王明亮 彭蘊茹

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇省中醫(yī)藥研究院，南京 210028)

臟器在纖維化進程中易出現(xiàn)組織重塑現(xiàn)象，常導(dǎo)致臟器功能異常，發(fā)病率較高，且與疾病死亡率高相關(guān)[1]。據(jù)統(tǒng)計，在發(fā)展中國家，與臟器纖維化相關(guān)的死亡高達45%[2]。其中，肝纖維化也是一個重要的全球健康問題，該因素導(dǎo)致的死亡人數(shù)每年達100多萬[3-4]。肝組織損傷后，在組織修復(fù)過程中大量細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的異常累積，能夠引起橋接性肝纖維化、肝硬化甚至肝癌，導(dǎo)致患者存活率顯著下降?；A(chǔ)臨床研究發(fā)現(xiàn)肝纖維化具有可逆性，但目前肝纖維化的臨床治療藥物十分有限，且療效不理想。因此，臨床迫切地需要療效明確的抗肝纖維化治療藥物[3,5-6]。要克服這一挑戰(zhàn)的潛在策略是研發(fā)針對肝纖維化疾病共有的核心病理生理學(xué)相關(guān)性的機制或核心通路的藥物，提高早期肝纖維化診斷的準確性，進而降低治療的難度與花費。本研究希望通過構(gòu)建嚙齒動物肝纖維化動態(tài)模型，探索肝纖維化發(fā)生發(fā)展的特點及內(nèi)在發(fā)病機制，為進一步研發(fā)肝纖維治療藥物及提高肝纖維化早期診斷提供參考。

肝纖維化的發(fā)病機制是一個多因素誘導(dǎo)、多細胞參與、多靶點共同作用的復(fù)雜生理過程，涉及炎癥、氧化應(yīng)激、糖脂代謝等復(fù)雜的體內(nèi)過程。慢性肝病發(fā)展為纖維化多與慢性炎癥誘導(dǎo)產(chǎn)生的瘢痕組織相關(guān)，因此，研究炎癥和纖維化發(fā)病機制的內(nèi)在聯(lián)系對肝纖維化的治療至關(guān)重要。近期臨床研究發(fā)現(xiàn)肝硬化患者體內(nèi)內(nèi)毒素水平顯著上升，且即使在生理條件下，肝臟也始終暴露于來自食物、化學(xué)物質(zhì)、藥物和腸道微生物群的外源蛋白[7]。肝硬化與由內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活的炎癥通路Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)信號通路的相關(guān)性也丞待深入探索。傳統(tǒng)研究中采用四氯化碳(CCl4)或膽管結(jié)扎(bile duct ligature，BDL)誘導(dǎo)建立肝纖維化模型，其中CCl4誘導(dǎo)的肝硬化在很大程度上反映了氧化應(yīng)激引起的脂質(zhì)過氧化和質(zhì)膜損傷[8]。嚙齒動物進行BDL手術(shù)可導(dǎo)致急性膽汁淤積和管道反應(yīng)，炎癥和促纖維化信號上調(diào)，故而BDL更加適用于研究術(shù)后急性膽汁淤積或肝損傷[9-10]。DEN是一種致癌劑，且具有明顯的肝靶向性，其所誘發(fā)肝病與臨床患者肝纖維化的病理表現(xiàn)、基因表型十分相似[11-12]。此外，由于生理性的雌性激素也能對炎癥有一定的抑制作用，而雄性更易于發(fā)生與免疫相關(guān)的并發(fā)癥，誘發(fā)炎癥損傷[13]。因此，為方便探究肝纖維化的發(fā)生發(fā)展進程及發(fā)病機制，本研究采用DEN誘導(dǎo)雄性小鼠肝纖維化，并通過動態(tài)觀察，研究肝纖維化不同發(fā)展階段的變化，從而進一步探究DEN誘導(dǎo)肝纖維化的發(fā)病機制與TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～22 g，35只，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2017-0005，實驗動物合格證號：20170005011477。本研究獲得江蘇省中醫(yī)藥研究院動物實驗倫理委員會批準，審批號：AEWC-20180712-37，飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)藥研究院動物中心，實驗動物使用許可證號：SYXK(蘇)2016-0018。飼養(yǎng)條件：每籠5只小鼠，自由飲水飲食[飼料由儀征安立卯生物科技有限公司提供，蘇飼證(2019)10033]，于恒定的環(huán)境溫度20～25 ℃和相對濕度50%～60%下飼養(yǎng)，光照周期為12 h/12 h。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開展實驗。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1試劑：DEN，分子式：C4H10N2O，相對分子質(zhì)量：102.14，含量0.95 g/mL，產(chǎn)品編號：O49K1613V，購自Sigma；羥脯氨酸試劑盒(20190927)，購自南京建成生物工程研究所：一抗TGF-β(ab92486)、MyD88(ab2064)和Lamin B(ab133741)，購自Abcam；α-SMA (19245)、NF-κB p65(8242)和 GAPDH(2118)，購自Cell Signaling；TLR4(GTX75742，GeneTex)；BCA 蛋白含量檢測試劑盒(KGPBCA)，購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；廣譜蛋白Marker(MAN0011772)，購自Thermo；山羊抗兔IgG(BL003A)和山羊抗鼠IgG(BL001A)購自Biosharp；Western一抗稀釋液(P0023A)、特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(P0018A)和細胞核蛋白與細細胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒(070219200429)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2.2儀器： 全自動生化分析儀(C8000 Roche， Hoffmann-La Roche Inc)；DMi8倒置光學(xué)顯微鏡(Leica)；高速低溫離心機(Beckman)；BT125D電子分析天平(sartorius)；高速低溫離心機(Beckman)；蛋白電泳與轉(zhuǎn)移儀(Bio-rad)；天能5200凝膠成像系統(tǒng)(Tanon)。

1.3 方法

1.3.1實驗設(shè)計：根據(jù)體質(zhì)量將35只小鼠，隨機分為模型組(25只)和對照組(10只)。模型組小鼠，連續(xù)8周，每周2次腹腔注射(i.p)DEN，梯度給藥：30 mg/kg(1～2周)、35 mg/kg(3～4周)、40 mg/kg(5～6周)和42.5 mg/kg(7～8周)。對照組處理方法與模型組相同，取等容積0.9%生理鹽水代替DEN。每周記錄小鼠體質(zhì)量，實驗進度安排如圖1所示。為監(jiān)測肝臟纖維化形成過程，每2周處死并收集5只模型組小鼠血清和肝臟，進行動態(tài)肝功能檢測、肝臟羥脯氨酸含量測定及肝組織病理學(xué)檢查。全部給藥結(jié)束后第2天處死所有存活小鼠(模型組10只，對照組10只)，取肝組織稱質(zhì)量，部分固定于4%多聚甲醛中，進行組織病理學(xué)檢查。其余部分儲存在-80 ℃中，進行后續(xù)的肝臟羥脯氨酸含量檢測(hydroxyproline，Hyp)、Western blot檢測纖維化相關(guān)蛋白及TLR4信號通路相關(guān)蛋白。

圖1 實驗安排

1.3.2檢測肝功能相關(guān)血清生化指標：采用異氟烷麻醉動物后，通過摘眼球采血，靜置2.5 h左右，以4 ℃、3 000 r/min離心15 min，獲得血清。使用全自動生化分析儀檢測血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、總膽紅素(total bilirubin，T-BIL)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、總膽固醇(total cholesterol，T-CHO)、甘油三酯(triglyceride，TG)、白蛋白(albumin，ALB)和球蛋白(globulin，GLO)水平。

1.3.3臟器指數(shù)和肝組織羥脯氨酸含量檢測：處死小鼠后，取肝臟稱質(zhì)量，計算臟器指數(shù)，觀察小鼠臟器質(zhì)量的變化：臟器指數(shù)=(肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量)×100%。為考察小鼠肝臟膠原蛋白沉積的情況，通過檢測肝臟膠原蛋白的主要成分羥脯氨酸來進行定量，稱取肝臟50～80 mg，根據(jù)羥脯氨酸檢測試劑盒說明書，采用堿水解法測定肝組織中羥脯氨酸的含量。

1.3.4HE和Masson染色觀察肝組織病理變化：將固定在4%多聚甲醛的肝組織進行脫水-透明-包埋-切片-脫蠟-復(fù)水-染色的步驟，對切片組織采用蘇木素-伊紅染色(HE)和Masson染色后，在顯微鏡下觀察肝組織結(jié)構(gòu)變化。由兩名病理專家對肝炎癥及損傷程度(HE染色根據(jù)組織結(jié)構(gòu)完整性、炎癥浸潤及細胞壞死程度按照I0～3等級)以及肝纖維化水平(Masson染色根據(jù)METAVIR評分標準按照F0～4等級)按照量化表進行評分。

1.3.5Western blot檢測肝臟中TGF-β、α-SMA 及TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白：按照1 mg肝組織加10 μL RIPA裂解緩沖液(含有1 mmol/L PMSF)在冰水上對肝組織進行勻漿，在4 ℃、12 000 r/min離心5 min后，取上清液。使用BCA試劑盒對上清液中蛋白進行定量。通過8%或10% SDS-PAGE電泳分離等量(40 μg)蛋白，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%脫脂牛奶封閉1 h，4 ℃下與一抗TGF-β(1∶1 000)、α-SMA(1∶1 000)、TLR4(1∶500)、MyD88(1∶1 000)及NF-κB(1∶1 000)孵育過夜，洗膜三遍再與相應(yīng)二抗[山羊抗兔 IgG(1∶4 000)或山羊抗小鼠 IgG(1∶4 000)]，室溫孵育1 h。使用ECL顯影液及成像儀獲得蛋白條帶用Tanon-5200 Annlyzer軟件定量每個蛋白條帶的灰度值，與相應(yīng)的內(nèi)參蛋白：GAPDH或Lamin B對比，表示目的蛋白的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般觀察

在梯度注射8周DEN后，未出現(xiàn)小鼠死亡。造模組小鼠，第3周出現(xiàn)煩躁易怒，第5周反應(yīng)遲鈍，第7周精神萎靡。在8周內(nèi)，除初始體質(zhì)量外，模型組小鼠體質(zhì)量始終低于對照組小鼠(第1周，P<0.05；第2～8周，P<0.01)，這與臨床患者患病時，出現(xiàn)暴瘦相似。各組小鼠8周內(nèi)平均體質(zhì)量變化，如圖2所示。

圖2 小鼠生長曲線變化

2.2 血清生化指標監(jiān)測

模型組小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平(ALT及AST)分別在第4周及第6周顯著高于對照組(P<0.01)，轉(zhuǎn)氨酶水平升高是臨床上無癥狀肝病最常見的表現(xiàn)之一，表明DEN處理后小鼠肝組織出現(xiàn)損傷。模型組小鼠血清中T-BIL于第4周開始顯著高于對照組(P<0.01)，模型組ALP水平則于第2周開始顯著高于對照組(P<0.01)，表明模型組小鼠肝功能第4周后受損明顯，且與臨床上肝病初期表現(xiàn)為膽紅素與ALP顯著升高相似(臨床癥狀為膽汁淤積伴隨黃疸/瘙癢)。LDH于第6周顯著高于對照組(P<0.01)，表明小鼠在第6周時有進入肝硬化的風(fēng)險。T-CHO顯著降低(P<0.01)表明肝臟可能位于肝炎或肝硬化階段，導(dǎo)致膽汁分泌減少，進而引起脂肪吸收減少，出現(xiàn)一定營養(yǎng)不良誘發(fā)小鼠體質(zhì)量顯著下降，最終導(dǎo)致血清中甘油三酯水平下降。ALB在肝臟中合成，肝功能受損嚴重時，白蛋白合成減少，球蛋白則由于免疫反應(yīng)有所升高，這是A/G顯著下降的原因(P<0.01)，也表明肝功能顯著受損。由血清中生化指標可以看出模型組小鼠在DEN處理4周后出現(xiàn)明顯肝損傷，可能于第6周出現(xiàn)明顯肝纖維化特征，如圖3A～圖3G所示。

2.3 肝臟臟器指數(shù)及羥脯氨酸含量監(jiān)測

模型組小鼠肝臟臟器指數(shù)(圖4A)從第4周開始顯著低于對照組，可能由于小鼠體質(zhì)量顯著下降，有一定程度的營養(yǎng)不良，導(dǎo)致肝臟指數(shù)顯著下降。羥脯氨酸是膠原蛋白中含量最高的成分，也是組織纖維化時沉積的細胞外基質(zhì)主要成分之一，模型組小鼠肝組織中羥脯氨酸含量于第4周顯著高于對照組(P<0.01)，表明造模小鼠從第4周開始肝臟出現(xiàn)明顯的膠原沉積，如圖4所示。

圖4 DEN對肝臟的影響

2.4 組織病理學(xué)檢測

在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組肝竇結(jié)構(gòu)正常，肝細胞形態(tài)正常、排列整齊，呈現(xiàn)正常完整肝小葉結(jié)構(gòu)。第2周時，造模小鼠肝組織出現(xiàn)少量炎癥細胞浸潤；第4周時，肝組織出現(xiàn)少量膠原沉積；第6周時，炎癥細胞浸潤明顯，膠原沉積明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂；第8周時，模型小鼠肝組織出現(xiàn)大量纖維組織增生及穿插，將肝組織分割為大小不等的假小葉，膠原主要沉積于淋巴管周圍，纖維化周圍出現(xiàn)出血性壞死，伴隨淋巴細胞浸潤，病理結(jié)果如圖5所示。DEN注射后，肝臟炎癥損傷評分見表1 所列，纖維化評分見表2所列；與對照組相比，差異均極顯著(P<0.01)。病理檢查結(jié)果表明，DEN造模小鼠的肝纖維化發(fā)病進程最初表現(xiàn)為少量炎癥細胞浸潤，進而造成炎癥損傷導(dǎo)致膠原分泌增加，出現(xiàn)假小葉結(jié)構(gòu)，最終造成肝硬化。

圖5 DEN對小鼠肝組織病理變化的影響(×100)

表1 通過METAVIR評分系統(tǒng)統(tǒng)計分析DEN誘導(dǎo)的小鼠肝臟炎癥分期

表2 通過METAVIR評分系統(tǒng)統(tǒng)計分析DEN誘導(dǎo)的小鼠肝臟纖維化分期

2.5 肝組織TGF-β1及α-SMA表達

TGF-β1作為一個促進纖維化因子，在肝組織的炎癥及纖維化階段扮演著十分重要的角色，具有促進成纖維細胞生長、刺激膠原生成并抑制ECM降解的作用。肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活是肝纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，HSC在肝損傷后被激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞的標志則是α-SMA的顯著上調(diào)。在注射DEN后，模型小鼠肝組織中TGF-β1與α-SMA的表達均顯著上調(diào)(圖6)，表明HSC被激活。結(jié)果表明，DEN可激活小鼠肝組織中HSC，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，并在TGF-β1的作用下進一步增殖、分泌ECM(圖4B)，最終促進肝臟纖維化的發(fā)展。

圖6 DEN誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型對TGF-β1 和 α-SMA的影響

2.6 TLR4/MyD88/NF-κB信號通路檢測

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組小鼠肝組織中TLR4及其下游通路蛋白MyD88和TRAF6表達量均有所上升，且NF-κB p65在細胞質(zhì)中表達下調(diào)，而在細胞核中的表達水平上調(diào)(圖7A、圖7B)。結(jié)果表明，DEN誘導(dǎo)的小鼠肝損傷與TLR4信號通路激活密切相關(guān)，且通過TLRs的配體MyD88進一步誘使NF-κB p65進入細胞核激活炎癥反應(yīng)。

圖7 DEN誘導(dǎo)小鼠肝纖維化對TLR4信號通路表達的影響

3 討論

本研究建立了實驗性小鼠肝纖維化動態(tài)模型，復(fù)制了慢性病患者纖維化進展的特征。研究發(fā)現(xiàn)DEN誘導(dǎo)肝纖維化可能與激活TLR4/NF-κB信號通路后炎癥因子、趨化因子及炎癥介質(zhì)等表達上調(diào)相關(guān)。由炎癥信號誘發(fā)肝臟炎癥導(dǎo)致肝細胞損傷，進而激活HSC，促進纖維化的發(fā)展，表明TLR4信號通路可能與DEN誘導(dǎo)小鼠肝纖維化相關(guān)(圖8)。

圖8 二乙基亞硝胺誘導(dǎo)肝纖維化的分子機制

目前，大部分學(xué)術(shù)觀點認為肝纖維化是可逆的，但臨床上肝纖維化治療方法和療效有限[14-15]。臨床上肝硬化常通過肝活檢確診，而肝活檢是侵入性的、昂貴的檢測方法，且可能由于取樣錯誤而造成誤診并造成嚴重內(nèi)出血導(dǎo)致死亡(發(fā)生率：1.1%～1.6%)[16-17]。此外，組織病理學(xué)分期是描述性的半定量分類，用于評估肝結(jié)構(gòu)和肝纖維化，但不提供肝纖維化的定量評估。分配到組織學(xué)階段的數(shù)字與它們之間沒有定量關(guān)系，即METAVIR纖維化階段2并不意味著兩倍的纖維化階段1[17]。因此，非侵入性纖維化標志物和定量評估纖維化，可能是理想的開發(fā)和驗證方向。通過血清標志物診斷纖維化高風(fēng)險患者，或提高以血清指標進行診斷的準確性，以及進一步確立纖維化評分標準等均是利于肝纖維化的早期診斷、干預(yù)及防治。本研究通過動態(tài)監(jiān)測血清生化指標并對肝纖維化階段進行相應(yīng)的推斷，也是對肝纖維化診斷方法的優(yōu)化(表3)；而單一生化指標的變化僅能提示相關(guān)纖維化風(fēng)險，而不能對纖維化階段進行準確評估，結(jié)合多項生化指標對中晚期肝纖維化的預(yù)測具有一定可行性。其中，AST、ALT、T-BIL、ALB、A/G等已有研究報道其對酒精性肝病、非酒精性脂肪肝以及糖尿病誘發(fā)的肝病的檢測作用[17]。此外，進入肝硬化階段需警惕肝硬化相關(guān)并發(fā)癥，如肝硬化并發(fā)急性腎損傷等[5]。雖然血清檢測尚未被證明能準確反映治療后纖維化的變化，這限制了它們在疾病監(jiān)測中的作用。近期研究表明，脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)組和腸道微生物組譜以及micro RNA標記等技術(shù)在纖維化評估中具有巨大的潛力[5, 18-19]。小鼠血樣少，可檢測指標相對較少，需要進一步實驗以對生化指標進行更充足的監(jiān)測及充分利用以分析纖維化階段，血清中肝纖維化標志物也是進一步研究的重點所在。目前，轉(zhuǎn)基因小鼠較易獲得，小鼠疾病模型的建立有助于進行基因敲除治療，這是小鼠的優(yōu)勢所在。本研究建立了小鼠肝纖維化動態(tài)模型，為進一步對研究肝纖維化的發(fā)生發(fā)展機制，以及治療藥物篩選等提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

表3 血清生化指標與肝纖維化的相關(guān)性

肝纖維化是由多因素誘導(dǎo)、多細胞參與的過程：由病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、代謝性疾病、肝外科手術(shù)或肝移植、藥物毒性、致癌試劑等因素引起的肝組織細胞壞死、缺氧、免疫應(yīng)答、氧化應(yīng)激等反應(yīng)造成長期的肝臟損傷，進而激活HSC、枯否細胞、樹突狀細胞引起炎癥誘發(fā)肝纖維化[20-23]。伍振輝等[24]研究結(jié)果表明，肝纖維化過程中的關(guān)鍵角色HSC是通過激活TLR4/NF-κB信號通路激活HSC，促進TGF-β1的分泌也能激活HSC轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞并促進其增殖。TLR4受體使細胞識別革蘭氏陰性細菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素，從而啟動病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，而肝臟由于長期處于腸道菌群分泌的內(nèi)毒素環(huán)境中易產(chǎn)生免疫耐受，本研究中TLR4在肝組織中表達顯著上升也可能是肝病發(fā)展過程中打破肝臟免疫耐受的原因[25-26]。由于組織中持續(xù)損傷、炎癥細胞浸潤以及持續(xù)分泌TGF-β1，使得HSC的激活和ECM的沉積(導(dǎo)致組織重塑)成為一個慢性的、不可控的過程。ECM蛋白的不斷沉積增加了組織的硬度并損害營養(yǎng)物質(zhì)和氧的擴散，進一步促進細胞損傷和肌成纖維細胞活性，導(dǎo)致?lián)p傷的惡性循環(huán)，維持肝纖維化(特別是晚期肝纖維化)并促進其持續(xù)進展。由DEN梯度給藥建立的小鼠動態(tài)模型可應(yīng)用于炎癥相關(guān)的肝纖維化研究。

綜上所述，由DEN誘導(dǎo)肝纖維化模型，造模時間較短，纖維化結(jié)果穩(wěn)定，且死亡率低，可動態(tài)監(jiān)測纖維化發(fā)展，是值得研究的炎癥相關(guān)肝纖維化模型。注射DEN后，通過檢測肝損傷、炎癥、肝纖維化相關(guān)指標，表明DEN誘導(dǎo)肝纖維化的發(fā)生，其機制可能是通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路激發(fā)炎癥造成損傷，進一步誘導(dǎo)肝纖維化的發(fā)生。此外，可結(jié)合多項生化指標初步預(yù)測肝纖維化階段。