徐 穎，馬四清

（青海省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，西寧 810007）

膿毒癥是一種因患者全身出現(xiàn)的惡性炎癥反應(yīng)狀態(tài)，主要由于各種感染、創(chuàng)傷、外科手術(shù)等反復(fù)刺激導(dǎo)致機體產(chǎn)生大量炎性因子。膿毒癥患者的病情多變且不穩(wěn)定，膿毒癥后腸腔內(nèi)的細菌和大量釋放的內(nèi)毒素可以激活腸道免疫細胞，釋放出多種炎癥介質(zhì)導(dǎo)致腸粘膜損傷，隨著病情的進一步發(fā)展可能會出現(xiàn)多器官功能衰竭[1-2]。右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）是目前比較常用的一種新興的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛藥，主要應(yīng)用于術(shù)后鎮(zhèn)痛、麻醉等[3-4]。既往研究顯示，DEX還具有抗炎癥、抗凋亡的作用，可以減輕膿毒癥患者的炎癥性損傷[5]，但目前關(guān)于DEX 在保護膿毒癥患者腸道功能中的作用機制尚不明確。本研究擬復(fù)制大鼠膿毒癥模型，探討DEX保護膿毒癥大鼠腸屏障功能，抗腸道細胞凋亡的作用機制，為進一步使用DEX治療膿毒癥提供實驗和理論依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物來源 SPF 級SD 大鼠60 只，購自廣東醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，粵監(jiān)證字2004A029 號，所有大鼠均在本院動物中心實驗室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，相對濕度50%～65%，該實驗經(jīng)過動物倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 藥物與試劑 鹽酸DEX 注射液（國藥準(zhǔn)字：H20 090248；生產(chǎn)廠家：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）購自武漢大學(xué)人民醫(yī)院；中性福爾馬林、酒精、二甲苯購自天津科密歐有限公司；Caspase-3 抗體（批號：31A1067201806）購自碧云天公司；Bcl-2 抗體（貨號：sc-7382；批號：20190201）、Bax抗體（貨號：sc-7480；批號：20190301）購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司；HRP 羊抗兔IgG、HRP 羊抗鼠IgG等二抗購自美國Thermo 公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）及D-乳酸測定試劑購自美國Sigma公司。

1.3 儀器 722分光光度計購自上海第三分析儀器制造廠；全自動脫水機購自湖北孝感醫(yī)用電子技術(shù)有限公司；病理切片機購自德國Leica公司；BS-124s型電子天平購自北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司；3-5w低溫離心機購自湖南恒諾離心機有限公司；SG-51正置型金相顯微鏡購自上海光學(xué)儀器廠；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad 公司；凝膠成像系統(tǒng)購于以色列DNR公司；LD-66實驗室切片機購自長沙益廣制藥機械公司。

1.4 分組及建立模型 將60 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按隨機數(shù)字表法將大鼠分為空白對照組（Control）、模型組（Model）、低劑量DEX組（5 μg/kg）和高劑量DEX 組（10 μg/kg），每組15 只；除空白對照組外，其余45 只大鼠制備膿毒癥模型，制作方法及判斷模型是否成功參考付曉菲等[6]研究。具體操作：使用10%的水合氯醛麻醉，采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)，導(dǎo)致大鼠形成膿毒癥，臍上沿中線開腹1～2 cm 使得大腸暴露，結(jié)扎距盲端約2 cm，使用針在結(jié)扎腸斷貫穿3 次，并擠出腸溶物后將盲腸收回。空白對照組僅僅開腸暴露盲腸后收回，消毒、縫合。

1.5 藥物干預(yù) 制作完大鼠膿毒癥模型1 h后通過尾靜脈注射DEX，低劑量DEX 組注射速率為5 μg/kg·h-1，分別在術(shù)后1 h和術(shù)后6 h注射兩次，1 h/次，注射總量為1 mL；高劑量DEX組注射速率為10 μg/kg·h-1，分別在術(shù)后1 h和術(shù)后6 h注射兩次，1 h/次；模型組和空白對照組注射等量的生理鹽水。

1.6 蘇木精—伊紅（HE）染色觀察大鼠腸組織病理學(xué)改變 藥物處理24 h 后，放血處死大鼠，取大鼠血液，保存于-80 ℃冰箱中國以供后期使用；取大鼠距回盲瓣5 cm處取大鼠小腸組織約0.5～1 cm，生理鹽水洗凈，10%的多聚甲醛固定45 h，然后使用乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。HE染色，在10×20的光鏡下觀察大鼠腸組織病理學(xué)改變。

1.7 分光光度法檢測DAO、D-乳酸 使用分光光度法檢測DAO、D-乳酸含量水平，取大鼠血液標(biāo)本，在4 ℃條件下，以3 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min，使用分光光度法測定血清中DAO活性，測定紫外波長為436 nm處的吸光值（OD），以DAO標(biāo)準(zhǔn)液不同濃度測出的值為X軸，相對OD值為Y坐標(biāo)，做曲線得出回歸方程，算出大鼠血液標(biāo)本中DAO 含量水平；計算D-乳酸含量水平時分光光度計測定340 nm 處的OD值，以D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)液不同濃度值為X軸，相對應(yīng)的OD值為Y作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程，計算出大鼠血液標(biāo)本中D-乳酸含量水平。

1.8 ELISA 法檢測 取大鼠血液標(biāo)本在4 ℃條件下，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，嚴(yán)格按照TNFα及IL-6試劑盒子上的操作方法，檢測其含量水平。

1.9 Western blotting 檢測蛋白表達水平 使用Western blotting檢測Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平，取大鼠腸組織，使用剪刀剪碎后使用胰蛋白酶消化后，提取總蛋白，使用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h 后加入各需要檢測蛋白的一抗（1∶1 000），二抗（1∶5 000），孵育2 h，以β-actin 為內(nèi)參蛋白，采用顯色液顯色后行吸光度分析，計算各蛋白相對表達量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，偏態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）［M（P25～P75）］表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腸組織病理學(xué)觀察結(jié)果 空白對照組大鼠小腸組織結(jié)構(gòu)完成，無水腫，絨毛形態(tài)正常；模型組小腸組織混亂，出現(xiàn)間質(zhì)水腫，絨毛排列紊亂，上皮細胞脫落，有大量的中性粒細胞浸潤；使用DEX處理后的兩組水腫明顯的到改善，有少量上皮細胞脫落，小腸絨毛排列也較為整齊，見圖1。

圖1 大鼠腸組織病理學(xué)觀察結(jié)果（×200）

2.2 大鼠DAO及D-乳酸檢測結(jié)果 與空白對照組比較，模型組大鼠DAO 活性及D-乳酸水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，低劑量DEX 組大鼠DAO 活性及D-乳酸水平顯著降低（P＜0.01）；與低劑量DEX組相比，高劑量DEX組大鼠DAO 活性及D-乳酸水平著降低（P＜0.01），見圖2。

圖2 大鼠DAO及D-乳酸檢測結(jié)果

2.3 大鼠血清炎癥因子檢測結(jié)果 與空白對照組比較，模型組大鼠血清TNF-α和IL-6水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量DEX 組大鼠TNF-α 和IL-6 水平顯著降低（P＜0.01）；與低劑量DEX 組比較，高劑量DEX 組大鼠TNF-α 和IL-6 水平為顯著降低（P＜0.01），見圖3。

圖3 大鼠血清炎癥因子檢測結(jié)果

2.4 大鼠凋亡蛋白檢測結(jié)果 與空白對照組比較，模型組大鼠腸組織Bcl-2蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.01），Bax 及Caspase-3 蛋白相對表達量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，低劑量DEX組大鼠腸組織Bcl-2 蛋白相對表達量顯著升高（P＜0.01），Bax 及Caspase-3 蛋白相對表達量和顯著降低（P＜0.01）；與低劑量DEX 組相比，高劑量DEX 組大鼠Bcl-2蛋白相對表達量顯著升高（P＜0.01），Caspase-3蛋白相對表達量水平顯著降低（P＜0.01），見圖4。

圖4 大鼠凋亡蛋白檢測結(jié)果

與空白對照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.01；與低劑量DEX組比較，&&P＜0.01；A：大鼠血清TNF-α含量水平；B：大鼠血清IL-6含量水平。

3 討論

膿毒癥發(fā)病初期會伴隨著腸黏膜病理形態(tài)學(xué)變化，發(fā)生膿毒癥腸道上皮細胞會發(fā)生凋亡并脫落，間質(zhì)會出現(xiàn)水腫同時腸道絨毛也會出現(xiàn)排列紊亂，腸道黏膜通透性也會發(fā)生一定的改變[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，使用DEX 組大鼠水腫明顯得到改善，有少量上皮細胞脫落，小腸絨毛排列也較為整齊。說明DEX可以有效患者小腸的損傷，同時抑制腸道上皮細胞的凋亡和脫落，改善膿毒癥大鼠腸道功能。李曠怡等[8]研究表明，抑制膿毒癥大鼠腸道黏膜凋亡可以有效緩解膿毒癥癥狀，與本研究得出的結(jié)論相一致。

DAO 主要存在于類和哺乳動物小腸絨毛上皮細胞中，可以參與絨毛上皮細胞內(nèi)核酸與蛋白質(zhì)的生成，并維持細胞內(nèi)Ca2+的濃度平衡減少氧化應(yīng)激損傷[9]。當(dāng)腸道功能受到損傷后原本存在于腸道上皮細胞中的DAO 會隨著上皮細胞凋亡和脫落進入腸道，使得腸腔內(nèi)的DAO活性上升，腸黏膜的DAO活性降低，使得腸黏膜的通透性改變。故DAO的含量可以反應(yīng)腸道損傷的嚴(yán)重程度，其含量水平越高說明腸道損傷越重[10]。D-乳酸含量水平也是衡量腸道功能的重要指標(biāo)之一[11]。人和動物機體本身不能產(chǎn)生D-乳酸，D-乳酸是腸道內(nèi)細菌進行無氧酵解后的產(chǎn)物，當(dāng)腸道功能受損后腸道內(nèi)病原微生物大量生長繁殖，使得D-乳酸含量水平增加。故D-乳酸含量水平越高，說明腸道內(nèi)病原微生物越多，血清內(nèi)D-乳酸含量水平越高說明腸道黏膜通透性改變越大，腸黏膜功能受損越嚴(yán)重。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，使用DEX 處理各組大鼠DAO 活性及D-乳酸含量水平顯著降低，說明DEX可以有效改善腸道黏膜的通透性，并有效降低腸道內(nèi)的病原微生物越多，緩解腸道的損傷。鄭君剛等[12]研究顯示，DEX可以發(fā)揮鎮(zhèn)靜作用，抑制膿毒癥患者的應(yīng)激反應(yīng)失控，減輕炎癥反應(yīng)，保護膿毒癥患者的腸屏障功能，提示DEX可能通過發(fā)揮鎮(zhèn)靜抗炎作用，緩解膿毒癥大鼠腸道組織損傷，但其具體的機制有待于進一步深入探索。

膿毒癥的發(fā)病機制較為復(fù)雜，目前多數(shù)觀點認(rèn)為膿毒癥主要是由于感染導(dǎo)致身性炎癥反應(yīng)，過多的炎癥介質(zhì)會導(dǎo)致器官損傷，致使多器官衰竭死亡[13]。因此，控制炎癥反應(yīng)是治療膿毒癥的關(guān)鍵因素之一。目前常見的炎癥因子包括TNF-α、IL-1、IL-6 和IL-8 等[14]。TNF-α 可以引起機體產(chǎn)生代謝性應(yīng)激反應(yīng)，并導(dǎo)致代謝產(chǎn)物含量增多使得局部炎性介質(zhì)大量合成[15]。同時，IL-6 也有促進組織中基質(zhì)金屬蛋白酶家族蛋白、前列腺素等炎癥物質(zhì)產(chǎn)生和表達的作用，從而加速炎性反應(yīng)進程。本研究發(fā)現(xiàn)與模型組相比，使用DEX 組大鼠DAO 活性及D-乳酸含量水平顯著降低，說明DEX可以有效降低機體的炎癥反應(yīng)，同時抑制炎癥介質(zhì)的釋放，有效保護炎癥介質(zhì)對致器官的損傷。本研究以上結(jié)果的變化可能是因為DEX可以通過降低炎性介質(zhì)的釋放，緩解肝竇擴張、中央靜脈淤血，促進肝組織的排毒，降低腸道內(nèi)的內(nèi)毒素含量水平，從而減輕腸道損傷。Pott等[16]研究表明，TNF-α還可以誘導(dǎo)死亡受體途徑介導(dǎo)的凋亡，誘導(dǎo)結(jié)腸炎大鼠腸上皮細胞凋亡，導(dǎo)致腸黏膜屏障功能下降，提示DEX可能通過抑制炎癥介質(zhì)釋放，保護腸道功能。

腸道上皮細胞的凋亡及脫落是影響腸道功能的重要因素，而細胞的凋亡受到相關(guān)基因的調(diào)控。Caspase 家族蛋白在細胞凋亡信號傳遞和凋亡執(zhí)行過程中的重要蛋白，當(dāng)細胞凋亡途徑激活后，上游信號經(jīng)傳遞能夠激活下游caspase-9的活化，放大凋亡信號，激活caspase-3，而凋亡信號一旦傳遞到caspase-3蛋白活化，細胞凋亡進入不可逆階段[17-18]。除了Caspase 家族，Bcl-2 家族也是一種常見的凋亡控制基因。Bcl-2家族中主要是由Bcl-2和Bax這兩種蛋白表達量決定細胞是否凋亡[19-20]。Bax和Bcl-2表達呈相反趨勢，當(dāng)Bcl-2 表達下降時Bax 表達上升，此時會促進細胞的凋亡；當(dāng)Bcl-2 表達升高，而Bax表達降低時，則會抑制細胞的凋亡[21]。本實驗中可以看出，與模型組相比，使用DEX 處理各組大鼠腸組織Bcl-2 蛋白表達顯著升高，Bax 及Caspase-3 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。說明DEX可以通過抑制凋亡蛋白的表達，升高抑制凋亡蛋白的表達實現(xiàn)抑制腸道上皮細胞的凋亡。鄧麗靜等[22]研究表明，DEX 可以通過抑制腸細胞及免疫細胞的凋亡，本研究結(jié)果與其部分一致，提示DEX可可能通過抑制腸道細胞凋亡，發(fā)揮腸道保護。

綜上所述，DEX可以降低腸源性膿毒癥大鼠血清中過高的炎性因子，保護腸道黏膜，抑制腸道細胞的凋亡，減輕腸道腸道組織損傷。但本實驗涉及到的樣本量較少，本研究僅初步探討了DEX緩解腸源性膿毒癥大鼠腸道組織損傷的可能機制，其具體的機制在后續(xù)實驗將進一步驗證。