吳 菁，呂志武，蔣志勇，李奎生，劉 芳，黃明沂，肖 瑤

（1.深圳市寶安區(qū)福永人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 深圳 518103；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳寶安醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 深圳 518101；3.武漢大學(xué)中南醫(yī)院影像科，湖北 武漢 430071）

胃癌是一種發(fā)病率較高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類的健康及生命安全[1]。近年來隨著我國居民飲食結(jié)構(gòu)的改變及幽門螺桿菌感染率的增加，胃癌的發(fā)病率逐年升高，且此病患者的發(fā)病年齡趨于年輕化。探究胃癌發(fā)生的分子機(jī)制，對胃癌的診斷和靶向治療具有重要意義。miRNA是一類非編碼RNA序列，廣泛分布于真核細(xì)胞內(nèi)，其長度約為23個(gè)核苷酸[2]。miRNA主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)下游靶基因mRNA的穩(wěn)定性，影響靶基因的表達(dá)[3]。近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，研究miRNA在胃癌細(xì)胞中的作用為胃癌的分子靶向治療提供了新的方向[4]。miR-3143是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA，參與乳腺癌細(xì)胞的代謝過程[5]。miR-3143對胃癌細(xì)胞功能的影響尚不明確。本文主要是探討miR-3143對胃癌HS-746T細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

胃癌HS-746T細(xì)胞（購于中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心），胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基（購于美國Gibco公司），miR-NC和miR-3143 mimic（購于廣州銳博生物科技有限公司），Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑（購于美國Invitrogen公司），qRT-PCR試劑盒（購于日本TaKaRa公司），細(xì)胞周期檢測試劑盒和細(xì)胞凋亡試劑盒（購于南京凱基生物科技有限公司），一抗GAPDH、TOP2A、Cyclin H和IAPs（購于美國Affinity公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（購于武漢博士德生物科技公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

采用含10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)HS-746T細(xì)胞，培養(yǎng)條件：溫度為37℃，二氧化碳（carbon dioxide，CO2）濃度為5%。取對數(shù)生長期的HS-746T細(xì)胞接種于24孔板上，根據(jù)Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑的說明書對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)染miR-3143 mimic（miR-3143組）和miR-NC（Control組），二者的終濃度均為50 nmol/L，24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 采用qRT-PCR法檢測miR-3143和TOP2AmRNA的相對表達(dá)量

采用TRIzol（一種新型的總RNA抽提試劑）提取HS-746T細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以cDNA為模板采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）法進(jìn)行擴(kuò)增檢測。根據(jù)2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-3143和TOP2A mRNA的相對表達(dá)量。以U6為內(nèi)參計(jì)算miR-3143的相對表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算TOP2A mRNA的相對表達(dá)量。miR-3143的上游引物為5’- AAGAAGCGCTTTACAATGTTAT-3’， 下 游 引物 為5’- CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’。U6的 上 游 引物 為5’- GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3’，下 游 引 物 為5’- GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。TOP2A的 上 游 引 物為5’-TGGCTGTGGTATTGTAGAAAGC-3’，下游引物為5’-TTGGCATCATCGAGTTTGGGA-3’。GAPDH的上游引物為5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物為5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.4 采用平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測HS-746T細(xì)胞的增殖活力

將Control組和miR-3143組各1000個(gè)HS-746T細(xì)胞接種于6孔板上，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周左右，直至出現(xiàn)肉眼可見的克隆。棄去上清液，加入多聚甲醛在室溫下固定35 min。棄去上清液，加入結(jié)晶紫染色液在室溫下染色35 min。用流水洗去染液，在室溫下干燥，用肉眼觀察HS-746T細(xì)胞的克隆形成數(shù)。

1.5 采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測HS-746T細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡情況

將Control組和miR-3143組HS-746T細(xì)胞消化收集，采用預(yù)冷的乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)為70%）固定細(xì)胞8 h，加入核糖核酸酶A（RNase A）作用30 min，加入溴化乙錠避光孵育30 min。采用流式細(xì)胞儀檢測兩組HS-746T細(xì)胞的周期變化。將Control組和miR-3143組HS-746T細(xì)胞消化收集，分別加入異硫氰酸熒光素（fluorescein Isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的Annexin V試劑和溴化乙錠試劑，避光孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測兩組HS-746T細(xì)胞的凋亡率。

1.6 采用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測miR-3143的下游靶基因

運(yùn)用miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫miRecords和miRGator對miR-3143的下游靶基因進(jìn)行預(yù)測。

1.7 采用Westernblot檢測HS-746T細(xì)胞中TOP2A蛋白的表達(dá)

收集Control組和miR-3143組HS-746T細(xì)胞，采用RIPA裂解液（RIPA Lysis Buffer）裂解HS-746T細(xì)胞并提取總蛋白，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)。將分離出的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的脫脂牛奶在室溫下封閉2 h。在一抗TOP2A（濃度為1:3000）、Cyclin H（濃度為1:1000）、IAPs（濃度為1:1000）、GAPDH（濃度為1:1000）中孵育過夜。洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（濃度為1:10 000），在室溫下孵育1 h。按照超敏發(fā)光試劑盒的說明書對蛋白條帶進(jìn)行曝光、顯影，測定拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα（topoisomeraseⅡalpha，TOP2A）的表達(dá)情況。

1.8 觀察指標(biāo)

觀察并記錄miR-3143細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率、miR-3143對HS-746T細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。觀察并記錄miR-3143與靶基因的靶向關(guān)系及上調(diào)miR-3143對HS-746T細(xì)胞靶基因mRNA、蛋白表達(dá)的影響。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對本研究中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-3143細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率

本研究進(jìn)行qRT-PCR檢測的結(jié)果顯示，Control組和miR-3143組HS-746T細(xì)胞中miR-3143的表達(dá)水平分別 為（1.07±0.22）和（7.79±1.55），miR-3143組HS-746T細(xì)胞中miR-3143的表達(dá)水平是Control組的7.28倍，組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.30，P＜0.01）。這表明本研究進(jìn)行miR-3143 mimics轉(zhuǎn)染成功。

2.2 miR-3143對HS-746T細(xì)胞增殖能力的影響

本研究進(jìn)行平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，Control組和miR-3143組HS-746T細(xì)胞的克隆形成數(shù)分別為（175.70±22.29）個(gè)和（67.93±16.78）個(gè)，組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.86，P＜0.01）。這表明上調(diào)miR-3143的表達(dá)能抑制胃癌HS-746T細(xì)胞的增殖活性。詳見圖1。

圖1 miR-3143對HS-746T細(xì)胞增殖活性的影響

2.3 miR-3143對HS-746T細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

本研究采用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行檢測的結(jié)果顯示，與Control組相比，miR-3143組G0-G1期的HS-746T細(xì)胞更多，S期的HS-746T細(xì)胞更少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這表明上調(diào)miR-3143的表達(dá)能夠?qū)S-746T細(xì)胞阻遏在G0-G1期。詳見圖2。

圖2 miR-3143對HS-746T細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

2.4 miR-3143對HS-746T細(xì)胞凋亡的影響

本研究采用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行檢測的結(jié)果顯示，Control組和miR-3143組HS-746T細(xì)胞的凋亡率分別為（9.71±1.69）%和（18.63±2.59）%，組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.88，P＜0.05）。這表明上調(diào)miR-3143的表達(dá)能促進(jìn)HS-746T細(xì)胞的凋亡。詳見圖3。

圖3 miR-3143對HS-746T細(xì)胞凋亡的影響

2.5 miR-3143與靶基因的靶向關(guān)系

運(yùn)用miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫miRecords和miRGator預(yù)測miR-3143的靶基因可能是TOP2A，互補(bǔ)結(jié)合序列詳見圖4。

2.6 上調(diào)miR-3143的表達(dá)對HS-746T細(xì)胞TOP2AmRNA表達(dá)的影響

本研究進(jìn)行qRT-PCR檢測的結(jié)果顯示，Control組和miR-3143組HS-746T細(xì)胞中TOP2A mRNA的表達(dá)水平分別為（1.07±0.19）和（0.31±0.05），組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.98，P＜0.01）。這表明上調(diào)miR-3143的表達(dá)能顯著抑制TOP2A mRNA的表達(dá)。

2.7 上調(diào)miR-3143的表達(dá)對HS-746T細(xì)胞TOP2A蛋白表達(dá)的影響

本研究進(jìn)行Western blot檢測的結(jié)果顯示，與Control組相比，miR-3143組HS-746T細(xì)胞中TOP2A蛋白的表達(dá)明顯降低，細(xì)胞周期蛋白Cyclin H的表達(dá)明顯降低，細(xì)胞凋亡抑制蛋白IAPs的表達(dá)明顯降低。詳見圖5。

圖5 上調(diào)miR-3143的表達(dá)對TOP2A蛋白表達(dá)的影響

3 討論

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中存在多個(gè)異常表達(dá)的miRNA，miRNA的異常表達(dá)在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用日益受到重視[6]。miRNA可作為癌基因或抑癌基因在胃癌細(xì)胞的增殖或凋亡中發(fā)揮作用。Ding等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR-146b-5p在胃癌組織中的表達(dá)下調(diào)，出現(xiàn)癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌患者癌組織中miR-146b-5p的表達(dá)低于未出現(xiàn)癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，miR-146b-5p過表達(dá)可減弱胃癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。He等[8]研究指出，miR-96-5p在胃癌細(xì)胞株和胃癌患者的血清樣本中呈高表達(dá)，miR-96-5p在體外能顯著加快胃癌細(xì)胞的生長。miR-3143是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的miRNA，其可影響乳腺癌細(xì)胞的代謝[5]。本研究將miR-3143轉(zhuǎn)染至胃癌HS-746T細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)miR-3143表達(dá)上調(diào)后，胃癌HS-746T細(xì)胞的克隆形成能力可明顯降低，細(xì)胞周期進(jìn)展減慢，細(xì)胞的凋亡增加，這表明miR-3143可發(fā)揮抑制胃癌HS-746T細(xì)胞的作用。miRNA抑制胃癌HS-746T細(xì)胞的主要機(jī)制是靶向互補(bǔ)結(jié)合靶基因mRNA的3’-UTR，促進(jìn)靶基因mRNA的降解或抑制其翻譯為蛋白，從而下調(diào)靶基因在細(xì)胞中的表達(dá)水平[9]。本研究利用miRecords和miRGator數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-3143的靶基因可能是TOP2A。TOP2A基因位于17號染色體長臂，TOP2A蛋白可改變DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)，調(diào)控基因的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞周期、增殖、有絲分裂等過程中發(fā)揮著重要作用[10]。TOP2A蛋白在腫瘤組織（如前列腺癌組織、乳腺癌組織、胰腺癌組織）中的表達(dá)水平明顯高于正常組織，其表達(dá)水平與患者對化療的敏感度、預(yù)后等存在明顯的相關(guān)性[11-12]。TOP2A蛋白在胃癌組織中呈高表達(dá)，與胃癌的惡性程度有關(guān)，下調(diào)TOP2A的表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的生長和侵襲[13]。

綜上所述，上調(diào)miR-3143的表達(dá)能有效地抑制胃癌HS-746T細(xì)胞的增殖活力，調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，這一作用機(jī)制可能與miR-3143能夠抑制TOP2A基因的表達(dá)有關(guān)。miR-3143可能為胃癌提供新的基因治療靶點(diǎn)。