王思淵，張國林綜述，邢以文，楊純審校

1.蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州 215000；2.蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 兒科病研究所，江蘇 蘇州 215000

單克隆抗體類藥物（以下簡稱單抗類藥物）是一類以免疫球蛋白G（IgG）結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，由對稱的2條重鏈及2條輕鏈可變區(qū)組成抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可識別相應(yīng)特異抗原的大分子蛋白類藥物［1］。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，單抗類藥物制備技術(shù)日益完善，該類藥物在整個醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)的地位顯得日趨重要，越來越多的醫(yī)藥公司，尤其是國際性大公司，均在積極開展單抗類藥物的研發(fā)和生產(chǎn)［2-3］。目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food&Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)上市的單抗類藥物已有60余種，另有超過300種處于臨床試驗階段，主要應(yīng)用于腫瘤、自身免疫病、心血管疾病及感染性疾病等多種疾病的治療［4-7］。國內(nèi)大型醫(yī)藥企業(yè)在單抗類藥物的研發(fā)能力和生產(chǎn)產(chǎn)能正處于迅速提升中，其中以上海君實生物醫(yī)藥科技股份有限公司旗下的蘇州眾合生物醫(yī)藥科技有限公司、信達(dá)生物制藥（蘇州）有限公司、蘇州盛迪亞生物醫(yī)藥有限公司和百濟(jì)神州生物科技有限公司尤為突出。除了已上市的阿達(dá)木單抗、貝伐單抗、曲妥珠單抗及多款PD-1／PD-L1單抗類藥物外，以抗體藥物偶聯(lián)（antibody-drug conjugate，ADC）、雙特異性抗體（bispecific antibody）、免疫檢查點抗體（immune checkpoint inhibitor）為代表的新型單抗類藥物也是目前國內(nèi)外生物制藥公司研究的熱點［8-12］。單抗類藥物生產(chǎn)工藝及過程有別于傳統(tǒng)化學(xué)藥品，含有一些傳統(tǒng)工藝中沒有的雜質(zhì)，存在一定質(zhì)量風(fēng)險，因此其質(zhì)量控制要點及相應(yīng)的檢測方法與傳統(tǒng)化學(xué)藥品有較大差異。單抗類藥物質(zhì)量控制，尤其是雜質(zhì)分析具有復(fù)雜性和多樣性，有別于小分子藥物，需通過多個維度對其分子進(jìn)行表征分析才能確保其有效性、安全性和一致性［13］。因此，本文著重就單抗類藥物常用的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)規(guī)定、雜質(zhì)控制要點及相應(yīng)分析方法作一綜述，以期為該類藥物的生產(chǎn)研發(fā)企業(yè)及相關(guān)檢定單位提供參考。

1 單抗類藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)規(guī)定

目前，單抗類藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)規(guī)定主要參照《中國藥典》三部（2015版）［14］、《中國藥典》四部（2015版）［15］通則、WHO相關(guān)定義與要求、人用藥物注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會議（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH）對生物技術(shù)產(chǎn)品、生物制品及生物類似藥的相關(guān)規(guī)定［16-17］、FDA和《美國藥典》的相關(guān)技術(shù)指南［18］、歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）相關(guān)技術(shù)規(guī)范制定［19］。由于單抗類藥物是新型藥物，自2018年以來，雖國內(nèi)已有多家企業(yè)陸續(xù)上市多個單抗類藥物，但未被《中國藥典》收載，均參照上述法規(guī)及指導(dǎo)原則執(zhí)行各自注冊標(biāo)準(zhǔn)。

2 單抗類藥物的檢定

2.1 性狀與理化性質(zhì)檢定 單抗類藥物是經(jīng)細(xì)胞表達(dá)、純化，制劑工藝后獲得的。不同的制劑工藝、配方、存儲及運輸條件均會影響其分子間及分子內(nèi)部共價鍵和非共價鍵的形成或打開，從而改變單抗類藥物的性狀與理化性質(zhì)［20］。因此，單抗類藥物的性狀與理化性質(zhì)檢定是其質(zhì)量控制的必要環(huán)節(jié)，檢定項目主要包括外觀、復(fù)溶時間、裝量差異、pH、可見異物、澄清度、不溶性微粒、摩爾滲透壓、水分等［21］。目前，單抗類藥物的性狀與理化性質(zhì)檢定標(biāo)準(zhǔn)多參照《中國藥典》三部（2015版）［14］及《中國藥典》四部（2015版）［15］通則制定。

2.2 雜質(zhì)的控制要點及相應(yīng)分析技術(shù)

2.2.1 基于毛細(xì)管電泳技術(shù)（capillaryelectrophoresis，CE）的純度和雜質(zhì)分析 《中國藥典》四部（2015版）［15］通則0542表明，CE是一類以彈性石英毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力，根據(jù)分子電荷和分子質(zhì)量大小不同實現(xiàn)分離的新型分離技術(shù)，是電泳與色譜結(jié)合的產(chǎn)物。單抗類藥物是電荷異質(zhì)性和分子質(zhì)量相近的異種混合物，在產(chǎn)品生產(chǎn)及批放行過程均需確保其純度及完整性，且無不需要的修飾發(fā)生。CE由于具有快速、靈敏、可靠等優(yōu)勢，已成為單抗類藥物純度和雜質(zhì)分析中的必備技術(shù)［22-24］。在CE的多種分離模式中，依靠等電點分離的毛細(xì)管等電聚焦成像電泳（imaged capillary isoelectric focusing，iCIEF）、依靠電荷／質(zhì)量比分離的毛細(xì)管區(qū)帶電泳（capillary zone electrophoresis，CZE）和依靠相對分子質(zhì)量大小分離的毛細(xì)管凝膠電泳（capillary gel electrophoresis，CGE）是單抗類藥純度和雜質(zhì)分析中最常用的3種模式。

單抗類藥物分子的修飾，如糖基的唾液酸化、谷氨酸環(huán)化、二硫鍵的氧化等均會影響抗體的電荷異質(zhì)性及等電點［25］。iCIEF中電解質(zhì)溶液形成pH梯度，各組分遷移至各自等電點時變?yōu)橹行孕纬蓷l帶，給出蛋白質(zhì)電荷異質(zhì)性分布的信息。iCJEF在單抗類藥物純度和雜質(zhì)分析中主要用于等電點的鑒定與電荷異質(zhì)性的檢查。與傳統(tǒng)平板凝膠電泳比較，iCIEF具有耗時短、樣品用量少、分辨率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。2017年，GOYON等［26］用iCIEF測定了23種治療性單抗的等電點，發(fā)現(xiàn)實驗檢測值與等電點計算理論值的相關(guān)性較好。

CZE中各組分根據(jù)各自的電泳流和電滲流按陽離子（酸性峰）、中性粒子（主峰）和陰離子（堿性峰）的順序通過檢測器。CZE在單抗類藥物純度和雜質(zhì)分析中主要用于電荷異質(zhì)性的檢查。與iCIEF法比較，CZE用于電荷異質(zhì)性分析更快速［27］。同時，由于CZE所用緩沖液的紫外吸收低，可采用214 nm波長紫外檢測，比采用280 nm檢測的iCIEF具有更高的靈敏度［28］。CZE用于電荷異質(zhì)性分析的另一個優(yōu)勢在于其易于與質(zhì)譜檢測器連接，可為電荷變異體的結(jié)構(gòu)分析鑒定提供重要信息［29-30］。

目前，應(yīng)用于單抗類藥物還原和非還原性純度分析（大小異質(zhì)性）和N寡糖分析的CGE，由于樣品蛋白質(zhì)與十二烷基硫酸鈉（SDS）結(jié)合形成復(fù)合物，這種模式也被稱為SDS無膠篩分毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis-SDS，CE-SDS）。與SDS-PAGE比較，CESDS更快捷，耐用性更好，精密度及分辨率更高，且無拖尾峰、樣品殘留少、線性和重復(fù)性較高［31］。由于CE-SDS檢測無需對結(jié)果進(jìn)行二次處理，其結(jié)果較SDS-PAGE更準(zhǔn)確、穩(wěn)定、客觀，且CE-SDS法能將非糖基化重鏈與重鏈分離后對非糖基化重鏈進(jìn)行定量分析［32］。目前，CE-SDS主要采用紫外檢測和激光誘導(dǎo)熒光檢測兩種檢測方法。GUO等［33］報道，利用激光誘導(dǎo)熒光檢測器檢測痕量雜質(zhì)的靈敏度更高。

近年，CE法開始涉及探索單抗類藥物糖基分析領(lǐng)域，通過N糖苷酶F對單抗N糖進(jìn)行酶切，再對酶切的N糖進(jìn)行標(biāo)記衍生，采用毛細(xì)管電泳結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光檢測器（capillary electrophoresis-laser induced fluorescence，CE-LIF）進(jìn)行測定。與經(jīng)典液相技術(shù)分析方法比較，CE-LIF的N糖標(biāo)記前處理僅需1h，具有分析快速簡便的優(yōu)勢［34］。同時，SHEN等［35］報道，可采用毛細(xì)管凝膠電泳結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光檢測器（capillary gel electrophoresis-laser induced fluorescence，CGE-LIF）技術(shù)分析宿主細(xì)胞殘留DNA（host cell DNA，HCD）的分布。該方法的檢測靈敏度明顯高于ELISA法，其檢測限低至6.25 ng／μL，定量限低至25 ng／μL。CE-LIF對酶切產(chǎn)物分離度高，在傳統(tǒng)瓊脂糖凝膠法有7個條帶的情況下，CE-LIF獲得了8個峰，且小于15 000 bp的片段分離度大于1.46，且其重復(fù)性也更好，遷移時間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜0.35%，校正峰面積百分比均＜5.65%［36］。

2.2.2 基于高效液相色譜技術(shù)（high performance liquid chromatography，HPLC）的純度和雜質(zhì)分析 作為現(xiàn)代藥品檢測的常用技術(shù)，在眾多類型HPLC中，反相色譜（reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）、分子排阻色譜（size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography，SEC-HPLC）和離子交換色譜（ion exchange chromatography-high performance liquid chromatography，IEC-HPLC）已成為單抗類藥物不同方面質(zhì)量檢定的常用技術(shù)手段。

RP-HPLC主要用于單抗類藥物的肽圖檢查，《中國藥典》四部（2015版）［15］通則3405表明，通過胰蛋白酶裂解單抗類藥物，形成肽段，采用RPHPLC分析鑒定其一級結(jié)構(gòu)的完整性和準(zhǔn)確性。肽圖是蛋白質(zhì)及其酶解產(chǎn)物的指紋圖譜，是單抗類藥物質(zhì)量控制和放行的必行檢測。該項檢測可監(jiān)控單個氨基酸的突變、氧化、去酰胺化，也能檢測單抗類藥物N-末端環(huán)化、C-末端賴氨酸處理、N-糖基化等一系列非預(yù)期的表達(dá)變異［25］。肽圖分析包含4個主要步驟：蛋白的分離純化、選擇性酶切、多肽的色譜分離、多肽的分析和鑒定。肽圖分析應(yīng)得到足夠的肽段和盡可能高的覆蓋度以進(jìn)行有效的分析［37］，但該方法并未將二硫鍵還原處理成還原狀態(tài)自由巰基的預(yù)處理步驟收錄其中，如缺失上述步驟，采用胰蛋白酶裂解單抗類藥物幾乎得不到裂解峰［38］。對于采用紫外檢測器的RP-HPLC肽圖分析，最重要的是具有足夠大的分離度，以分離所有的組分峰，使用小粒徑的長柱及超高效液相色譜系統(tǒng)（ultra performance liquid chromatography，UPLC）可大幅提高分離效率和速度。

《中國藥典》四部（2015版）［15］通則0514表明，SEC-HPLC可通過分子篩原理將蛋白質(zhì)按多聚體、二聚體、單體及某些情況下出現(xiàn)的片段等小分子順序分離，依次通過檢測器。因此SEC-HPLC廣泛應(yīng)用于單抗類藥物聚合物的檢測，是目前常用的質(zhì)控及放行檢測方法。SEC-HPLC可定量，二聚體和聚集體的分離度較高，分析時間較短，且操作簡單，可收集流分進(jìn)行進(jìn)一步分析［39］。在SEC-HPLC分離中，樣品將在1個柱體積內(nèi)通過等度分離洗脫，因此，進(jìn)樣器、管路和檢測器體積在內(nèi)的液相系統(tǒng)總體積會影響分離效果。通常，與柱體積相關(guān)的液相系統(tǒng)總擴(kuò)散體積越小，峰型越窄，分離效果越好。GOYON等［40］發(fā)現(xiàn)，使用小粒徑（3μm）色譜柱比使用傳統(tǒng)5μm粒徑色譜柱可獲得更高的流速，且不影響分離度與柱效。隨后，RICHARD等［41］報道也表明，除使用更合理的流動性pH之外，更小粒徑的SEC-HPLC色譜柱能提供更好的分離度與更快的分離速度。

IEC-HPLC是考察單抗類藥物電荷異質(zhì)性的另一種手段，與CE比較，操作更簡單，且能檢測蛋白分子表面電荷分布差異的優(yōu)勢［26］。弱陽離子交換色譜柱常用于測定單抗類藥物存在的酸性電荷異構(gòu)體（先于主峰出峰）與堿性電荷異構(gòu)體（晚于主峰出峰）。這些電荷異構(gòu)體多為主峰蛋白糖基化和去酰胺化的產(chǎn)物，但其有限的分辨率無法將各雜質(zhì)精確分離，該缺點也限制了其在單抗類藥物質(zhì)量控制領(lǐng)域更深入地應(yīng)用［42］。

隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在單抗類藥物質(zhì)量控制領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。四極桿-飛行時間（quadrupole time-offlight，QTof）高分辨質(zhì)譜、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption／ionization time-offlight mass spectrometry，MALDI-Tof-MS）及結(jié)合了高選擇性四極桿離子過濾與Orbitrap高分辨準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)技術(shù)的QE高分辨質(zhì)譜，在完整蛋白、肽圖分析、寡糖分析、蛋白定量、蛋白測序等單抗類藥物質(zhì)量控制領(lǐng)域具有明顯優(yōu)勢，見表1［43-48］。

表1 質(zhì)譜技術(shù)在單抗類藥物質(zhì)控領(lǐng)域中的應(yīng)用Fig.1 Application of mass spectrometry for quality control of monoclonal antibody drugs

另外，親水作用液相色譜（hydrophilic interaction liquid chromatography-high performance liquid chromatography，HILIC-HPLC）配以熒光檢測器（fluorescence detector，F(xiàn)LD）或電噴霧檢測器（corona chaged aerosol detection，CAD）也在單抗類藥物相關(guān)質(zhì)量控制方面發(fā)揮著重要作用，如寡糖鏈分析與工藝中引入的表面活性劑與藥用輔料檢測等［49-50］。隨著多維液相色譜技術(shù)的發(fā)展，二維液相色譜（two dimensionalhigh performance liquid chromatography，2D-HPLC）可將樣品中難分離、需富集的雜質(zhì)分離或富集用于與質(zhì)譜、紅外和核磁共振等的聯(lián)用分析中，在單抗類藥物雜質(zhì)分離與鑒定等分析中發(fā)揮著越來越重要的作用［51］，如VANHOENACKER等［52］采用2D-HPLC與QTof高分辨質(zhì)譜聯(lián)用分析經(jīng)處理和未經(jīng)處理的曲妥單抗酶解物，結(jié)果表明，采用HILIC的第一維液相與采用RPLC的第二維液相在兩個維度間提供了良好的正交性，2D-HPLC與高分辨質(zhì)譜的結(jié)合在肽圖詳細(xì)分析方面具有較大潛力。

2.2.3 細(xì)胞殘留雜質(zhì)分析 單抗類藥物除了進(jìn)行常規(guī)的無菌試驗、異常毒性、熱源試驗、內(nèi)毒素等安全性檢查外，其生產(chǎn)過程中HCP、DNA及純化過程使用的親和色譜蛋白A（Protein A）等工藝雜質(zhì)殘留量也需進(jìn)行嚴(yán)格控制［53］。這些由生產(chǎn)過程引入的殘留雜質(zhì)不僅影響產(chǎn)品的效價，還可能在不同程度上引起機(jī)體的免疫應(yīng)答，最終引起過敏反應(yīng)或毒性、免疫原性、致癌性等嚴(yán)重的安全性問題［54］。

美國FDA規(guī)定，用一種靈敏度較高的方法檢測藥品的HCP，其含量應(yīng)低于檢測限（通常＜100 ppm）［18］；《中國藥典》三部（2015版）［14］規(guī)定，CHO細(xì)胞HCP占總蛋白含量的0.05%以下［14］。雖然目前國際上針對HCP的殘留限度尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但ELISA法是與國際接軌的常用單抗類藥物HCP及Protein A殘留的檢測方法，也是目前《生物制品質(zhì)量控制分析方法驗證技術(shù)審評一般原則》中推薦的檢測方法［55］，但ELISA法在《中國藥典》四部（2015版）［15］通則并未收載［15］。另外，質(zhì)譜檢測在HCP定量也有所應(yīng)用，BOMANS［56］使用Orbitrap高分辨質(zhì)譜監(jiān)控純化過程中的HCP含量變化，并在最終藥物中鑒定到多種低豐度的HCP，對純化方法的優(yōu)化具有重要的參考意義。

WHO及國內(nèi)外藥物監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求，CHO宿主細(xì)胞DNA殘留量應(yīng)不高于10 pg。《美國藥典》（USP41-NF36版）［57］指出，定量PCR法（q-PCR）的適用性較其他檢測方法更好。q-PCR法對樣品的前期處理要求較高，但我國尚未建立統(tǒng)一的國家藥品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)核酸信息平臺和DNA殘留量標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，單抗類藥物中CHO宿主細(xì)胞殘留DNA的檢測均由各生產(chǎn)廠家自行檢測。宿主細(xì)胞DNA殘留國內(nèi)外常用的q-PCR法在《中國藥典》四部（2015版）［15］通則中也未收載。

3 展望

隨著單抗類藥物研究的深入及分析技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)量源于設(shè)計（quality by design，QbD）質(zhì)量控制理念的推廣，單抗類藥物雜質(zhì)分析正向自動化、高特異性、高準(zhǔn)確度、高靈敏度、微型化及高通量實時快速檢測的方向發(fā)展［41］，如芯片實驗室（Lab-On-Chip）技術(shù)在雜質(zhì)殘留檢測領(lǐng)域不斷發(fā)展與探索［58］；自動化處理平臺高通量蛋白純化、酶解、脫鹽、多肽分級、糖鏈富集等自動化流程日趨成熟［59］；高分辨質(zhì)譜（high resolution mass spectrometry，HRMS）定性定量技術(shù)在過程開發(fā)及批放行中的逐漸普及［40］。這些分析技術(shù)的發(fā)展正推動著越來越多的新技術(shù)、新方法在單抗類藥物雜質(zhì)分析領(lǐng)域得到應(yīng)用。同時，隨著單抗類藥物的臨床應(yīng)用，出現(xiàn)了越來越多的不良反應(yīng)，對引起這些不良反應(yīng)的相關(guān)雜質(zhì)的深入研究將對單抗類藥物的有效性、安全性和一致性的提升起到推動作用。