李春生 ,李吉葉 ,張國模 ,趙文軍 ,馬利青

(1.大通種牛場,青海 大通810102；2.青海畜牧獸醫(yī)科學院獸醫(yī)研究所)

“阿什旦”牦牛是以來自青海牦牛群體中性能優(yōu)異，表型無角的公牦牛為父本，以青海大通種牛場分布的青海高原牦牛為母本，通過定向選育的一個生長發(fā)育快，產肉性能高，抗逆性強，適應高海拔地區(qū)規(guī)?；s化飼養(yǎng)的肉用牦牛新品種。近年來青海大通種牛場有計劃地采用建立育種核心群、強度淘汰、自群繁育、選育推廣、推廣驗證等主要階段，集成開放式核心群育種，分子輔助選擇技術等現(xiàn)代先進育種技術，建立起了完善的四級繁育培育體系，青海大通種牛場現(xiàn)有“阿什旦”核心育種群12群.適繁“阿什旦”母牛 頭，可推廣“阿什旦”種公牛2群，400余頭。2020年7月中旬，在夏季牧場的放牧的1.5歲“阿什旦”育成牦種公牛發(fā)生群體性腹瀉，初發(fā)病時呈零星點狀散發(fā)，病情于8月初起達到高峰，呈爆發(fā)式增長，累計共發(fā)病167頭。臨床癥狀表現(xiàn)為體溫升高，精神沉郁，糞便呈灰白色、稀薄不成形并伴有惡臭味，排便呈噴射狀。由于在野外，牛只不易抓捕，隨機挑選有明顯的臨床癥狀的育成公牛18頭，采用直腸采取糞便的方法，采取糞便18頭/份。送檢青海省畜牧獸醫(yī)科學院獸醫(yī)研究所進行化驗。

1 實驗材料

1.1 病料采集

在青海省大通種牛場疑似患畜中采集糞便18頭，分別將糞便放入裝有硫酸鹽緩沖液的試管中，置于4℃冰壺保存。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

革蘭氏染色液，購自安徽省巢湖市弘慈醫(yī)療器械有限公司；營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、血液瓊脂培養(yǎng)基等，均購自青島高科園海博生物技術有限公司；生化試驗管、藥敏片等，均購自杭州濱和微生物試劑有限公司。大腸桿菌、沙門氏菌PCR試劑盒(購自上海雅吉生物有限公司)。實驗用小白鼠由青海省畜牧獸醫(yī)科學院獸醫(yī)研究所提供。

2 實驗方法

2.1 細菌的分離純化與鏡檢

將18份病料分別接種于血瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察(圖1)。挑單個菌落，分別接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后觀察結果。將純化培養(yǎng)的細菌在載玻片上進行革蘭氏染色，然后在顯微鏡下觀察(圖2)。

圖2 革蘭氏染色鏡檢圖

2.2 致病性實驗

將純化后的細菌在營養(yǎng)肉湯中進行培養(yǎng) 24 h，而后將其腹腔注射昆明系小白鼠，每只 0.2 mL，注射 2 只，結果小白鼠于 24 h內死亡，且小鼠腹腔呈現(xiàn)腸道炎癥癥狀詳見圖 3，說明該菌具有致病性，為致病性大腸桿菌。

圖3 死亡小鼠癥狀

2.3 細菌生化鑒定

挑取單個菌落純培養(yǎng)物分別接種到間肌醇、麥芽糖、甘露糖、海藻糖、丙二酸鹽、L鼠李糖、D木糖、側金盞花醇、乳糖、明膠、氧化酶、L阿拉伯糖、尿素酶、衛(wèi)矛醇等生化管中37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察結果并記錄見表1

表1 大腸桿菌生化試驗結果

2.4 沙門氏菌-PCR、病毒性腹瀉(BVDV)RT-PCR、大腸桿菌16SrRNA-PCR實驗

沙門氏菌-PCR檢測具體操作步驟按試劑盒說明書進行。檢測結果全部呈陰性。病毒性腹瀉(BVDV)RT-PCR 檢測具體操作步驟按試劑盒說明書進行。檢測結果全部呈陰性大腸桿菌16SrRNA-PCR檢測具體操作步驟按試劑盒說明書進行。經細菌 16S rRNA 鑒定，PCR 及測序，18份樣品中編號為10#的樣品分離菌株為大腸桿菌。見圖4。

圖4 細菌16srRNA PCR 結果圖

2.5 藥物敏感試驗

本試驗對分離菌株用 K-B 擴散法進行藥敏試驗，詳細結果見表2。

表2 分離菌株(大腸桿菌)的藥敏實驗結果 mm,μg

2.6 蟲卵檢測

糞便經純化，鏡檢，蟲卵檢測，18 份樣品中有 14 份樣品線蟲陽性，詳見圖5。

圖5 不同樣品中檢測到線蟲蟲卵

經細菌分離培養(yǎng)，在血平板培養(yǎng)基中生長出單一菌落，β溶血詳見圖 1。

圖1 分離菌落形態(tài)

3 結果與討論

經過病原學和寄生蟲蟲卵檢測，得出此次造成育成牦公牛腹瀉的病原學為多數牛感染了線蟲和部分牛感染了致病性大腸桿菌。其次作者分析由于該病發(fā)生于8月中旬的高海拔夏季牧場，氣溫逐漸變冷加之陰冷多雨天氣偏多，早晚溫差加大。育成牛外感風寒，扭傷濕滯，加之牧草由青草期轉為枯草期，成分與營養(yǎng)亦有一些變化，造成胃腸型感冒的現(xiàn)象也將存在。因此作者認為此次大規(guī)模腹瀉疾病的發(fā)生是有生理性疾病和致病性微生物、寄生蟲病三方面原因造成的，因此建議該種牛場更換驅蟲藥品，或將單一驅蟲藥物改換為兩種或兩種以上驅蟲藥物聯(lián)合使用，以期達到良好驅蟲效果。其次在夏季牧場放置營養(yǎng)舔磚或定期給育成牛灌服富含維生素和有機鹽的營養(yǎng)物質，起到營養(yǎng)均衡，代謝正常。避免因營養(yǎng)單一而造成的腹瀉現(xiàn)象發(fā)生。其次在條件容許的情況下，加大消毒工作。盡最大努力，避免致病微生物的侵襲。