趙玉瓊 戴 鑫 陳 華

(解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心，北京 100853)

豬與人類在解剖、代謝、生理和病理生理學(xué)方面十分相似，而且繁殖率高、倫理上可接受。在食品生理學(xué)、肥胖、代謝和心血管疾病的轉(zhuǎn)化研究方面，其應(yīng)用也明顯增長。在開發(fā)新的治療措施方面，豬成為從經(jīng)典的嚙齒類動物模型轉(zhuǎn)化到人類的橋梁[1-2]。應(yīng)用豬測試藥物(如他汀類藥物)和設(shè)備(如血管支架)已經(jīng)被認(rèn)為對于此后轉(zhuǎn)化到人類應(yīng)用具有很高的預(yù)測價值[3-4]。

胰腺是消化和代謝的重要器官，以往關(guān)于豬胰腺的解剖與結(jié)構(gòu)的研究側(cè)重于胰腺移植和胰島移植方面的應(yīng)用，為改善胰腺的迅速獲取和以灌注為基礎(chǔ)的體外保存技術(shù)，對于豬胰腺血管解剖和分布進(jìn)行詳細(xì)的描述。此外，為獲得在胰島分離前導(dǎo)入蛋白酶荷載的最佳胰腺膨脹程度，對胰腺分泌導(dǎo)管的解剖結(jié)構(gòu)和分布進(jìn)行詳細(xì)的描述[5-7]。對于代謝研究方面的解剖學(xué)數(shù)據(jù)，如胰島的形態(tài)及其在胰腺中的占比等，還需要進(jìn)一步補(bǔ)充和完善。本研究利用實(shí)驗(yàn)室科研工作中的對照組動物，描述巴馬小型豬胰腺的解剖學(xué)特點(diǎn)和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為小型豬在消化和代謝領(lǐng)域的研究和應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

雄性巴馬小型豬24頭，14～15月齡，體質(zhì)量35.3～64.0 kg，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK(軍)2017-0017。所有動物研究(包括安樂死程序)均符合解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會規(guī)定和指南，并根據(jù)AAALAC和IACUC指南進(jìn)行。 福利倫理審查批號：(ID：2018-D14-26)。動物麻醉后(以25 mg/kg鹽酸塞拉嗪+0.25 mg/kg咪達(dá)唑侖混合液肌肉注射誘導(dǎo)麻醉，以6 mg/kg戊巴比妥鈉靜脈注射維持麻醉)，股動脈放血致死。常規(guī)程序解剖檢查及取材。

小心剝離胰腺，照相后稱質(zhì)量，計(jì)算胰腺系數(shù)(胰腺/體質(zhì)量)。

將胰腺按照十二指腸葉、脾葉和連接葉切開，分別放入4%多聚甲醛溶液固定。復(fù)檢時，在每個葉的中央部位取組織各2塊(相距1 cm)，常規(guī)制作石蠟切片。分別進(jìn)行HE染色和胰島素免疫組化染色。免疫組化所用胰島素抗體購自Abcam(小鼠抗人胰島素單克隆抗體，ab46707)，DAB顯色系統(tǒng)。

胰腺中胰島的占比計(jì)算方法：以HE染色的切片觀察并計(jì)算胰島的占比。每個葉計(jì)算2張切片(應(yīng)用Image-Pro Plus 4.5軟件)，每只動物胰島占比按照6張切片獲得的平均值計(jì)算。

胰島β細(xì)胞體質(zhì)量系數(shù)：以胰島素免疫組化染色陽性細(xì)胞為β細(xì)胞，觀察并計(jì)算胰腺組織中陽性細(xì)胞的占比。每個葉計(jì)算2張切片，每只動物胰島β細(xì)胞的占比按照6張切片獲得的平均值計(jì)算。利用β細(xì)胞的占比值和胰腺質(zhì)量推測胰島β細(xì)胞的質(zhì)量，并計(jì)算相對質(zhì)量。

2 結(jié)果

2.1 胰腺大體形態(tài)

巴馬小型豬的胰腺呈粉紅色、質(zhì)軟，表面呈結(jié)節(jié)狀，被覆薄層的疏松結(jié)締組織，邊緣不規(guī)則。大體結(jié)構(gòu)可分為3個葉，即脾葉、十二指腸葉和連接葉。脾葉(對應(yīng)人類胰腺的胰體和胰尾)位于后側(cè)，與脾臟和胃相連；十二指腸葉(對應(yīng)人類胰腺的胰頭)與十二指腸毗連，而連接葉(對應(yīng)人類胰腺的鉤突)是胰腺的延伸，與門靜脈前面相連。通常在胰腺還有一個纖細(xì)的“橋”，用于連接脾葉和連接葉(圖1)。

圖1 巴馬小型豬胰腺大體解剖圖片

胰腺的大體形態(tài)變異較大，總體上還能分出3個葉的結(jié)構(gòu)。胰腺占比體質(zhì)量的0.09%～0.15%，對于本研究的24例胰腺，我們初步分為標(biāo)準(zhǔn)型、纖細(xì)型和粗壯型，在24頭小型豬中，分別占比16/24、6/24和2/24，個體變異較大(SD=0.023)。

2.2 胰腺的組織形態(tài)

胰腺表面的結(jié)締組織伸入腺體內(nèi)，將其分隔成許多小葉。胰小葉主要由腺泡和導(dǎo)管組成。胰腺的血管、淋巴管和神經(jīng)均經(jīng)結(jié)締組織隔進(jìn)出胰腺。胰腺是重要的消化器官，它由外分泌部和內(nèi)分泌部組成。外分泌部是由腺泡和導(dǎo)管構(gòu)成的漿液性復(fù)管泡狀腺，組成胰腺的大部分。內(nèi)分泌部是由上皮細(xì)胞組成的許多細(xì)胞索或團(tuán)，稱為胰島。

光學(xué)顯微鏡下，小型豬的胰島在胰腺中散在分布，大小不一，普遍較小，以幾個、十幾個內(nèi)分泌細(xì)胞組成的細(xì)胞叢樣超小胰島居多。HE染色條件下，胰島細(xì)胞相對淡染(圖2“→”處)，與外分泌腺分辨比較清晰，胰島的邊界規(guī)整。胰島素免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，胰島中胰島素陽性細(xì)胞(β細(xì)胞，染色呈棕色)占絕大多數(shù)(圖2)。

圖2 巴馬小型豬胰腺組織學(xué)圖片

2.3 胰島/胰腺和胰島β細(xì)胞體質(zhì)量指數(shù)

在HE染色的切片，胰島與外分泌腺能夠明確區(qū)分。每個胰腺選擇6個代表性切面，以這6個切面的平均值推測計(jì)算了胰腺中胰島的占比。結(jié)果表明，巴馬小型豬胰島占比胰腺的1.52%～4.98%(3.15%±1.42%)。

在胰島素免疫組化染色的切片，胰島素陽性細(xì)胞呈棕色(DAB顯色)，與藍(lán)色襯染的其他細(xì)胞區(qū)分明顯，以胰島素陽性細(xì)胞為β細(xì)胞，計(jì)算β細(xì)胞的占比，再以胰腺的質(zhì)量計(jì)算β細(xì)胞質(zhì)量，從而得出β細(xì)胞的質(zhì)量指數(shù)。結(jié)果表明，巴馬小型豬胰島β細(xì)胞相對質(zhì)量為0.548～1.023 g(0.827±0.200 g)，β細(xì)胞占體質(zhì)量的比例為0.012‰～0.024‰(0.020‰±0.006‰)。

3 討論

隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，肥胖、脂肪肝、糖尿病、代謝綜合征、動脈粥樣硬化等代謝相關(guān)性疾病快速增長。動物模型是探討疾病發(fā)病機(jī)制、測試新藥的功效和安全性的重要手段。目前，代謝相關(guān)性疾病的實(shí)驗(yàn)研究仍然主要應(yīng)用嚙齒類動物模型，這是由于它們具備維持費(fèi)用低廉，標(biāo)準(zhǔn)化的飼養(yǎng)環(huán)境，倫理上的易于接受，快速繁殖的生物學(xué)特性，高效和成熟的遺傳修飾技術(shù)，大規(guī)模的標(biāo)準(zhǔn)化表型分析計(jì)劃，以及方便應(yīng)用的大規(guī)模的參考信息數(shù)據(jù)庫[8]。利用這些動物模型，獲得了關(guān)于嚙齒類動物代謝相關(guān)的豐富知識，包括從基因調(diào)控到維持動物整體代謝穩(wěn)態(tài)。然而，由于嚙齒類動物在代謝方面與人類的差異較大，很多研究成果，包括新藥和治療手段，向臨床的轉(zhuǎn)化效力低下[9-10]。

近年來，小型豬在肥胖、糖尿病和動脈粥樣硬化等代謝相關(guān)疾病研究領(lǐng)域受到廣泛重視，相關(guān)研究也快速增加[11-12]。胰腺由于在消化和代謝中的重要性，對于小型豬胰腺解剖學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的建立十分必要。在人類、小鼠和非人靈長類動物，胰腺呈L型，包括胰頭、胰體(十二指腸部)和胰尾(脾部)，而豬的胰腺是環(huán)形的，包括脾葉、十二指腸葉和連接葉。豬胰腺的脾葉是最大的部分，占比胰腺質(zhì)量的約50%。豬胰腺在大小、位置和質(zhì)量上與人類相似[13-14]?？偟囊葝uβ細(xì)胞質(zhì)量，作為胰島素分泌能力和胰島素分泌儲存池，不同種類動物之間變異很大。研究顯示, 在成年人類和豬/小型豬，總的胰島β細(xì)胞質(zhì)量估計(jì)分別為0.5～1.5 g[15-16]和0.5～1.9 g[13,17]。我們的研究結(jié)果也與之相似。臨床研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病的發(fā)展過程是一個持續(xù)的β細(xì)胞功能減退的過程，大多數(shù)患者，不管胖瘦與否，均表現(xiàn)為胰島β細(xì)胞數(shù)量的純粹減少。通過對2型糖尿病患者的尸檢發(fā)現(xiàn)，普遍存在胰腺胰島β細(xì)胞的顯著減少和淀粉樣蛋白的沉積[18-20]。由于動物和人類的胰島β細(xì)胞數(shù)量是有儲備的，到底減少到什么程度才能達(dá)到血糖的失調(diào)，形成持續(xù)性的高血糖,胰島β細(xì)胞數(shù)量的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)成為重要參照指標(biāo)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，胰島β細(xì)胞數(shù)量比對照組平均減少64.7%～71.4%時，巴馬小型豬完全能夠進(jìn)行正常的血糖調(diào)控，保持血糖的穩(wěn)定。此時，小型豬的血清胰島素水平和糖耐量完全正常。當(dāng)胰島β細(xì)胞平均減少幅度達(dá)到83.1%～87.3%時，則形成了顯著的高血糖，此時的血清胰島素水平顯著降低、糖耐量受損。Dufrane等[21]應(yīng)用150 mg/kg鏈尿佐菌素(STZ)可造成豬97%的胰島β被破壞，4周后胰島β細(xì)胞減少92.8%，導(dǎo)致永久性的糖尿病。因此，我們實(shí)驗(yàn)室建立的小型豬胰島解剖學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為小型豬在代謝相關(guān)疾病研究中的應(yīng)用提供了重要基礎(chǔ)。