HLA-DPA1、HLA-DPB1和HLA-DRB1等均顯著下調(diào),MHC-Ⅰ類分子基因(HLA-A、HLA-B、HLA-C等)的下調(diào)則較輕微(圖5A)。HLA基因的表達模式在成年Ⅱ型mTEC細胞中未發(fā)現(xiàn)顯著改變(圖5A)。2類DC細胞的HLA分子均自胚胎早期就開始表達,在出生后達到峰值,并持續(xù)至成年(圖5B)。

        圖5 人類胸腺APCs中HLA基因的表達差異Fig 5 Differential expression of HLA genesin human thymic APCs

        2.3 Fb細胞隨發(fā)育進程的轉(zhuǎn)錄動態(tài)

        Fb 1型細胞在胚胎期主要上調(diào)胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)、轉(zhuǎn)化生長因子β-1(transforming growth factor-β1,TGF-β1),在胚胎期和嬰兒期上調(diào)COL1A1和COL3A1等膠原α鏈基因(圖6A)。Fb 2型細胞的膠原基因表達譜和Fb 1型細胞類似。然而,2種Fb自嬰兒期開始即上調(diào)MHC-Ⅰ類分子基因(HLAB、HLA-C)(圖6A),并在成人期下調(diào)表達多種膠原基因(圖6B)。此外,2種Fb在出生后階段均上調(diào)多種趨化因子配體基因,包括CXCL14、CCL19和CCL21等。作為比較,我們發(fā)現(xiàn)Ⅰ型mTEC的CCL19和CCL21在成年期較胚胎和嬰兒期下調(diào)(圖6C)。

        圖6 人類胸腺Fb1和Fb2在不同發(fā)育階段的差異表達基因Fig 6 Differentially expressed genes of human thymic Fb1 and Fb2 across development stages

        GO和KEGG分析提示,2種Fb細胞在胚胎期的功能以核糖體相關(guān)的蛋白質(zhì)合成或加工為主。Fb 1型細胞在嬰兒期主要富集細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)相關(guān)的通路,而在成人期則富集抗原提呈相關(guān)的通路(圖7A)。與Fb 1型細胞略有不同,F(xiàn)b 2型細胞在嬰兒期和成人期均富集抗原提呈和免疫反應(yīng)相關(guān)的通路(圖7B)。而2種Fb在成人期的下調(diào)基因均富集了以蛋白質(zhì)消化吸收和Prion病等為主的信號通路。以上結(jié)果提示,在出生后的胸腺發(fā)育中,F(xiàn)b從以一般基質(zhì)細胞的支持功能為主,逐漸產(chǎn)生參與T細胞抗原識別、分化和激活的功能。

        圖7 人類胸腺Fb 1型和Fb 2型差異基因的KEGG通路分析Fig 7 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes of human thymic Fb1 and Fb2

        2.4 Endo隨發(fā)育進程的轉(zhuǎn)錄動態(tài)

        在胚胎期和嬰兒期,Endo主要富集ECM和黏著斑等相關(guān)的通路。而自出生后開始,Endo還富集抗原提呈相關(guān)通路,特別是在成年期同時富集包括1型糖尿病、自身免疫性甲狀腺疾病相關(guān)的通路,并且下調(diào)細胞黏附、ECM或PI3K-Akt信號通路相關(guān)的基因。HLA基因的表達譜顯示Endo在出生后顯著上調(diào)MHC-Ⅰ類和多種MHC-Ⅱ類分子基因(HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLADPA1和HLA-DPB1等)(圖8)。

        圖8 人類胸腺Endo在不同發(fā)育階段的差異表達基因Fig 8 Differentially expressed genes of human thymic Endo across development stages

        3 討論

        在2類MHC分子中,通常認為MHC-Ⅰ類分子主要與CD8分子結(jié)合,而MHC-Ⅱ主要結(jié)合CD4[21]。在胸腺內(nèi),cTEC主要通過提呈2類自身抗原肽-MHC復(fù)合物,刺激T細胞前體作出適當強度的免疫反應(yīng),使CD4/CD8雙陽性(double positive,DP)細胞獲得MHC限制性免疫反應(yīng),激活生存信號并分化為CD4或CD8單陽性(single positive,SP)細胞[2]。我們的分析發(fā)現(xiàn),自胚胎期分化成熟以來,人類cTEC的抗原提呈功能一直持續(xù)到成年,同時2類MHC分子的表達均未見明顯下調(diào)。這些結(jié)果提示,胸腺的生理性退化可能對主要由cTEC完成的陽性選擇功能影響較小。

        由于mTEC的抗原提呈主要用于篩選出非自身反應(yīng)性T細胞,其抗原提呈功能下降可能使某些自身反應(yīng)性T細胞從陰性選擇中逃逸,進入外周造成自身免疫疾病[22]。過去對自身免疫疾病模型NZB小鼠的研究[23]發(fā)現(xiàn),其胸腺中MHC-Ⅱ陽性的mTEC比例在生理性退化時的數(shù)量衰減較對照組更顯著,提示了這類mTEC在自身免疫疾病發(fā)生中的潛在作用。我們的分析在單細胞分辨率水平更精確地推斷了人類胸腺生理性退化時最易影響的潛在mTEC亞型(Ⅰ型mTEC),其在成年期顯著下調(diào)MHC-Ⅱ類分子,抗原提呈功能較胚胎期和嬰兒期有所下降??紤]不同MHC分子的親和性,這一改變可能更容易影響CD4單陽性細胞,即諸如輔助性T細胞或調(diào)節(jié)性T細胞等的前體,進而影響青春期后的機體免疫穩(wěn)態(tài)[24]。值得注意的是,過去普遍認為表達AIRE基因的Ⅱ型mTEC對誘導(dǎo)中心耐受、調(diào)控mTEC表達自身抗原肽等過程尤為關(guān)鍵[25-26],然而,根據(jù)我們的功能富集分析,在成年期,該類細胞未見顯著的轉(zhuǎn)錄改變,且AIRE基因本身和HLA基因的表達也無明顯下調(diào)。因此,胸腺退化對Ⅱ型mTEC的影響有待設(shè)計實驗進一步驗證。

        對于胸腺中的非APC細胞,我們主要分析了Fb和Endo。單細胞測序的細胞分群揭示了兩者在出生前后的轉(zhuǎn)錄差異。胚胎期的Fb除了表達多種膠原基因參與構(gòu)建ECM之外,還同時上調(diào)IGF2基因,這可能與其通過胰島素樣生長因子受體(insulin-like growth factor receptor,IGF-R)誘導(dǎo)胚胎期T細胞前體的發(fā)育有關(guān)[27]。IGF2在出生后的Fb中下調(diào),可能提示這種誘導(dǎo)作用的下降。在成年期,F(xiàn)b中多種膠原基因的下調(diào),則可能使胸腺難以維持有序排列的小葉結(jié)構(gòu)。由于MHC-Ⅰ類分子通常在人類大多數(shù)細胞類型中均有表達,其表達上調(diào)不足以說明Fb在出生后分化出抗原提呈的功能。然而,CCL19和CCL21是mTEC通過CCR7誘導(dǎo)SP細胞進入胸腺髓質(zhì)的主要趨化因子[28-29]。與Ⅰ型mTEC逐漸下調(diào)CCL19和CCL21相對應(yīng),出生后的Fb上調(diào)這2個基因提示其具有類似的誘導(dǎo)T細胞在胸腺內(nèi)遷移的功能,也可能與出生后誘導(dǎo)T細胞歸巢或退化時的炎性反應(yīng)有關(guān)。

        與Fb不同,胸腺中的Endo在出生后顯著上調(diào)2類MHC分子的表達,并可能由此參與T細胞的抗原識別。與MHC-Ⅰ類分子不同,MHC-Ⅱ類分子通常由專職的APC(professional APC)表達[30]。MHC-Ⅱ類分子在Endo中上調(diào)可由γ干擾素(γ-interferon,IFN-γ)誘導(dǎo),并參與調(diào)控效應(yīng)-記憶T細胞(effector memory T cells)的抗原識別[31],可能是與出生后適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的構(gòu)建相協(xié)調(diào)的改變。

        綜上所述,我們基于單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),利用生物信息學方法,揭示了多種人類胸腺基質(zhì)細胞在不同發(fā)育階段中潛在的功能改變,推斷了胸腺在出生后發(fā)育和退化過程中易受影響的細胞類型。胸腺生理性退化可能主要影響T細胞分化的陰性選擇。這些結(jié)果為后續(xù)研究人體免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)在生命早、中期的動態(tài)改變和胸腺微環(huán)境的體外重建提供了新的依據(jù)。

        參·考·文·獻

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