陳校力，肖美華，江旭林，湯 俊，李志紅，羅慶偉

（湖北省鄂州市中心醫(yī)院胃腸外科，鄂州 436000）

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病隱匿，多數患者確診時已處于中晚期，患者預后較差[1]。近年來，多靶點抗癌藥物的研發(fā)是新型腫瘤治療藥物研發(fā)的焦點。舒尼替尼是一類口服的小分子多靶點受體酪氨酸激酶抑制劑，可抑制腫瘤血管生成，發(fā)揮抗腫瘤作用。研究顯示，舒尼替尼可在體外抑制胃癌細胞的增殖并誘導細胞凋亡[2]，且其臨床治療轉移性胃癌的效果較佳，安全性高[3]。但目前舒尼替尼影響胃癌發(fā)生發(fā)展的作用機制尚未明確。長鏈非編碼RNA（lncRNA）與微小RNA（miRNA）是兩類與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關的小分子非編碼RNA，lncRNA 作為競爭性內源性RNA 與miRNA 靶向結合，共同影響疾病發(fā)展進程[4]。研究顯示，胃癌組織中l(wèi)ncRNA ROR表達升高，其高表達的患者預后不良，下調其表達可促進阿霉素和長春新堿誘導的耐藥胃癌細胞凋亡[5]。生物信息學軟件預測顯示，lncRNA-重編碼調控因子（ROR）可能競爭性結合miR-670-3p，泛素E3連接酶膜相關鋅指蛋白5（MARCH5）可能是miR-670-3p的靶基因。研究顯示，miR-670-3p 在肝癌中表達下調，上調其表達可抑制肝癌細胞增殖和侵襲[6]；MARCH5 在乳腺癌細胞中表達上調，其通過誘導細胞上皮—間質轉化促進乳腺癌細胞的生長和轉移[7]。但miR-670-3p/MARCH5 對胃癌細胞惡性生物學行為的影響還未知。因此，本研究以lncRNA ROR/miR-670-3p/MARCH5軸為切入點，探討舒尼替尼影響胃癌細胞增殖和凋亡的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和實驗試劑 胃癌細胞系GC9811-P由中國科學院上海細胞庫提供；胎牛血清（FBS）購自浙江天杭生物科技公司；細胞計數試劑盒-8（CCK-8）、RIPA試劑、二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒和RPMI 1640培養(yǎng)基均購自北京索萊寶公司；Trizol 試劑和LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒購于大連寶生物；雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國Promega 公司；細胞周期蛋白D1（CyclinD1）購自美國Santa Cruz 公司；活化半胱天冬酶-3（Cleaved-caspase-3）和MARCH5抗體購自Abcam 公司；PCR 引物、miR-670-3p 模擬物（mimics）及模擬對照序列（miR-NC）、miR-670-3p抑制劑（anti-miR-670-3p）及抑制劑陰性對照序列（anti-miR-NC）、lncRNA ROR小干擾RNA（si-ROR）、MARCH5小干擾RNA（si-MARCH5）及小干擾RNA 陰性對照（si-NC）、lncRNA ROR 過表達載體（pcDNA-ROR）、MARCH5 過表達載體（pcDNAMARCH5）和空載體（pcDNA-NC）均由上海吉凱基因公司提供。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉染 用含10 % FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)GC9811-P 細胞。取對數期GC9811-P細胞接種于6孔板中（1×105個/孔），用LipofectamineTM2000 脂質體法，分別轉染miR-670-3p mimics、anti-miR-670-3p、miR-NC、anti-miR-NC、si-ROR、si-MARCH5、si-NC、pcDNA-ROR、pcDNAMARCH5、pcDNA-NC，轉染時間6 h。

1.3 細胞分組與處理 未轉染的GC9811-P細胞分為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，對照組用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，低、中和高劑量組分別用含0.06 μmol/L、0.30 μmol/L 和1.50 μmol/L[2]舒尼替尼的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。轉染si-ROR、si-NC、miR-670-3p mimics、miR-NC和si-MARCH5的細胞分別記為si-ROR 組、si-NC 組、miR-670-3p 組、miR-NC 組和si-MARCH5 組。轉染pcDNA-MARCH5 和pcDNANC的細胞均用含1.50 μmol/L舒尼替尼的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，并分別記為舒尼替尼+pcDNA-MARCH5組和舒尼替尼+pcDNA-NC組。

1.4 CCK-8 法檢測細胞活力 細胞接種于96 孔板中（0.5×103個/孔），按照分組處理細胞，每組設置3個復孔。培養(yǎng)結束后，加10 μL CCK-8工作液，再孵育4 h，用酶標儀檢測450 nm 波長處的吸光度（A）值。A值越高，細胞活力越高。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 細胞接種于24孔板中（2.5×104/孔），按照分組處理細胞，每組設置3 個復孔。培養(yǎng)后，0.25 %胰蛋白酶消化，收集細胞，PBS 清洗2 次。參照Annexin V-FITC/PI 試劑盒說明書，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測細胞lncRNA ROR、miR-670-3p 和MARCH5 表達 Trizol試劑提取細胞中總RNA，逆轉錄為cDNA，行PCR擴增。引物序列：lncRNA ROR 正向引物：5’-CCTGTCCTCCTGCTCTTTGC-3’，反向：5’-TTTCTTGGGCTGGTTGGTCT-3’；miR-670-3p 正向引物：5’-CTGATCGTGAGGAGAGTGT-3’，反向：5’-GGTCTTCGACATCGGGGCGG-3’；MARCH5 正向引物：5’-AAAATGGGGCCTCTGGTG TA-3’，反向：5’-TGACGGGAATGGTGGGTAAA-3’；β-actin正向引物：5’-ACCTGACCGA CTACCTCATG-3’，反向：5’-CTCGTAGCTCTTCTCCAGGG-3’；U6 正向引物：5’-GACAGA TTCGGTCTGTGGCAC-3’，反向：5’-GATTACCCGTCGGCCATCGATC-3’。lncRNA ROR 和MARCH5 以β-actin 為內參，miR-670-3p 以U6 為內參，2－△△Ct法計算lncRNA ROR、miR-670-3p和MARCH5 mRNA相對表達量。

1.7 Western blotting 法檢測細胞中MARCH5、CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達 RIPA試劑提取細胞中總蛋白，BCA 法對蛋白進行定量，行10%SDS-PAGE電泳。將分離蛋白轉至PVDF膜，于5%脫脂奶粉中封閉2 h；一抗MARCH5（1∶1 000）、CyclinD1（1∶800）、Cleaved-caspase-3（1∶1 000）和β-actin（1∶1 000）4 ℃孵育24 h，洗膜；二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，洗膜。ECL 顯色，成像系統(tǒng)顯影、曝光、拍照。Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值為目的蛋白表達量。

1.8 lncRNA ROR 與miR-670-3p 及miR-670-3p 與MARCH5靶向關系驗證 LncBase Predicted v.2 和starbase 生物信息學軟件預測顯示，lncRNA ROR 與miR-670-3p 的核苷酸序列存在連續(xù)互補的位點，miR-670-3p 與MARCH5 的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）存在連續(xù)互補的位點。PCR 分別擴增分別含miR-670-3p 結合位點的lncRNA ROR 與MARCH5 3’UTR序列，構建lncRNA ROR與MARCH5的野生型熒光素酶報告質粒WT-lncRNA ROR 和WTMARCH5。同時，利用基因突變技術將結合位點突變后分別構建lncRNA ROR 與MARCH5 的突變型熒光素酶報告質粒MUT-lncRNA ROR 和MUTMARCH5。分別將WT-lncRNA ROR、MUT-lncRNA ROR、WT-MARCH5、MUT-MARCH5 與miR-670-3p mimics、miR-NC 共轉染至GC9811-P 細胞。轉染6 h后，檢測各組細胞的熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件分析實驗數據。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 舒尼替尼對GC9811-P 細胞增殖和凋亡的影響 與NC 組比較，不同劑量舒尼替尼組GC9811-P細胞活力和CyclinD1 蛋白表達量降低（P＜0.05），GC9811-P 細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3 蛋白表達量升高（P＜0.05），見圖1。

圖1 舒尼替尼對GC9811-P細胞增殖和凋亡的影響

2.2 舒尼替尼對GC9811-P 細胞中l(wèi)ncRNA ROR、miR-670-3p 和MARCH5 表達的影響 與NC 組比較，舒尼替尼組GC9811-P 細胞中l(wèi)ncRNA ROR、MARCH5mRNA 和蛋白的表達水平均顯著降低（P＜0.05），miR-670-3p 表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖2。

圖2 舒尼替尼對GC9811-P細胞中l(wèi)ncRNA ROR、miR-670-3p和MARCH5表達的影響

2.3 下調lncRNA ROR 表達對GC9811-P 細胞增殖和凋亡的影響 與si-NC 組比較，si-ROR 組GC9811-P細胞中l(wèi)ncRNA ROR表達水平、細胞活力和CyclinD1 蛋白水平降低（P＜0.05），凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 下調lncRNA ROR表達對GC9811-P細胞增殖和凋亡的影響

2.4 上調miR-670-3p表達對GC9811-P細胞增殖和凋亡的影響 與miR-NC 組比較，miR-670-3p 組GC9811-P 細胞的OD450nm和CyclinD1 蛋白水平降低（P＜0.05），細胞中miR-670-3p 水平、凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P＜0.05），見圖4。

圖4 上調miR-670-3p表達對GC9811-P細胞增殖和凋亡的影響

2.5 下調MARCH5 對GC9811-P 細胞增殖和凋亡的影響 與si-NC組比較，si-MARCH5組GC9811-P細胞中MARCH5 水平、細胞活力及CyclinD1 蛋白水平降低（P＜0.05），細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P＜0.05），見圖5。

圖5 下調MARCH表達對GC9811-P細胞增殖和凋亡的影響

2.6 lncRNA ROR 與miR-670-3p 及miR-670-3p 與MARCH5靶向關系驗 LncBase Predicted v.2 在線軟件預測顯示，lncRNA ROR 與miR-670-3p 的核苷酸序列存在連續(xù)結合位點；starbase在線軟件預測顯示，miR-670-3p 與MARCH5 的3’UTR 存在連續(xù)的結合位點。共轉染miR-670-3p mimics 與WT-lncRNA ROR 或WT-MARCH5 的細胞熒光素酶活性均低于共轉染miR-NC 與WT-lncRNA ROR 或WTMARCH5 的細胞（P＜0.05），而共轉染miR-670-3p mimics 與MUT-lncRNA ROR 或MUT-MARCH5 的細胞熒光素酶活性與共轉染miR-NC 與MUT-lncRNA ROR或MUT-MARCH5的細胞熒光素酶活性比較差異均不顯著（P＞0.05）。si-ROR 組GC9811-P細胞中miR-670-3p表達水平顯著高于si-NC組（P＜0.05），pcDNA-ROR組GC9811-P細胞中miR-670-3p表達水平顯著低于pcDNA-NC 組（P＜0.05）。miR-670-3p組GC9811-P細胞中MARCH5蛋白表達水平顯著低于miR-NC 組（P＜0.05），anti-miR-670-3p 組GC9811-P細胞中MARCH5蛋白表達水平顯著高于anti-miR-NC組（P＜0.05），見圖6。

圖6 lncRNA ROR與miR-670-3p及miR-670-3p與MARCH5靶向關系驗證

2.7 上調MARCH5 降低舒尼替尼對GC9811-P 細胞增殖和凋亡的影響 與舒尼替尼+pcDNA-NC 組比較，舒尼替尼+pcDNA-MARCH5 組GC9811-P 細胞活力和CyclinD1 蛋白水平升高（P＜0.05），凋亡率和Cleaved-caspase-3 蛋白水平降低（P＜0.05），見圖7。

圖7 上調MARCH5降低舒尼替尼對GC9811-P細胞增殖和凋亡的影響

3 討論

舒尼替尼是一類新型的吲哚類多靶點酪氨酸激酶抑制劑，已被用于治療晚期腎癌及對伊馬替尼抵抗的胃腸道間質瘤[8]。此外，舒尼替尼在乳腺癌、非小細胞肺癌等腫瘤中表現出明顯的抗腫瘤作用[9-10]。本研究結果顯示，舒尼替尼可降低胃癌GC9811-P細胞的增殖能力且加劇GC9811-P細胞凋亡，這提示其可能具有抗胃癌的作用。CyclinD1是細胞周期相關蛋白，調節(jié)細胞通過G1/S 期檢查點，其表達增加可促進細胞增殖[11]。Caspase-3 是caspase 級聯反應的關鍵調控分子，其活化后剪切下游分子，進而誘導細胞凋亡[12]。本研究顯示，舒尼替尼作用抑制胃癌GC9811-P 細胞中CyclinD1 蛋白表達，而促進Cleaved-caspase-3蛋白表達，進一步從蛋白水平說明舒尼替尼可抑制胃癌細胞增殖，并促進細胞凋亡，具有一定抗胃癌作用。

lncRNA 在真核生物中廣泛存在，參與調控細胞的增殖、凋亡和侵襲等生命過程[13]。研究顯示，lncRNA ROR 在結直腸癌細胞中呈高表達，其可競爭性結合miR-223-3p，增強了結直腸癌細胞的增殖和侵襲能力；LncRNA ROR通過促進Notch1蛋白表達促進子宮內膜癌細胞增殖，并阻礙細胞凋亡；LncRNA-ROR 在卵巢癌組織中的表達明顯高于正常卵巢組織，且其高表達與患者臨床分期和分化程度呈正相關，過表達lncRNA ROR 通過靶向miR-145上調FLNB表達促進卵巢癌細胞遷移、侵襲及上皮-間質轉化[14-16]。本研究結果顯示，下調lncRNA ROR表達可抑制GC9811-P 細胞增殖并誘導其凋亡，這提示lncRNA ROR 在胃癌的發(fā)展中起促癌基因作用，其有可能成為胃癌治療的分子靶點；此外，舒尼替尼對胃癌GC9811-P 細胞中l(wèi)ncRNA ROR 表達起抑制作用，進一步提示舒尼替尼可能通過下調lncRNA ROR表達發(fā)揮抗胃癌作用。

LncBase Predicted v.2 生物信息學軟件預測顯示，lncRNA ROR 與miR-670-3p 的核苷酸序列存在連續(xù)互補位點，這提示lncRNA ROR 可能靶向結合miR-670-3p，本研究利用雙熒光素酶報告基因實驗證實了這一結果。同時，上調GC9811-P 細胞中l(wèi)ncRNA ROR的表達抑制了miR-670-3p表達，而下調lncRNA ROR 表達則促進了miR-670-3p 的表達，進一步說明lncRNA ROR靶向結合并負調控miR-670-3p 表達，這也與舒尼替尼抑制胃癌GC9811-P 細胞中l(wèi)ncRNA ROR 表達而促進miR-670-3p 表達的結果一致。研究顯示，靶向抑制miR-670-3p的表達可促進肺腺癌細胞增殖和遷移，miR-670-3p作為抑癌基因參與肺癌發(fā)展進程[17]。本研究顯示，上調miR-670-3p 表達可抑制胃癌GC9811-P 細胞增殖，并促進細胞凋亡，提示miR-670-3p有可能成為抑制胃癌發(fā)生發(fā)展的分子靶點。

MARCH5 是一種線粒體外膜蛋白，屬于MARCH 家族成員。Starbase 生物信息學軟件預測顯示，miR-670-3p與MARCH5的核苷酸序列存在連續(xù)互補的位點，這提示MARCH5可能是miR-670-3p的靶基因。本研究利用雙熒光素酶報告基因實驗證實了MARCH5 是miR-670-3p 的靶基因，且上調miR-670-3p表達抑制GC9811-P細胞中MARCH5蛋白表達，而下調miR-670-3p 則促進MARCH5 蛋白表達。研究顯示，MARCH5 在宮頸癌、鼻咽癌和卵巢癌等腫瘤中表法上調，下調MARCH5降低了腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力[18-20]。但目前，MARCH5對胃癌細胞惡性生物學行為的影響還未知。本研究結果顯示，下調MARCH5 對胃癌GC9811-P 細胞增殖起抑制作用，而對其凋亡起促進作用，這提示通過采用一定措施降低MARCH5 表達有可能抑制胃癌的發(fā)展進程。本研究還結果顯示，舒尼替尼可抑制胃癌GC9811-P 細胞中MARCH5 表達，而上調MARCH5表達逆轉了舒尼替尼對GC9811-P細胞增殖和凋亡的影響，提示舒尼替尼通過下調細胞中MARCH5表達抑制GC9811-P細胞增殖及誘導其凋亡。

綜上所述，舒尼替尼可有效抑制胃癌細胞增殖并誘導細胞凋亡，其作用機制與調控lncRNA ROR/miR-670-3p/MARCH5軸有關。