喬瑞紅，韓海陽，張小寧，馮彥

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，山西 太原 030001

塵螨屬于節(jié)肢動物門、蛛形綱、廣腹亞綱的微型動物。有研究表明，屋塵螨（Der-matphagoides）、戶塵螨（Dermatophagoides pteronyssinus）等塵螨種屬可引起人類嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。早在1967年，生物學(xué)家VOORHORST等［1］就研究證實了粉塵螨和戶塵螨可引起過敏性鼻炎、支氣管哮喘、過敏性皮炎等多種變態(tài)反應(yīng)性疾病，是室內(nèi)主要過敏原。據(jù)調(diào)查表明，全球?qū)m螨過敏的人口約占10%，由塵螨引起的外源性哮喘占比達(dá)80%［2-4］。目前，診療指南把變應(yīng)原特異性免疫治療（specific immunotherapy，SIT）作為變應(yīng)性疾病的一線治療手段［5］，是可能改變過敏性疾病自然進(jìn)程的唯一治療方式。SIT可明顯減輕甚至完全緩解患者癥狀，減少（或停用）對癥用藥；同時減少疾病的復(fù)發(fā)且有長期效果，可預(yù)防疾病發(fā)展（如過敏性鼻炎進(jìn)展成為哮喘）；預(yù)防新過敏性疾病的發(fā)生；總體降低家庭和社會在過敏性疾病方面的支出，改善患者生活質(zhì)量。目前臨床用于塵螨的SIT多采用天然粗塵螨提取液，但天然塵螨提取液成分復(fù)雜，可能造成高敏體質(zhì)患者嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，而重組塵螨可彌補(bǔ)此缺點(diǎn)［6］。

近幾十年里，分子免疫學(xué)技術(shù)和生物信息技術(shù)發(fā)展迅速，細(xì)胞表位在線檢測軟件功能不斷更新，且檢測準(zhǔn)確性及速度不斷提升，總體檢測技術(shù)有了明顯進(jìn)步。本研究通過檢測塵螨Derp1 T細(xì)胞表位以獲得有致敏原性的蛋白片段，為臨床塵螨引起的過敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）及哮喘（asthma，AS）的診斷和治療奠定基礎(chǔ)［7］。

1 材料與方法

1.1 D e r p1蛋白理化性質(zhì)分析 通過NCBI基因庫（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gene／）獲得塵螨Derp1基因片段的核酸序列（LOC113791973，共1 400 bp；2019年7月14日更新）及其編碼的氨基酸序列（XP_027197631，320個氨基酸）。Derp1基因序列（NW_020873513.1，共1 400 bp）：5′-AATATCATTTCAATCCATTCGATCATCATCATTTCCATTCTTTTTTCTTTCTCTCTCTAAAATCTAAAATCCATCCAACATGAAAATTACTTTGGCCATCGCCTCATTGTTGGCATTGAGCGCTGTTTATGCTCGTCCATCATCGATCAAAACTTTTGAAGAATACAAAGTTTGTTTTTGATTTATTCTGTTTTTTTTTCCATTTTATATAATTGCCATTTATTCTTGTTTCACCTTTGTTATATATTGTAGAAAGCCTTCAACAAAAGTTATGCTACCTTCGAAGATGAAGAAGCTGCCCGTAAAAACTTTTTGGAATCAGTAAAATATGTTCAATCAAATGGAGGTGCCATCAACCATTTGTCCGATTTGGTAAGTTGATAATCATTGATATGTTTATTGAAAATTTTAAAACCAAATTCTTATTATTAGTCGTTGGATGAATTCAAAAACCGATTTTTGATGAGTGCAGAAGCTTTTGAACACCTCAAAACTCAATTCGATTTGAATGCTGAAACTAACGCCTGCAGTATCAATGGAAATGCTCCAGCTGAAATCGATTTGCGACAAATGCGAACTGTCACTCCCATTCGTATGCAAGGAGGCTGTGGTTCATGTTGGGCTTTCTCTGGTGTTGCCGCAACTGAATCAGCTTATTTGGCTTACCGTAATCAATCATTGGATCTTGCTGAACAAGAATTAGTCGATTGTGCTTCCCAACACGGTTGTCATGGTGATACCATTCCACGTGGTATTGAATACATCCAACATAATGGTGTCGTCCAAGAAAGCTACTATCGATACGTTGCACGAGTAAGTTTGATTTCGAAAAATCAAATTCGATTAACATTCATCAAATTTTTTCTAAAAATTTATAGGAA-CAATCATGCCGACGACCAAATGCACAACGTTTCGGTATCTCAAACTATTGCCAAATTTACCCACCAAATGCAAACAAAATTCGTGAAGCTTTGGCTCAAACCCACAGCGCTATTGCCGTCATTATTGGCATCAAAGATTTAGACGCATTCCGTCATTATGAGTAAGTTTGCCAATCAATTGAATGATGCAATAAAATTAATGTTTTATTATCAATTTTTTAGTGGCCGAACAATCATTCAACGCGATAATGGTTACCAACCAAACTATCACGCTGTCAACATTGTTGGTTACAGTAACGCACAAGGTGTCGATTATTGGATCGTACGAAACAGTTGGGATACCAATTGGGGTGATAATGGTTACGGTTATTTTGCTGCCAACATCGATTTGATGATGATTGAAGAATATCCATATGTTGTCATTCTCTAAACAAAAAGACAATTTCTTATATGATTGTCACTAATTTATTTAAAATCAAAATTTTTAGAAAATGAATAAATTCATTCACAAAAATTAAA-3′；氨基酸序列（XP_027197631.1）：MKITLAIASLLALSAVYARPSSIKTFEEYKKAFNKSYATFEDEEAARKNFLESVKYVQSNGGAINHLSDLSLDEFKNRFLMSAEAFEHLKTQFDLNAETNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQHNGVVQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNANKIREALAQTHSAIAVIIGIKDLDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVDYWIVRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVIL。通過ExPA-Sy的ProtParam tool（https：／／web.expasy.org／protparam）分析Derp1蛋白氨基酸序列的理化性質(zhì)，對Derp1蛋白的氨基酸組成、原子數(shù)目、分子式、相對分子質(zhì)量、正負(fù)電荷量、等電點(diǎn)和穩(wěn)定性等參數(shù)進(jìn)行檢測。登錄ProtParam tool，提交Derp1氨基酸序列，然后計算參數(shù)。

1.2 D e r p1蛋白的跨膜區(qū)分析 一般來說，原核系統(tǒng)無法表達(dá)跨膜蛋白，而真核系統(tǒng)可表達(dá)跨膜蛋白。在線軟件可檢測蛋白中是否存在跨膜結(jié)構(gòu)，并且檢測跨膜蛋白的理化特征［8］。利用TMpred檢測Derp1蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)特征。

1.3 D e r p1蛋白的C D4+T細(xì)胞抗原表位的預(yù)測 Net MHCIIpan 3.2 Serve可檢測Derp1中肽段與H-2分子ClassⅡ的結(jié)合情況，能有效預(yù)測鼠H-2分子ClassⅡ的8種類型（H-2-IAb、H-2-IAd、H-2-IAk、H-2-IAq、H-2-IAs、H-2-IAu、H-2-IEd和H-2-IEk）。BALB／c小鼠MHC ClassⅡ類等位基因為H-2-IAd和H-2-IEd。登錄軟件，輸入Derp1的氨基酸序列，選擇15個氨基酸肽段長度作為檢測標(biāo)準(zhǔn)，將H-2-IAd和H-2-IEd亞型作為檢測亞型進(jìn)行檢測，輸出結(jié)果中親和力值代表肽段與MHCClassⅡ亞型的結(jié)合情況。

1.4 D e r p1蛋白的C D8+T細(xì)胞抗原表位的預(yù)測

1.4.1 NetMHC 4.0 server軟件 NetMHC 4.0 server可檢測Derp1中肽段與H-2分子ClassⅠ的6種亞型（H-2Db、H-2Dd、H-2Kb、H-2Kd、H-2Kk和H-2Ld）結(jié)合情況，BALB／c小鼠的MHC ClassⅠ類等位基因為H-2Kd、H-2Ld和H-2Dd。登錄軟件，提交Derp1蛋白的氨基酸序列，由于H-2分子ClassⅠ與9個氨基酸的肽段有更強(qiáng)的結(jié)合力，因此將檢測肽段長度設(shè)定為9個氨基酸，選擇與H-2分子ClassⅠ的各個亞型進(jìn)行檢測分析。輸出結(jié)果中親和力值代表肽段與MHC Class中亞型結(jié)合情況。

1.4.2 SYFPEITHI軟件 SYFPEITHI（http／／www.syfpeithi.de／bin／MHCServer.dll／EpitopePrediction.htm）能分析Derp1中的肽段與H-2分子ClassⅠ的結(jié)合情況。該軟件可切斷肽鏈羧基端的蛋白酶體并對肽鏈進(jìn)行加工及轉(zhuǎn)運(yùn)，計算3者得分。登錄軟件，選擇H-2亞型，將肽段長度設(shè)定為9個氨基酸，提交Derp1的氨基酸序列，分析結(jié)果得分在前2%的肽段序列。

1.4.3 NetCTL軟件 NetCTL 1.2 Server軟件在檢測抗原肽段與H-2分子ClassⅠ結(jié)合情況的同時，可切斷肽鏈羧基端的蛋白酶體并分析對肽段進(jìn)行加工及轉(zhuǎn)運(yùn)的速率，計算3者得分。登錄軟件，提交Derp1蛋白的氨基酸序列，選定A2、A3兩個超類型，設(shè)置Weighton C terminal cleavage為0.15，Weight on TAP transport efficiency值為0.05，Threshold for epitope identification值為0.75。上述3者得分的加權(quán)和作為檢測結(jié)果，反映H-2分子ClassⅠ與檢測肽段相結(jié)合的靈敏度或特異性的高低。之后再對檢測出的含有9個氨基酸且得分在0.75以上的肽段進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 D e r p1蛋白的理化性質(zhì) 利用ExPASy的Prot Param tool在線軟件對Derp1基因上的開放閱讀框進(jìn)行分析，開放閱讀框長度為1 400 bp，編碼320個氨基酸，其編碼蛋白共4 980個原子，相對分子質(zhì)量為36 078.4，分子式為C1598H2438N444O487S13。其中丙氨酸占比最高為10.9%，其余氨基酸占比均不足10%。由于氨基酸中Asp、Glu帶正電荷，Arg、Lys帶負(fù)電荷，因此，Derp1蛋白中正負(fù)電荷的比例為36∶29，理論等電點(diǎn)為5.65，蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為37.68，是穩(wěn)定蛋白。其脂肪為79.06，親水性指數(shù)為-0.358，是疏水性蛋白。

2.2 D e r p1蛋白的跨膜區(qū) 采用TMpred軟件對Derp1蛋白的跨膜區(qū)、區(qū)段起始和終止位點(diǎn)、相對膜的取向進(jìn)行由外到內(nèi)、由內(nèi)到外等特征的分析，結(jié)果顯示，Derp1蛋白存在的螺旋跨膜區(qū)分別為1-23、125-148位氨基酸處，兩處螺旋區(qū)的總評分為2 786。見表1和圖1。

圖1 Derp1蛋白的跨膜區(qū)分析Fig.1 Analysis of transmembrane region of Derp1 protein

表1 Derp1蛋白的跨膜螺旋特征Tab.1 Characteristicsof transmembrane helical of Derp1 protein

2.3 C D4+T細(xì)胞抗原表位NetMHCIIpan 3.2 Server在線軟件檢測結(jié)果顯示，各短肽與不同H-2亞型之間的結(jié)合有較大差異，但總體來說均存在一定數(shù)量的強(qiáng)弱結(jié)合短肽。其中H-2-IAd有24個弱結(jié)合位點(diǎn)，21個強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合位點(diǎn)最多。而H-2-IEd有26個弱結(jié)合位點(diǎn)，0個強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合位點(diǎn)較少。經(jīng)該軟件可檢測出含有15個氨基酸的CD4+T細(xì)胞抗原表位肽。

2.4 C D8+T細(xì)胞抗原表位 經(jīng)3種在線軟件Net-MHC、SYFPEITHI和NetCTL對Derp1蛋白的檢測分析，共找到6條CD8+T細(xì)胞抗原表位強(qiáng)結(jié)合肽，表位肽氨基酸序列分別為115-123、249-2576、262-270、300-308、203-211和246-272。見表2。

表2 3種軟件對Derp1的CD8+T細(xì)胞抗原表位在線綜合預(yù)測Tab.2 Comprehensive prediction of CD8+T cell epitopes of Derp1 by three software

2.5 C D4+T和C D8+T細(xì)胞抗原表位綜合預(yù)測結(jié)果 將在線軟件分析出的CD4+T與CD8+T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行匯總，查出CD4+T細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位有21條，CD8+T細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位有6條。總結(jié)分析兩者優(yōu)勢表位，得到1條CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞共同優(yōu)勢表位肽段，位點(diǎn)為115-123，序列為RQMRTVTPI，見表3。

表3 Derp1的CD4+T和CD8+T細(xì)胞抗原表位綜合預(yù)測結(jié)果Tab.3 Prediction results of CD4+T and CD8+T cell epitopes of Derp1

3 討論

通過生物信息技術(shù)在線檢測發(fā)現(xiàn)Derp1蛋白的相對分子質(zhì)量、跨膜區(qū)、親水性、疏水區(qū)、脂肪系數(shù)及不穩(wěn)定系數(shù)分別為4 980個原子，相對分子質(zhì)量為36 078.4，分子式為C1598H2438N444O487S13，蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為37.68，是穩(wěn)定蛋白；脂肪為79.06，親水性指數(shù)為-0.358，是疏水性蛋白；與郭偉等［9］報道的結(jié)果相似。崔玉寶等［10］通過生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測Derp1為疏水蛋白；Derp1與Derf1同源性為82.19%；均與本文預(yù)測結(jié)果相符。趙蓓蓓等［11］研究結(jié)果顯示，118-146氨基酸序列中包含一段T細(xì)胞表位肽，與本文結(jié)果相符。以上結(jié)果均表明了在線軟件預(yù)測的可靠性，并且在很大程度上減少了實驗經(jīng)費(fèi)，我們可以有選擇地進(jìn)行相關(guān)實驗。

含T細(xì)胞表位肽治療自身免疫性疾病的免疫治療措施已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。這類肽可被T細(xì)胞檢測，但如果僅有優(yōu)勢表位肽提呈給T細(xì)胞而無共刺激信號存在時，會誘導(dǎo)T細(xì)胞失能從而不能引起過敏反應(yīng)［12-13］。目前過敏性疾病的主要治療方法為SIT［14］，臨床應(yīng)用診斷治療的SIT制劑治療效果較好，但療效尚需進(jìn)一步提高。這類制劑均采用天然變應(yīng)原提取物，成分復(fù)雜，有引起嚴(yán)重不良事件的可能，因此被禁用于不穩(wěn)定性哮喘［15-16］。與天然變應(yīng)原相比，重組塵螨變應(yīng)原存在T細(xì)胞表位，可在引起T細(xì)胞免疫反應(yīng)的同時降低與IgE的反應(yīng)，從而獲得高度特異性和低免疫原性的重組變應(yīng)原。對重組變應(yīng)原分子生物學(xué)特征等方面的研究為獲得理想的重組蛋白奠定了基礎(chǔ)。

生物信息學(xué)技術(shù)早期已被利用至醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，通過生物信息學(xué)技術(shù)的分析檢測可獲知病毒蛋白變異原蛋白、細(xì)菌、真菌等一系列病原微生物蛋白的理化性質(zhì)，以及其生物功能和主要的功能基團(tuán)。通過生物信息學(xué)技術(shù)的提前信息檢測，也可提前檢測可能的功能蛋白，進(jìn)行進(jìn)一步的實驗研究驗證，可大大縮短實驗所需時間，減少實驗經(jīng)費(fèi)，對進(jìn)一步研究具有較好的指導(dǎo)意義。但生物信息學(xué)技術(shù)也存在缺點(diǎn)，由于在線檢測數(shù)據(jù)庫的不穩(wěn)定性，相同的變應(yīng)原可能會有不同的檢測結(jié)果，其準(zhǔn)確性、可靠性、穩(wěn)定性等尚需進(jìn)一步提高。