溫惠慧，馮云，張麗娜，張迅軼，紀(jì)亞忠*

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院，上海 200065；2.上海市普陀區(qū)婦嬰保健院，上海 200060)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是青春期及育齡期女性常見的生殖功能障礙與糖代謝異常并存的內(nèi)分泌紊亂性疾病，發(fā)病率達(dá)6.1%～19.9%，以月經(jīng)稀發(fā)、排卵障礙、高雄激素血癥和高胰島素血癥等為主要臨床表現(xiàn)[1]。由于稀發(fā)排卵或無(wú)排卵，常常伴發(fā)不孕的問(wèn)題[2]。研究表明不同類型的PCOS患者，如肥胖、高黃體生成素(LH)、高雄激素及胰島素抵抗(IR)，其輔助生殖技術(shù)(ART)的助孕結(jié)局均較非PCOS患者差，雖然發(fā)生機(jī)制各有特點(diǎn)，但不同的病理生理異常相互作用，最終多反映為卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，表現(xiàn)為PCOS患者ART治療的臨床妊娠率低、早期自然流產(chǎn)率高等特點(diǎn)[3]。

PCOS患者卵母細(xì)胞成熟障礙可能與卵泡液中某些細(xì)胞因子的異常使卵泡液微環(huán)境發(fā)生變化相關(guān)[4-5]。由于卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能直接決定胚胎結(jié)局[6]，因而通過(guò)間接研究卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的微環(huán)境，有助于尋找到評(píng)估胚胎發(fā)育潛能的新方法。因此，加強(qiáng)對(duì)卵泡液微環(huán)境的深入探索分析，有利于改善ART結(jié)局。

外泌體(exosome)最早是由細(xì)胞內(nèi)多泡體與細(xì)胞膜融合后，釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中的一種直徑約30～150 nm的膜性囊泡[7]?，F(xiàn)有疾病研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，有些微小RNA(miRNA)會(huì)通過(guò)外泌體到達(dá)其他細(xì)胞組織，為一些癌細(xì)胞營(yíng)造一個(gè)適合轉(zhuǎn)移的微環(huán)境，從而促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，造成癌癥患者較差的預(yù)后效果；因此，外泌體miRNA可以成為某些疾病的特殊標(biāo)志物[8-10]。本研究通過(guò)比較PCOS不孕患者及卵巢功能正常不孕患者卵泡液中外泌體miRNA的差異表達(dá)，探討可以用來(lái)預(yù)測(cè)胚胎質(zhì)量的生物標(biāo)志物。

材料與方法

一、研究對(duì)象

卵泡液來(lái)源：收集2017年9月至2018年2月在同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心接受ICSI助孕的24例女性不孕癥患者的卵泡液，包括12例PCOS患者(PCOS組)和12例卵巢功能正常的不孕癥患者(對(duì)照組)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：PCOS組：診斷標(biāo)準(zhǔn)參照國(guó)際通用的鹿特丹2003診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，即至少滿足以下兩個(gè)條件：(1)高雄激素血癥；(2)不排卵或排卵減少；(3)卵巢多囊。12例PCOS組患者年齡≤35歲，平均29歲，月經(jīng)第2～3天基礎(chǔ)竇卵泡計(jì)數(shù)(AFC)平均25.3個(gè)，基礎(chǔ)睪酮(T)平均1.7 ng/ml。對(duì)照組：選擇同期行ICSI治療的不孕癥患者，不孕因素為輸卵管因素或男方因素。其年齡≤35歲，平均29.4歲，月經(jīng)第2～3天AFC平均16.8個(gè)，基礎(chǔ)T平均0.2 ng/ml。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)促排卵周期數(shù)>6；(2)體質(zhì)量指數(shù)(BMI)≥25 kg/m2；(3)卵泡刺激素(FSH)>25 U/L；(4)存在子宮內(nèi)膜異位、卵巢儲(chǔ)備功能下降、染色體易位、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及脆性X染色體綜合征等影響卵母細(xì)胞質(zhì)量的疾病。

本研究通過(guò)同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者的同意及簽署了知情同意書。

二、主要試劑和儀器

1.主要試劑：RiboTMExosome Isolation Reagent(廣州銳博生物)；CD63(BD 557288)、CD81(BD 551108)單克隆抗體(BD，美國(guó))；TRIzol reagent(Invitrogen，美國(guó))；HiSeq Rapid SBS Kit V2(50 cycle)、HiSeq Rapid SR Cluster Kit V2(Illumina，美國(guó))。

2.主要儀器：低溫高速離心機(jī)(Thermo，美國(guó))；ZETASIZER Nano series-Nano-ZS(Malvern，英國(guó))；Accuri C6 flow cytomenter(BD，美國(guó))；Agilent 2200 TapeStation(芯片類型：HS D1000 Reagent)(Agilent Technologies，美國(guó))；高通量測(cè)序儀Hiseq2500(Illumina，美國(guó))。

三、卵泡液標(biāo)本收集與處理

所有患者均采用標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)方案促排卵治療。當(dāng)雙側(cè)卵巢至少有3個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥16 mm或者2個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥17 mm或1個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥18 mm時(shí)停用Gn，當(dāng)日晚21點(diǎn)肌肉注射HCG 6 000 U。36 h后，在陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵，使用16-G雙腔采卵針經(jīng)后穹隆穿刺抽吸卵泡液，于培養(yǎng)皿中用巴斯特吸管將卵泡液中的卵母細(xì)胞吸出。收集第1管無(wú)血染的澄清卵泡液，同時(shí)標(biāo)記該卵泡液對(duì)應(yīng)的卵母細(xì)胞。4℃低溫離心機(jī)下1 500g離心15 min，取上清液-80℃凍存待測(cè)。

四、卵泡液分組

不同成熟期卵母細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜不同[12]，只留取含成熟卵母細(xì)胞(MⅡ期)的卵泡液。取卵后1～2 h去除卵丘，使卵裸化，觀察卵母細(xì)胞的成熟度。采用ICSI方法授精后，放入37℃、6%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，16～18 h后觀察受精情況，見到2個(gè)原核(PN)和第2極體(Pb2)為正常受精，≥3PN或未見PN為異常受精，第3天(D3)觀察胚胎情況(剔除3PN及以上的異常受精胚胎)。根據(jù)形態(tài)學(xué)參數(shù)包括胚胎卵裂速度、胚胎中碎片所占體積百分比和卵裂球?qū)ΨQ性對(duì)早期胚胎進(jìn)行分級(jí)(一共4級(jí))和Gardner評(píng)分[13]，Ⅰ、Ⅱ級(jí)定義為優(yōu)質(zhì)胚胎，Ⅲ、Ⅳ級(jí)定義為非優(yōu)質(zhì)胚胎。將兩組研究對(duì)象的卵泡液依據(jù)D3胚胎質(zhì)量分為優(yōu)胚組[PCOS-1(n=11)、對(duì)照-1(n=15)]和非優(yōu)胚組[PCOS-2(n=11)、對(duì)照-2(n=15)]，對(duì)應(yīng)的卵泡液等量混合形成4個(gè)25 ml卵泡液池。

五、卵泡液外泌體的提取與鑒定

1.卵泡液外泌體提?。菏褂猛饷隗w提取試劑盒RiboTMExosome Isolation Reagent制備外泌體樣本，嚴(yán)格參照說(shuō)明書進(jìn)行相應(yīng)操作，即可得到外泌體。

2.外泌體的鑒定：(1)納米粒子軌跡分析(NTA)：按照儀器操作規(guī)程檢測(cè)外泌體顆粒大小和濃度；(2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)外泌體表面蛋白標(biāo)志物：取2份卵泡液外泌體提取物，加入100 μl過(guò)濾后的PBS，密封后冰上保存，1份進(jìn)行CD63和CD81抗體染色，標(biāo)記為CD63和CD81，另外1份不加抗體作為陰性對(duì)照，標(biāo)記為NC；按照儀器操作規(guī)程上機(jī)檢測(cè)。

六、外泌體miRNA高通量測(cè)序與分析

1.小RNA的文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序與分析：使用TRIzol reagent Invitrogen試劑盒分別提取4份外泌體總RNA(包括miRNA)。采用Qubit 2.0、Agilent 2200方法檢測(cè)樣品的RNA濃度和完整性，4份樣品總RNA濃度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在20～30 nt均有較高的分布。檢測(cè)合格后，以1 μg Total RNA/≥50 ng small RNA起始量進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。主要步驟為：3’adaptor連接；5’adaptor連接；第一鏈cDNA合成；PCR擴(kuò)增；用凝膠電泳法獲取插入片段在18～40 nt左右的cDNA文庫(kù)，并用Agilent 2200 TapeStation進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢。純化后cDNA峰值在160 bp，庫(kù)檢合格。用HiSeq Rapid SR Cluster Kit V2試劑盒進(jìn)行聚類分析最終生成小RNA文庫(kù)。

采用Illumina HiSeq 2500對(duì)所得文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，將測(cè)序所得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，去除接頭序列、污染部分及低質(zhì)量序列獲得干凈序列(clean reads)，將clean data與多種ncRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而注釋出已知的ncRNA(miRNA、rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA)。并與 miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)[miRBase version 21(www.mirbase.org)]中人所有miRNA前體及成熟體序列比對(duì)，對(duì)各樣本已知miRNA計(jì)算表達(dá)量，采用RPM標(biāo)準(zhǔn)化。用edger軟件進(jìn)行樣本間的差異表達(dá)分析，并計(jì)算P值。以|-log2(Fold Change)|≥1且P值<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。文庫(kù)的構(gòu)建、測(cè)序與分析均由廣州銳博生物科技有限公司完成。

2.miRNA的靶基因預(yù)測(cè)及功能注釋：使用miRanda、miRDB和miRTarBase三款軟件共同預(yù)測(cè)結(jié)果作為miRNA的候選靶基因。使用KOBAS軟件(http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/index.php)對(duì)預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行GO功能和KEGG信號(hào)通路富集分析，分別通過(guò)超幾何分布、Fisher Exact Test計(jì)算P值，以P值<0.05為顯著性閾值。

Cytoscape_v3.8.2軟件數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)獨(dú)立的軟件工具，構(gòu)建miRNA-mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)圖并標(biāo)注關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)miRNA，節(jié)點(diǎn)基因?yàn)殛P(guān)鍵基因。

結(jié) 果

一、卵泡液外泌體鑒定結(jié)果

NTA結(jié)果顯示，分離純化組分的粒徑主峰值為114.7 nm，平均粒徑30.1 nm，20～200 nm粒徑所占百分比62.9%(圖1A)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，卵泡液提取物中CD63和CD81兩個(gè)膜蛋白均有陽(yáng)性信號(hào)，CD63和CD81陽(yáng)性率分別為82.8%和98.9%(圖1B)。以上特性表明，外泌體提取成功。

A：卵泡液外泌體粒徑峰度分布圖；B：外泌體CD63和CD81的流式圖圖1 卵泡液外泌體的鑒定

二、卵泡液外泌體miRNA的表達(dá)差異情況

測(cè)序結(jié)果顯示，PCOS-1比較PCOS-2，對(duì)照-1比較對(duì)照-2，后取交集，有328個(gè)共表達(dá)的外泌體miRNA(圖2)。當(dāng)P<0.05且|-log2(Fold Change)|≥1時(shí)，卵泡液中存在9個(gè)顯著表達(dá)差異的外泌體miRNA。與優(yōu)胚組相比，非優(yōu)胚組中的外泌體miRNA有7個(gè)表達(dá)上調(diào)，2個(gè)表達(dá)下調(diào)(表1)。

圖2 卵泡液外泌體miRNA韋恩圖(共表達(dá))

表1 共表達(dá)的卵泡液外泌體miRNA差異表達(dá)譜

分析PCOS組，當(dāng)P<0.01且|-log2(Fold Change)|≥2，卵泡液中存在120個(gè)表達(dá)差異顯著的外泌體miRNA。與PCOS-1組相比，PCOS-2組中外泌體miRNA有57個(gè)表達(dá)上調(diào)，63個(gè)表達(dá)下調(diào)，聚類分析熱圖如圖3所示，火山圖如圖4A所示。

圖3 PCOS-1與PCOS-2差異表達(dá)外泌體miRNA的聚類分析熱圖(Top30)

分析對(duì)照組，當(dāng)P<0.01且|-log2(Fold Change)|≥2，卵泡液中存在8個(gè)表達(dá)差異顯著的外泌體miRNA。與對(duì)照-1組相比，對(duì)照-2組中外泌體miRNA有5個(gè)表達(dá)上調(diào)，3個(gè)表達(dá)下調(diào)(圖4B)。

圖4 差異表達(dá)外泌體miRNA的火山圖

三、差異表達(dá)外泌體miRNA的生物信息學(xué)分析

1.靶基因預(yù)測(cè)：使用miRanda、miRDB和miRTarBase軟件對(duì)共表達(dá)的差異miRNA即hsa-miR-200a-3p、hsa-miR-135a-5p、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-200a-5p進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，一共預(yù)測(cè)到427個(gè)靶基因，對(duì)這些靶基因基因進(jìn)行GO分析，結(jié)果顯示基因主要涉及蛋白結(jié)合、核酸結(jié)合等分子功能。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，主要參與P13K-Akt、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號(hào)通路(圖5)。

圖5 共表達(dá)的差異miRNA靶基因的GO富集和KEGG通路分析

PCOS組中差異miRNA靶基因預(yù)測(cè)顯示，一共預(yù)測(cè)到3 241個(gè)靶基因，對(duì)這些基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果顯示基因主要參與細(xì)胞代謝調(diào)控、細(xì)胞大分子代謝、細(xì)胞調(diào)控等生物過(guò)程，涉及離子結(jié)合、DNA結(jié)合、酶活性等分子功能。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，主要富集在絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、P13K-Akt、FoxO、粘著斑激酶(focal adhesion，F(xiàn)AK)、雷帕霉素靶分子(mTOR)、Ras/MAPK胰島素信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路以及癌癥、細(xì)胞周期等信號(hào)通路(圖6)。

圖6 PCOS組中差異表達(dá)miRNA靶基因的GO富集和KEGG通路分析

2.靶基因網(wǎng)絡(luò)分析：采用Cytoscape軟件構(gòu)建miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)共表達(dá)的差異miRNA中，hsa-miR-200a-3p、hsa-miR-141-3p共同參與調(diào)控大多數(shù)基因，對(duì)靶基因構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)MCC評(píng)分預(yù)測(cè)出GRB2、H2AFZ、PDE4D等關(guān)鍵基因(圖7)。

圖7 miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)圖及mRNA-mRNA可視化圖(共表達(dá))

PCOS組，采用Cytoscape軟件構(gòu)建miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)及靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)MCC評(píng)分預(yù)測(cè)出hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-218-5p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-320c等關(guān)鍵miRNA及UBE2K、UBE2H、VHL、PARK2等關(guān)鍵基因(圖8)。

圖8 miRNA-mRNA和mRNA-mRNA可視化相互作用圖(PCOS組)

討 論

卵母細(xì)胞發(fā)育、成熟直至卵子排出除受下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)節(jié)外，卵巢內(nèi)微環(huán)境的改變也對(duì)卵泡的發(fā)育有著至關(guān)重要的影響，并通過(guò)自分泌、旁分泌的調(diào)控途徑影響著卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育[14-15]。有研究表明，由于miRNA在血清中穩(wěn)定性好，耐受核酸酶活性，并且容易檢測(cè)[16]，血清中的miRNA可以作為PCOS的一種非侵入性的生物標(biāo)志物。然而，Long等[17]認(rèn)為大多數(shù)miRNA和來(lái)自于PCOS患者卵巢組織中的miRNA并不進(jìn)入血液，血清中的miRNA表達(dá)情況并不能有效反應(yīng)卵巢最基礎(chǔ)狀態(tài)的改變。另外，血清是一種成份復(fù)雜的混合物，要識(shí)別miRNA的細(xì)胞起源比較困難。因此，卵泡液中miRNA的研究也許對(duì)于揭示PCOS患者卵泡發(fā)育機(jī)制提供了新策略。

本項(xiàng)研究中，我們運(yùn)用深度測(cè)序分析了卵泡液外泌體miRNA的表達(dá)譜，證明了人卵泡液外泌體中存在miRNA。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，PCOS患者的外泌體miRNA表達(dá)數(shù)目明顯高于健康對(duì)照組，同時(shí)兩組間其表達(dá)量也存在明顯差異，這可能與卵巢功能有關(guān)。通過(guò)Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)分析兩組患者的外泌體miRNA表達(dá)譜，PCOS組，篩選出120個(gè)差異表達(dá)miRNA，與PCOS-1組相比，PCOS-2組有57個(gè)表達(dá)上調(diào)，63個(gè)表達(dá)下調(diào)。與對(duì)照-1組相比，對(duì)照-2組有5個(gè)表達(dá)上調(diào)，3個(gè)表達(dá)下調(diào)。這說(shuō)明與對(duì)照組相比，PCOS卵泡液外泌體miRNA表達(dá)譜發(fā)生了顯著的表達(dá)變化。

采用生物信息學(xué)技術(shù)分析差異表達(dá)的miRNA的生物學(xué)功能，預(yù)測(cè)其調(diào)控機(jī)制。我們先采用miRanda、miRDB和miRTarBase三款軟件預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA的候選靶基因。hsa-miR-200a-3p、hsa-miR-141-3p作為關(guān)鍵miRNA，共同調(diào)控靶基因參與P13K-Akt、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性等信號(hào)通路。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，P13K-AKT信號(hào)通路與始基卵泡的激活密切相關(guān)[18]。第10號(hào)染色體上磷酸酶和張力蛋白同源缺失的基因(PTEN)對(duì)P13K-AKT信號(hào)通路起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。PCOS組，hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-218-5p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-320c等關(guān)鍵miRNA調(diào)控關(guān)鍵靶基因參與代謝、細(xì)胞增殖相關(guān)的多個(gè)信號(hào)通路。已有研究報(bào)道，在卵泡閉鎖過(guò)程中，miR-26b呈現(xiàn)高表達(dá)，miR-26b可以促進(jìn)細(xì)胞DNA的斷裂引起顆粒細(xì)胞的凋亡[19]，卵泡閉鎖是由顆粒細(xì)胞凋亡促發(fā)的。miR-200家族成員包括miR-200a、miR-200b、miR-200c等，Hasuwa等[20]研究了miR-200b在雌性小鼠不孕與生育中的作用，發(fā)現(xiàn)miR-200b表達(dá)上調(diào)抑制LH的生物合成。此外，hsa-miR-200a-3p可能通過(guò)參與Wnt信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的發(fā)育，主要表現(xiàn)為抑制胚胎發(fā)育[21]。

在女性生殖系統(tǒng)中，hsa-miR-320a表達(dá)水平與卵母細(xì)胞發(fā)育情況緊密相關(guān)，其表達(dá)水平的正常維持是卵母細(xì)胞發(fā)育的必要條件。hsa-miR-320在血漿、卵泡液、顆粒細(xì)胞中均表達(dá)，其靶基因RAB5B基因在PCOS病因中具有重要作用，并可能通過(guò)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)信號(hào)通路而減少雌激素分泌。hsa-miR-320a在成熟卵母細(xì)胞的卵泡液中表達(dá)水平更高[22]。hsa-miR-320a、hsa-miR-320b與雌激素水平呈正相關(guān)，通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-320模擬物可以提高雌二醇的分泌[23]。說(shuō)明非優(yōu)質(zhì)胚胎所對(duì)應(yīng)的卵母細(xì)胞微環(huán)境中，雌激素水平表達(dá)量較低。另外，hsa-miR-320a可能通過(guò)胰島素P13K信號(hào)通路降低胰島素敏感性。

本研究將PCOS和卵巢功能正?；颊叩穆雅菀阂罁?jù)D3胚胎情況進(jìn)行分組，與既往文獻(xiàn)中僅比較PCOS和正常患者卵泡液外泌體miRNA差異表達(dá)不同，發(fā)現(xiàn)PCOS卵泡液外泌體miRNA表達(dá)水平在胚胎質(zhì)量不同的情況下會(huì)有差異，這可能受卵母細(xì)胞成熟度影響。對(duì)卵泡液外泌體miRNA的研究將有助于理解卵母細(xì)胞與卵泡微環(huán)境之間相互作用機(jī)制和卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，篩選合適的外泌體miRNA作為預(yù)測(cè)卵母細(xì)胞質(zhì)量的生物標(biāo)志物也會(huì)為ART帶來(lái)創(chuàng)新。