許 琴 宋來陽 張 蕾 李佳佳 馬 娜 江俊峰 劉愛中 蒲鳳萍 鄧 培 劉江偉 王 瑋

(1. 中國人民解放軍新疆軍區(qū)總醫(yī)院，新疆特殊環(huán)境醫(yī)學重點實驗室，烏魯木齊 830000)(2. 中國人民解放軍陸軍第九四八醫(yī)院，烏蘇 833000)(3. 新疆農(nóng)業(yè)大學科學技術(shù)學院，烏魯木齊 830091)(4. 新疆特殊環(huán)境微生物重點實驗室，新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所，烏魯木齊 830091)

耐輻射奇球菌(Deinococcusradiodurans，DR)是1956年由Anderson等[1]在輻射滅菌后仍然變質(zhì)的肉類罐頭中分離出來的一種微小球菌。該菌在培養(yǎng)基上形成紅色菌落、不形成芽孢、無致病性、革蘭氏染色陽性、嚴格好氧、菌體形態(tài)較大，常形成四聚體。耐輻射奇球菌屬異常球菌科(Deinococcaceae)異常球菌屬(Deinococcus)，該菌對電離輻射的存活最高劑量約15 kGy，抗性是普通真核生物的100倍，對紫外線、干燥、強氧化劑和某些化學誘變劑顯示超乎尋常的抗性[2]。陳立等[3]首次從耐輻射奇球菌代謝產(chǎn)物中分離得到5個化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺苷、 L-丙氨酸，前4種代謝產(chǎn)物是核酸及脫氧核酸合成的底物。DR的強抗輻射性，其基本機制是有高效的 DNA 修復系統(tǒng)，體內(nèi)存在超氧化物酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)等抗氧化保護酶系相關(guān)基因的高水平表達[4]。

楊橋等[5]對DR中的類胡蘿卜素——Deinoxanthin 進行了大量研究，研究結(jié)果表明DR中的類胡蘿卜素具有很強的清除活性氧自由基的功能。DR的pprⅠ基因及PprM蛋白能夠在細胞或小鼠或體內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，并發(fā)揮抗氧化與抑制腫瘤生長的作用[6-7]。我們推測DR在生命科學研究領(lǐng)域中有著廣闊的應用前景。近年來科研人員對其環(huán)境修復、基因修復等方面研究較多，動物實驗及藥理學研究相對較少。據(jù)所查文獻資料，未見DR活菌及其菌體破碎物相關(guān)的急性毒性實驗報道，我們就此進行了研究，以期為DR作為腸道益生菌的推廣應用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

DR活菌培養(yǎng)物由新疆農(nóng)業(yè)科學院應用微生物研究所提供；SPF級KM小鼠60只，雌雄各半，18～22 g，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(新)2018-0002，實驗動物使用許可證號：SYXK(軍)2017-0050；全自動生化分析儀BS-180(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；臺式低速離心機TDZ5(湖南赫西儀器裝備有限公司)；全自動血細胞分析儀BC-2800vet(深圳邁瑞動物醫(yī)療電子股份有限公司)；-80 ℃冰箱(三洋)；超聲破碎儀SK3310LHC(上海科導超聲儀器有限公司)；SW-CJ-2FD雙人單面潔凈工作臺(蘇州蘇潔凈設(shè)備有限公司)；分析天平TP-214(丹佛儀器北京有限公司)；ACS-1.5A型電子計重秤(上海友聲衡器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1DR濃度的確定：DR培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，測定其OD值，OD值達到1.9～2.0，細菌增殖基本停止，根據(jù)其生長曲線，此時的DR菌液濃度為1×109/mL。將此作為高濃度灌胃菌液，高濃度DR菌液用空白培養(yǎng)基稀釋100倍后(1×107/mL)作為低濃度灌胃菌液。

1.2.2DR破碎物的制備：分別將高、低濃度的活菌于-80 ℃冰箱及超聲破碎儀中(37 ℃、50 kHz、30 min)反復凍融5～7次，得到高、低濃度的DR菌體破碎物。

1.2.3實驗分組：按照DR菌液小鼠灌胃給藥的濃度分為高濃度活菌組(1×109/mL)、低濃度活菌組(1×107/mL)、高濃度細菌破碎物組(1×109/mL)、低濃度細菌破碎物組(1×107/mL)和灌胃相同體積的胰蛋白胨葡萄糖酵母瓊脂培養(yǎng)基(tryptone glucose yeast agar medium，TGY)的TGY培養(yǎng)基組。

1.2.4預實驗：SPF級KM小鼠10只，雌雄各半，實驗前12 h禁食不禁水，高濃度活菌(1×109/mL)以最大灌胃體積0.4 mL/10 g灌胃，24 h內(nèi)，每隔6 h灌胃1次，連續(xù)灌胃3次，參照王艷秀等[8]的急性毒性小鼠行為學觀察指標，記錄異常癥狀小鼠的數(shù)量、癥狀開始時間、結(jié)束時間、死亡時間等，觀察48 h，計算DR的半數(shù)致死量LD50。對48 h后未死亡的小鼠，一側(cè)眼球眶靜脈取血于EDTA-k2抗凝管中，左右顛倒充分抗凝，立即進行血常規(guī)檢測(白細胞、淋巴細胞、紅細胞、血紅蛋白、紅細胞壓積、平均紅細胞體積、血小板)以及生化指標，血常規(guī)檢測結(jié)束后的抗凝全血，3 000 r/min離心15 min獲取血漿用于生化指標的檢測(谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、肌酐、肌酸激酶、鎂、磷、肌酸激酶型同工酶、乳酸脫氫酶)。解剖小鼠，肉眼觀察小鼠主要臟器(心、肝、脾、肺、腎、腦及胸腺)有無病理改變，稱體質(zhì)量，根據(jù)每只小鼠體質(zhì)量計算小鼠臟器質(zhì)量分數(shù)。

1.2.5急性毒性實驗：取KM小鼠50只隨機分為5組，雌雄對半。灌胃前12 h內(nèi)禁食不禁水，第2天以最大灌胃體積0.4 mL/10 g灌胃菌液2次，間隔8 h，常規(guī)飼養(yǎng)觀察14 d。記錄小鼠異常行為學反應、死亡數(shù)量及時間，并記錄灌胃后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d及14 d的體質(zhì)量。14 d后，按照預實驗的方法，檢測血常規(guī)及血漿生化指標，測定臟器系數(shù)，進行毒理學分析。

臟器系數(shù)計算依據(jù)下式進行：臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量(g)/動物體質(zhì)量(g)×100%

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 DR急性毒性預實驗結(jié)果

小鼠在灌胃后0.5 h內(nèi)有趴窩、安靜不動及扎堆現(xiàn)象，0.5 h后恢復正常，之后未見受試小鼠瞳孔改變、眼球凸出、眼瞼下垂，未見小鼠分泌物、大小便、呼吸異常及皮膚顏色改變，無小鼠死亡，無法計算出LD50，解剖后肉眼觀察主要臟器無明顯病理變化，血常規(guī)與血液生化指標均在SPF級KM小鼠正常參考指標范圍內(nèi)[9]。

2.2 DR急性毒性正式實驗結(jié)果

2.2.1DR及其破碎物對小鼠體質(zhì)量增加的影響：灌胃14 d，與TGY培養(yǎng)基組比較，不同濃度組的小鼠體質(zhì)量增加，差異不顯著(P>0.05)，表明DR對小鼠體質(zhì)量增長無不良影響(圖1)。

圖1 DR及其破碎物灌胃小鼠體質(zhì)量的變化

2.2.2DR活菌及其破碎物對小鼠血常規(guī)指標的

影響：灌胃14 d后，與TGY培養(yǎng)基組比較，不同濃度組的小鼠血常規(guī)指標差異均不顯著(P>0.05)，表明DR對小鼠白細胞、淋巴細胞、紅細胞、血紅蛋白、紅細胞壓積、平均紅細胞體積、血小板等未產(chǎn)生異常影響(表1)。

表1 DR及其菌體破碎物灌胃后小鼠血常規(guī)的測定值

2.2.3DR及其破碎物對小鼠血生化指標的影響：灌胃14 d后，與TGY培養(yǎng)基組比較，不同濃度組的小鼠生化指標差異均不顯著(P>0.05)，表明DR對小鼠肝、腎、心等主要臟器功能及鎂、磷離子濃度無不良影響(表2)。

表2 DR及其破碎物灌胃后小鼠的血漿生化指標測定值

2.2.4DR及其破碎物對小鼠臟器系數(shù)的影響：灌胃14 d后，不同濃度組小鼠主要臟器系數(shù)與TGY培養(yǎng)基組比較，除低濃度細菌破碎物組脾臟較其他組有顯著增大(P<0.05)外，其他臟器差異均不顯著(P>0.05)(表3)。

表3 DR及其破碎物灌胃后小鼠的臟器系數(shù)

2.2.5DR及其破碎物灌胃小鼠脾臟器病理學變化：臟器系數(shù)比較，發(fā)現(xiàn)低濃度細菌破碎物組脾臟系數(shù)增大，研究組對DR急性毒性實驗組補充了脾臟的組織病理，鏡檢發(fā)現(xiàn)：TGY培養(yǎng)基組小鼠脾臟紅白髓細胞排列規(guī)則，細胞種類未見明顯改變，紅白髓比例未見明顯變化，紅髓脾竇內(nèi)未見紅細胞數(shù)量增多(圖2A1)，紅白髓邊緣區(qū)近紅髓部細胞種類未見改變(圖2A2)。DR灌胃小鼠，低濃度組脾臟未見明顯病變，紅白髓比例未見明顯變化(圖2B1、圖2C1)，紅髓脾竇內(nèi)紅細胞數(shù)量輕度增加，偶見紅髓內(nèi)靜脈輕微擴張(圖2B2)，白髓中央動脈周圍T細胞數(shù)量輕微減少，中央動脈周圍淋巴鞘細胞數(shù)量輕微減少(圖2C2)；高濃度組偶見紅白髓比例發(fā)生改變，紅髓面積擴大，白髓細胞數(shù)量有減少趨勢(圖2D1、圖2E1)，局部紅髓脾竇內(nèi)紅細胞數(shù)量輕微增加，局部紅髓內(nèi)靜脈擴張、脾竇輕微水腫(圖2D2、圖2E2)，白髓中央動脈淋巴鞘細胞數(shù)量減少(圖2D3、圖2E3)。DR及其破碎物灌胃組小鼠脾臟紅髓的脾竇、脾索，白髓中的動脈周圍淋巴鞘、脾小結(jié)，白髓周邊向紅髓移行的邊緣區(qū)未見實質(zhì)性病理變化。

圖2 DR活菌及其破碎物灌胃小鼠脾臟病理(HE染色)

3 討論

急性毒性實驗是確定中毒作用方式和中毒反應，為亞急性和慢性毒性實驗觀察指標及劑量分組提供參考的重要依據(jù)，也是新藥生物安全評價的重要指標[10]。臟器系數(shù)可作為內(nèi)臟器官損傷的評價標準之一，當臟器系數(shù)數(shù)值升高，器官出現(xiàn)水腫或充血，臟器系數(shù)數(shù)值降低，器官出現(xiàn)萎縮或退化[11]。本研究中，DR對小鼠增加體質(zhì)量及各臟器系數(shù)無顯著影響，表明DR對小鼠生長影響不大。小鼠血常規(guī)及血液生化指標的檢測結(jié)果，提示DR及其菌體破碎物對小鼠無病理生理上的不良反應。封瓊[12]研究表明，在奇球菌屬中，DR和D.radiopugnans的類胡蘿卜素提取物表現(xiàn)出了最強的抗氧化作用，DR類胡蘿卜素可以增加免疫系統(tǒng)中B細胞活力并消滅外源入侵的病原菌，可以提高淋巴T輔助細胞的活力，協(xié)助B細胞產(chǎn)生抗體并提高其他免疫組分活性，還可以增加自然殺傷細胞數(shù)目，以消除機體內(nèi)那些被感染的細胞或者癌細胞[13]。本研究結(jié)果表明，DR對小鼠增加體質(zhì)量、臟器系數(shù)、血常規(guī)及主要臟器相關(guān)酶活性及離子濃度無顯著影響，低濃度表現(xiàn)出脾臟臟器系數(shù)增大，但沒有器質(zhì)性損傷，表現(xiàn)出其潛在的免疫系統(tǒng)促進作用，從而證實了DR為實際無毒菌種。該研究結(jié)果與江漢湖等[14]的報道相一致。雖有研究表明益生菌能抑制癌癥、腫瘤等的發(fā)生，提高機體免疫力，但由于對其作用機理及安全性的研究還不夠透徹，所以其作為藥品，市場上種類還很少，其主要應用于食品和保健品行業(yè)[15]。本研究為推廣DR在食品醫(yī)藥衛(wèi)生上的廣泛應用，用小鼠急性毒性實驗方法初步驗證了DR對于生物體的安全性。