葉星，陳繼軍，王建鋒，安晨，宋蘭蘭，李曉進(jìn)，毛曉燕

蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司，甘肅 蘭州 730030

單克隆抗體藥物作為生物技術(shù)藥物，對(duì)多種復(fù)雜的疾病如腫瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病等的治療具有重要作用［1］，其市場(chǎng)潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值巨大。由于抗體藥物的臨床治療劑量較大且治療周期較長(zhǎng)［2］，其工業(yè)化生產(chǎn)的規(guī)模和效率將最終決定其產(chǎn)業(yè)化的成敗?；谏锓磻?yīng)器的動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)和抗體質(zhì)量分析已成為我國(guó)抗體藥物產(chǎn)業(yè)化的主要限制因素。

細(xì)胞培養(yǎng)基決定了細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境和理化特性，許多研究表明，培養(yǎng)基的成分組成可顯著影響細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝、蛋白產(chǎn)量、產(chǎn)品質(zhì)量等［3-7］。培養(yǎng)基的優(yōu)化策略應(yīng)針對(duì)最終產(chǎn)品、生產(chǎn)細(xì)胞及生產(chǎn)工藝的類型進(jìn)行綜合考慮［8］。

目前國(guó)內(nèi)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)仍以使用進(jìn)口商業(yè)培養(yǎng)基為主，這些培養(yǎng)基的具體組分一般不會(huì)公開(kāi)，使得培養(yǎng)基的篩選與優(yōu)化在早期即面臨許多困難［9］。由于對(duì)所使用的培養(yǎng)基成分未知，一旦出現(xiàn)抗體質(zhì)量問(wèn)題便無(wú)從優(yōu)化，特別對(duì)于生物仿制藥的開(kāi)發(fā)，抗體質(zhì)量的一致性顯得尤為重要。因此，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基及其關(guān)鍵組分的研發(fā)及細(xì)胞培養(yǎng)工藝的優(yōu)化，對(duì)于實(shí)現(xiàn)抗體藥物低成本、高效率的生產(chǎn)具有重大意義。本研究旨在對(duì)抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體工程細(xì)胞株CHO-K1-G2的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選和優(yōu)化，以期促進(jìn)細(xì)胞株生長(zhǎng)及抗體表達(dá)，為最終建立經(jīng)濟(jì)高效的抗體藥物生產(chǎn)工藝奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體工程細(xì)胞株CHO-K1-G2由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司第五研究室構(gòu)建，宿主細(xì)胞來(lái)源于ATCC。

1.2 主要試劑及儀器 細(xì)胞培養(yǎng)基添加成分D（+）-半乳糖、L-天冬氨酸、?；撬?、L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-絲氨酸、L-甲硫氨酸、L-賴氨酸、L-纈氨酸、胸苷、抗壞血酸、腐胺、還原性谷胱甘肽、丙酮酸鈉、腺苷、乙醇胺、D-泛酸鈣、氯化膽堿、次黃嘌呤、L-精氨酸、卵磷脂購(gòu)自日本TCI公司，七水合硫酸鋅、檸檬酸鐵購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，所有添加物均用超純水配成母液，0.22μm微孔濾膜除菌過(guò)濾，4℃保存；胎牛血清、胰酶和10%Pluronic F68購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；谷氨酰胺、葡萄糖和HRP標(biāo)記的抗人Fc段抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；碳酸鹽、氯化鈉、硼酸和四硼酸鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；脫脂奶購(gòu)自美國(guó)BD公司；ELISA檢測(cè)試劑盒（洗液、底物A、底物B、終止液）由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司診斷試劑室提供；破傷風(fēng)抗毒素標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)破傷風(fēng)毒素均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；EP+Buffer、氨基偶聯(lián)試劑盒、CM5芯片等均購(gòu)自美國(guó)GE公司；NOVA多參數(shù)生化分析儀購(gòu)自美國(guó)NOVA公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)BALB／c小鼠，雌性，1.5～2月齡，體重17～19 g，由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司動(dòng)物室提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（甘）2017-0001。

1.4 無(wú)血清培養(yǎng)基基本信息 試驗(yàn)中選擇的初篩培養(yǎng)基信息見(jiàn)表1。所有粉末培養(yǎng)基均用超純水配制，0.22μm微孔濾膜除菌過(guò)濾，4℃保存。

1.5 無(wú)血清培養(yǎng)基的篩選 針對(duì)本試驗(yàn)中所用CHOK1-G2細(xì)胞株，應(yīng)用批式培養(yǎng)（batch）模式，對(duì)表1中9種商業(yè)無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，以該細(xì)胞株目前正在使用的培養(yǎng)基D作為對(duì)照。各培養(yǎng)基所含的葡萄糖濃度均在5 g／L以上，使用前均添加一定的谷氨酰胺，以保證細(xì)胞能夠快速適應(yīng)新培養(yǎng)基。

表1 商業(yè)無(wú)血清培養(yǎng)基使用說(shuō)明Tab.1 Instructions of commercial serum-free medium

無(wú)血清懸浮馴化后的細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞活率達(dá)98%以上，且大小均勻、無(wú)明顯結(jié)團(tuán)時(shí)，接種至50 mL TPP管中，細(xì)胞密度為0.5×106cells／mL，工作體積20～25 mL，于37℃，5%CO2，220 r／min的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度、活率及各代謝參數(shù)（葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸等）。培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，4℃保存。

初步篩選主要評(píng)價(jià)指標(biāo)為細(xì)胞密度、活率、生長(zhǎng)狀態(tài)及培養(yǎng)時(shí)間，進(jìn)一步篩選評(píng)價(jià)指標(biāo)為抗體表達(dá)量、細(xì)胞密度、細(xì)胞活率及各代謝參數(shù)。

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)及培養(yǎng)基理化參數(shù)測(cè)定 使用NOVA多參數(shù)生化分析儀測(cè)定細(xì)胞密度、活率及細(xì)胞培養(yǎng)上清中各代謝參數(shù)（葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸等）。各新鮮培養(yǎng)基的成分參數(shù)由Cedex Bio Analyzer進(jìn)行測(cè)定（數(shù)據(jù)未列出）。

1.5.2 抗體表達(dá)量測(cè)定 采用ELISA法。將標(biāo)準(zhǔn)破傷風(fēng)毒素以5μg／mL包被于96孔酶標(biāo)板中，每孔100μL；次日經(jīng)脫脂奶4℃封閉過(guò)夜后，每孔加入100μL倍比稀釋的樣品，重復(fù)2孔，置37℃孵育1 h，同時(shí)設(shè)空白孔、陰性對(duì)照孔（加入樣品稀釋液）及陽(yáng)性對(duì)照孔（加入抗破傷風(fēng)毒素單抗標(biāo)準(zhǔn)品）；棄去孔內(nèi)液體，洗滌后每孔加入100μL HRP標(biāo)記的抗人Fc段抗體（1∶10 000稀釋），37℃孵育1 h；棄去孔內(nèi)液體，洗滌后依次加入底物溶液A與B各50μL，37℃避光孵育20 min；每孔加入終止液50μL終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度值。

1.6 主要影響因子的篩選 以篩選出的培養(yǎng)基為平臺(tái)，細(xì)胞抗體表達(dá)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Plackett-Burman試驗(yàn)對(duì)23種培養(yǎng)基添加因子進(jìn)行篩選，分析23種添加因子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的影響。試驗(yàn)依據(jù)Minitab軟件所設(shè)計(jì)的矩陣進(jìn)行，每行代表1個(gè)試驗(yàn)（一種培養(yǎng)基），每列代表1個(gè)單獨(dú)的變量（添加因子），1和-1分別代表每個(gè)試驗(yàn)中各個(gè)變量的高低水平。試驗(yàn)包括3個(gè)中心點(diǎn)，用來(lái)驗(yàn)證試驗(yàn)的重復(fù)性與結(jié)果的可靠性，0表示高水平與低水平的均值。各因子代碼及添加水平見(jiàn)表2。

表2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)的因子及濃度Tab.2 Factorsand their concentrationsof Plackett-Burman design

1.7 目的蛋白的表達(dá)與純化 將細(xì)胞從250 mL搖瓶逐步轉(zhuǎn)移至1 000 mL搖瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)（3～4）×106cells／mL，且細(xì)胞活率在98%以上時(shí)，開(kāi)始fed-batch培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)液中葡萄糖濃度低于2 g／L時(shí)，補(bǔ)加至6～8 g／L；谷氨酰胺濃度低于2 mmol／L時(shí)，按照培養(yǎng)體積的2%補(bǔ)加（谷氨酰胺濃度為50 mmol／L）。培養(yǎng)結(jié)束后，采用ELISA法檢測(cè)抗體表達(dá)量。將上述細(xì)胞培養(yǎng)收獲液離心并收集上清，超濾濃縮后用Mabselect Sure介質(zhì)進(jìn)行親和純化，獲得目的蛋白。

1.8 抗體效價(jià)測(cè)定 應(yīng)用破傷風(fēng)抗毒素效價(jià)測(cè)定法（小鼠試驗(yàn)法）。將破傷風(fēng)毒素用硼酸鹽緩沖液稀釋至每1 mL含5個(gè)試驗(yàn)量，即與抗毒素等量混合后，每0.4 mL注射量中含1個(gè)試驗(yàn)量。破傷風(fēng)抗毒素標(biāo)準(zhǔn)品用硼酸鹽緩沖液稀釋至每1 mL含0.5 IU，即與毒素等量混合后，每0.4 mL注射量中含1／10 IU，抗毒素標(biāo)準(zhǔn)品原倍溶液的1次吸取量應(yīng)不低于0.5 mL。將供試品用硼酸鹽緩沖液稀釋成若干個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度間隔約5%。

在稀釋后的抗毒素標(biāo)準(zhǔn)品及不同稀釋度的供試品中分別加入等量的稀釋毒素溶液，混勻，37℃結(jié)合1 h，立即經(jīng)小鼠腹部或大腿根部皮下注射0.4 mL，標(biāo)準(zhǔn)品與供試品每個(gè)稀釋度各注射小鼠5只，連續(xù)觀察5 d，記錄小鼠發(fā)病與死亡情況。結(jié)果判定：對(duì)照小鼠應(yīng)于72～120 h內(nèi)全部死亡，供試品效價(jià)為與對(duì)照組小鼠同時(shí)死亡或出現(xiàn)破傷風(fēng)神經(jīng)毒癥狀最重者的最高稀釋濃度。

1.9 抗體親和常數(shù)測(cè)定 采用表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)測(cè)定破傷風(fēng)類毒素與CHO-K1-G2細(xì)胞培養(yǎng)所得抗體的親和常數(shù)。先用氨基偶聯(lián)法將抗人IgG1 Fc抗體偶聯(lián)在CM5芯片上，然后用該抗體捕獲一定量的目的蛋白，再將梯度濃度的破傷風(fēng)類毒素相繼流過(guò)目的蛋白表面，記錄傳感圖譜。利用隨機(jī)軟件BIAevalution對(duì)不同破傷風(fēng)類毒素濃度下的各條結(jié)合曲線進(jìn)行分析，計(jì)算目的蛋白對(duì)破傷風(fēng)類毒素的親和常數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 無(wú)血清培養(yǎng)基的初步篩選 CHO-K1-G2細(xì)胞株在9種商業(yè)無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行batch培養(yǎng)，從細(xì)胞密度、生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞活率、培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)等因素進(jìn)行選擇，確定2、3、6、7號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)入下一輪篩選，見(jiàn)表3。

表3 9種無(wú)血清培養(yǎng)基的初步篩選結(jié)果Tab.3 Preliminary screening of nine serum-free media

2.2 無(wú)血清培養(yǎng)基的進(jìn)一步篩選

2.2.1 抗體表達(dá)量、細(xì)胞密度及細(xì)胞活率分析 CHOK1-G2細(xì)胞在2號(hào)培養(yǎng)基中的抗體表達(dá)量最高，同廠家的3號(hào)培養(yǎng)基抗體表達(dá)量相對(duì)較低，細(xì)胞密度及活率也略低；6號(hào)、7號(hào)培養(yǎng)基最大細(xì)胞密度較高，但7號(hào)培養(yǎng)基的細(xì)胞活率下降相對(duì)較快，培養(yǎng)時(shí)間短；對(duì)照組細(xì)胞密度、活率及培養(yǎng)時(shí)間均低于各試驗(yàn)組。見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 CHO-K1-G2細(xì)胞在5種無(wú)血清培養(yǎng)基中的抗體表達(dá)量Fig.1 Antibody expression levels of CHO-K1-G2 cells in five serum-free media

圖3 CHO-K1-G2細(xì)胞在5種無(wú)血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞活率Fig.3 Viabilities of CHO-K1-G2 cells in five serum-free media

2.2.2 細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)代謝分析

2.2.2.1 葡萄糖濃度變化 整個(gè)batch培養(yǎng)過(guò)程中不同培養(yǎng)基中葡萄糖濃度均趨于下降。2、3、7號(hào)培養(yǎng)基趨勢(shì)相似，細(xì)胞對(duì)葡萄糖消耗較快，其濃度在第8天降至最低點(diǎn)，此時(shí)正好達(dá)到最大細(xì)胞密度，之后細(xì)胞密度和活率均開(kāi)始下降，表明葡萄糖對(duì)這些培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長(zhǎng)及蛋白生產(chǎn)具有較大影響；6號(hào)和D培養(yǎng)基趨勢(shì)一致，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞持續(xù)緩慢消耗葡萄糖，表明細(xì)胞生長(zhǎng)及蛋白生產(chǎn)可能還依賴于其他的能源物質(zhì)。見(jiàn)圖4。

圖4 5種無(wú)血清培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的變化Fig.4 Changes of glucose concentration in five serum-free media

2.2.2.2 乳酸濃度變化 2、3、7號(hào)培養(yǎng)基在batch培養(yǎng)第6天后，乳酸濃度呈下降趨勢(shì)，表明因葡萄糖濃度下降，細(xì)胞開(kāi)始攝取乳酸以維持自身生長(zhǎng)與蛋白生產(chǎn)；6號(hào)和D培養(yǎng)基中乳酸呈緩慢累積的過(guò)程，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，乳酸濃度均大于2.5 g／L，表明該培養(yǎng)基中細(xì)胞并不能主動(dòng)攝取乳酸作為能源物質(zhì)，且乳酸的累積也會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及蛋白生產(chǎn)產(chǎn)生不利影響。見(jiàn)圖5。

圖5 5種無(wú)血清培養(yǎng)基中乳酸濃度的變化Fig.5 Changes of lactic acid concentration in five serumfree media

2.2.2.3 谷氨酰胺濃度變化 2、3號(hào)培養(yǎng)基中細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的消耗較緩慢，在第8天降至1.80 mmol／L，此后一直維持該濃度至培養(yǎng)結(jié)束，表明細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的利用率較低；6、7號(hào)培養(yǎng)基中谷氨酰胺在第4天即低于1.5 mmol／L（由于這6種培養(yǎng)基中谷氨酰胺初始含量較低，均已預(yù)先補(bǔ)加2%50 mmol／L谷氨酰胺），表明細(xì)胞生長(zhǎng)消耗了大量谷氨酰胺；D培養(yǎng)基中谷氨酰胺的水平一直為0.00 mmol／L，表明該培養(yǎng)基中細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的需求量非常大。見(jiàn)圖6。

圖6 5種無(wú)血清培養(yǎng)基中谷氨酰胺濃度的變化Fig.6 Changes of glutamine concentrations in five serumfree media

通過(guò)對(duì)以上數(shù)據(jù)的分析，2號(hào)培養(yǎng)基中細(xì)胞的蛋白產(chǎn)量較高，細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，最終確定2號(hào)培養(yǎng)基作為后續(xù)優(yōu)化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在后續(xù)優(yōu)化過(guò)程中，應(yīng)考慮促進(jìn)細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的利用，以進(jìn)一步提高細(xì)胞密度，同時(shí)注意氨的累積及滲透壓的變化。

2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)（D es i g n o f E x pe r im e nt s，D O E）優(yōu)化無(wú)血清培養(yǎng)基

2.3.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選主要影響因子以細(xì)胞的抗體表達(dá)量作為響應(yīng)值，Plackett-Burman設(shè)計(jì)用27次試驗(yàn)考察了23種化合物對(duì)蛋白表達(dá)的影響，Minitab軟件設(shè)計(jì)的試驗(yàn)矩陣及結(jié)果見(jiàn)表4，各種因子的濃度及對(duì)蛋白生產(chǎn)的影響見(jiàn)表5，抗體表達(dá)量范圍為53.90～222.42 mg／L。對(duì)于該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，自由度?4，相關(guān)系數(shù)R-Sq為99.60%，F(xiàn)=20.82，P=0.047＜0.05，表明此模型具有顯著性。P＜0.05的因子則具有顯著性影響。效應(yīng)參數(shù)為正，表明因子對(duì)響應(yīng)值有積極作用；參數(shù)為負(fù)，表明因子對(duì)響應(yīng)值有消極作用。乙醇胺、次黃嘌呤、卵磷脂、天冬氨酸、檸檬酸鐵及?；撬岬腜＜0.05，且效應(yīng)參數(shù)為正值，表明它們對(duì)蛋白表達(dá)具有顯著正影響作用，可作為培養(yǎng)基的添加物；效應(yīng)參數(shù)越大，影響越顯著，按照影響作用大小依次為次黃嘌呤、牛磺酸、乙醇胺、卵磷脂、檸檬酸鐵和天冬氨酸。但需注意的是，Plackett-Burman設(shè)計(jì)并不能反應(yīng)變量之間的相互作用。

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)矩陣及響應(yīng)值Tab.4 Plackett-Burman matrix of experimental design and responses

表5 Plackett-Burman篩選統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表Tab.5 Plackett-Burman screening variance table

2.3.2 Minitab軟件得到最優(yōu)值 篩選出具有顯著影響的因子后，用優(yōu)化設(shè)計(jì)方法確定響應(yīng)值的最優(yōu)值及各因子的最優(yōu)組合。Minitab提供了一種優(yōu)化方法，可通過(guò)試驗(yàn)分析給出輸出變量的最優(yōu)值及其對(duì)應(yīng)的各試驗(yàn)因素的最優(yōu)組合。此次優(yōu)化的主要對(duì)象為細(xì)胞表達(dá)量，優(yōu)化的目的是得到最大響應(yīng)值，以Plackett-Burman設(shè)計(jì)中所得到的響應(yīng)值范圍53.90～222.42 mg／L分別作為優(yōu)化的下限與目標(biāo)值，響應(yīng)上限不設(shè)限，權(quán)重：1，重要度：1。軟件計(jì)算得到的結(jié)果見(jiàn)表6，此為各因素的最優(yōu)組合；同時(shí)得到細(xì)胞表達(dá)量最優(yōu)擬合值238.22 mg／L。

表6 各因素最優(yōu)組合表Tab.6 Optimization of various factors and levels

2.4 抗體表達(dá)量 應(yīng)用篩選出的2號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行fed-batch擴(kuò)大培養(yǎng)，最終收獲液中抗體表達(dá)量為124 mg／L。

2.5 抗體效價(jià) 對(duì)照組小鼠死亡時(shí)間為96 h，表明試驗(yàn)結(jié)果成立。CHO-K1-G2細(xì)胞培養(yǎng)所得抗體效價(jià)為500 IU／mg。

2.6 抗體親和常數(shù) 破傷風(fēng)類毒素與抗體的梯度結(jié)合曲線見(jiàn)圖7。以“1：1 Binding”的分析模塊進(jìn)行計(jì)算，得到的動(dòng)力學(xué)常數(shù)分別為：ka（1／Ms）=2.15×105，kd（1／s）=2.85×10-4，因此，親和常數(shù)Ka=ka／kd=1.33×10-9／M。

圖7 破傷風(fēng)類毒素與抗體的梯度結(jié)合曲線Fig.7 Gradient binding curve of tetanus toxoid and antibody

3 討論

3.1 篩選培養(yǎng)基的考慮因素及細(xì)胞代謝分析 在培養(yǎng)基的初步篩選中，所參考的主要指標(biāo)是最大細(xì)胞密度、細(xì)胞活率變化及培養(yǎng)周期的長(zhǎng)短。進(jìn)一步篩選時(shí)，此時(shí)各培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況相近，因此增加了抗體產(chǎn)量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。同時(shí)根據(jù)培養(yǎng)基中一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及副產(chǎn)物的變化，分析細(xì)胞的代謝需求，選擇適合優(yōu)化的培養(yǎng)基。

在batch培養(yǎng)中，2號(hào)和3號(hào)培養(yǎng)基中細(xì)胞以葡萄糖為主要能源物質(zhì)，且葡萄糖不足時(shí)能主動(dòng)消耗副產(chǎn)物乳酸，減少了乳酸造成的不利影響，同時(shí)細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的消耗較少，副產(chǎn)物氨的產(chǎn)生較少，這可能是細(xì)胞活率及蛋白產(chǎn)量較高的原因；但細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)對(duì)谷氨酰胺的利用率較低可能導(dǎo)致其最大細(xì)胞密度相對(duì)較低；3號(hào)培養(yǎng)基的蛋白產(chǎn)量低可能與氨的產(chǎn)生或滲透壓等其他因素有關(guān)。

6號(hào)培養(yǎng)基中細(xì)胞消耗了大量的谷氨酰胺，最大細(xì)胞密度較高，但同時(shí)副產(chǎn)物氨的產(chǎn)生也較多；結(jié)合葡萄糖代謝發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗較少，且乳酸有一定程度累積，因此葡萄糖的利用率低及兩種副產(chǎn)物的累積可能對(duì)其蛋白產(chǎn)量影響較大。7號(hào)培養(yǎng)基中細(xì)胞對(duì)葡萄糖及谷氨酰胺的消耗均很大，且能夠主動(dòng)利用乳酸，最大細(xì)胞密度較高；但蛋白產(chǎn)量很低，表明該培養(yǎng)基中的細(xì)胞較蛋白生產(chǎn)而言，自身的生長(zhǎng)消耗了更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。D培養(yǎng)基中細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的消耗很大，表明氨的累積也較多，對(duì)葡萄糖的消耗相對(duì)較少，且乳酸輕度累積，其細(xì)胞密度及活率均較低，表明該培養(yǎng)基中細(xì)胞以谷氨酰胺為主要的能源物質(zhì)，且副產(chǎn)物累積及滲透壓等因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響較大。

葡萄糖和谷氨酰胺作為細(xì)胞重要的能源物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及蛋白生產(chǎn)具有顯著影響。它們的代謝副產(chǎn)物—乳酸和氨的過(guò)度累積，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及蛋白生產(chǎn)造成諸多不利影響，如滲透壓的升高、限制細(xì)胞的生長(zhǎng)及活率、改變單抗的糖基化修飾，甚至增加產(chǎn)品的降解等。WAHRHEIT等［10］研究了谷氨酰胺的利用與限制對(duì)CHO細(xì)胞生理的影響，發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺利用率的不同會(huì)導(dǎo)致整體代謝的改變。

減少乳酸累積有很多方法，如改造宿主細(xì)胞［11］；或用其他代謝較慢或乳酸產(chǎn)率較低的糖代替葡萄糖；添加銅離子也可降低乳酸的累積［12］。就大規(guī)模生產(chǎn)工藝來(lái)說(shuō)，可通過(guò)調(diào)控培養(yǎng)過(guò)程中的pH環(huán)境、CO2含量或攪拌速率等減少乳酸累積［13］。另一方面，在促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖有效利用的同時(shí)，如何促進(jìn)其對(duì)乳酸的消耗［14-15］，也是培養(yǎng)過(guò)程中需要考慮的問(wèn)題。

除了本試驗(yàn)中所提到的葡萄糖、谷氨酰胺外，培養(yǎng)基中氨基酸的含量也是影響細(xì)胞生長(zhǎng)與蛋白生產(chǎn)的重要因素。培養(yǎng)基中部分氨基酸（如天冬酰胺、絲氨酸等）過(guò)量時(shí)也會(huì)增加氨的累積，可在不影響細(xì)胞生長(zhǎng)及蛋白生產(chǎn)的前提下對(duì)培養(yǎng)基中氨基酸的組成進(jìn)行調(diào)控，以減少氨的產(chǎn)生［16］。

3.2 培養(yǎng)基優(yōu)化策略及蛋白產(chǎn)量的變化 本試驗(yàn)中所選擇的添加物及其試驗(yàn)濃度范圍，是查閱大量文獻(xiàn)后經(jīng)若干輪預(yù)試驗(yàn)確定的。Plackett-Burman篩選試驗(yàn)?zāi)軌驑O大地縮短試驗(yàn)時(shí)間，提高篩選效率，但前提是選擇合適的濃度范圍。此外，響應(yīng)值的選擇也很重要。剛開(kāi)始選擇最大細(xì)胞密度作為響應(yīng)，由于響應(yīng)值差異不大，未篩選到顯著因子。后改用抗體表達(dá)量作為響應(yīng)值，成功篩選到6種顯著性影響因子。本試驗(yàn)所得到的只是一個(gè)大概的濃度范圍，如需進(jìn)一步確定各因子準(zhǔn)確的添加濃度，還需結(jié)合最速上升法［17］及中心復(fù)合設(shè)計(jì)［18］等方法進(jìn)行多輪優(yōu)化。

培養(yǎng)基的進(jìn)一步篩選過(guò)程中，與對(duì)照培養(yǎng)基相比，CHO-K1-G2細(xì)胞在2號(hào)培養(yǎng)基中batch培養(yǎng)下的抗體表達(dá)量提高了3.8倍。Plackett-Burman設(shè)計(jì)的27組試驗(yàn)中，CHO-K1-G2細(xì)胞最高抗體表達(dá)量顯著提高，表明適宜的添加物可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)與表達(dá)。對(duì)于目的蛋白的表達(dá)，培養(yǎng)基的篩選只是一個(gè)方面，培養(yǎng)條件的變化也是重要因素，這在培養(yǎng)規(guī)模發(fā)生較大改變時(shí)尤為突出。因此，在進(jìn)行規(guī)模放大時(shí)，還需進(jìn)行培養(yǎng)工藝的優(yōu)化。