任雨蒙，賈瑩瑩，石程，付旻，廖禮銘，鄭曉峰，韓紅敬*

(1.北京大學人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，北京 100044；2.北京大學生命科學院，北京 100871)

胚胎著床失敗是體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術面臨的一個重要臨床問題，單次胚胎植入失敗概率約為70%。著床失敗的原因主要有兩方面：胚胎發(fā)育異常和子宮內(nèi)膜容受性差[1]。目前評估子宮內(nèi)膜容受性的方法眾多，從組織形態(tài)學到通過激素水平、蛋白質(zhì)、細胞因子以及mRNA芯片研究等對內(nèi)膜容受性進行判斷，但仍缺乏公認的有效手段。

近期研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜可以分泌細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)至宮腔液中，并通過直接影響胚胎的發(fā)育和/或調(diào)節(jié)關鍵粘附分子的表達來控制著床[2]。這些物質(zhì)以選擇性或特異性旁分泌(胚胎)和自分泌方式(子宮內(nèi)膜)遞送至靶組織。根據(jù)其大小和生物特點，EVs可以大致分為：(1)起源于胞內(nèi)小室的外泌體(exosomes)(30～100 nm)；(2)從質(zhì)膜出芽或脫落釋放的微囊泡(MVs)(100～1 000 nm)；(3)由凋亡細胞產(chǎn)生的凋亡小體(50～5 000 nm)。目前已有研究報道從人類、綿羊和小鼠的宮腔液中提取出了外泌體[3]，典型的外泌體標志物與其生物形成相關，CD81、TSG101、ALIX等已經(jīng)被公認為外泌體的標記物[4]。

與子宮內(nèi)膜活檢相比，宮腔液檢查是一種相對無創(chuàng)的方法，其可以在胚胎移植周期進行，能反映胚胎移植同一周期的內(nèi)膜容受性變化，因此引起研究者的關注。有小規(guī)模的研究表明抽吸宮腔液不影響妊娠結(jié)局[5]，但做為IVF-ET中的關鍵步驟，胚胎移植的操作應該非常慎重?；谝陨峡紤]，本研究通過對IVF-ET患者在胚胎移植前進行宮腔液抽吸，利用超速離心法提取宮腔液中的外泌體進行驗證；并與同期進行胚胎移植、未抽吸宮腔液的患者進行比較，觀察妊娠結(jié)局的差異，旨在確定胚胎移植前抽吸的宮腔液中外泌體的存在以及這一操作的安全性，以期尋找一種無創(chuàng)的子宮內(nèi)膜容受性檢測方法，為子宮內(nèi)膜容受性的研究探索新的方向。

資料與方法

一、研究對象

本研究為前瞻性隊列研究。收集2019年4月至2020年1月期間在北京大學人民醫(yī)院生殖中心接受IVF/卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)-ET的79例患者為研究對象(研究組)。納入標準：(1)第1次或第2次IVF/ICSI周期；(2)年齡范圍18～40歲；(3)取卵后第3天移植1～2枚胚胎(含至少1枚優(yōu)質(zhì)胚胎)。排除標準：(1)存在子宮或子宮內(nèi)膜病變等影響胚胎著床的因素(如子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜息肉、子宮畸形、子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜炎、宮腔粘連等)；(2)輸卵管積水未處理者；(3)宮頸黏液或白帶異常；(4)行胚胎植入前遺傳學診斷(PGD)的周期；(5)男方進行睪丸活檢者。本研究通過北京大學人民醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書，自愿參加本研究。

研究組在胚胎移植之前抽吸宮腔液并提取外泌體。按照年齡及獲卵數(shù)1∶2的配比進行匹配，獲得同期行IVF/ICSI-ET 助孕的158例患者作為對照組，對照組為同期進行胚胎移植、未抽吸宮腔液者。

二、研究方法

1.促排卵方案、黃體支持及妊娠隨訪：在月經(jīng)周期第2天早晨空腹抽血檢測性激素水平，同時經(jīng)陰道超聲評估基礎卵泡狀況。根據(jù)患者基礎竇卵泡數(shù)(AFC)、基礎內(nèi)分泌激素水平確定促排卵方案(卵泡期長方案、黃體期長方案、拮抗劑方案)；根據(jù)患者的個體情況決定促性腺激素(Gn)的啟動劑量(150～300 U)；根據(jù)卵泡生長情況及激素水平調(diào)整激素用量以獲得最理想的獲卵數(shù)。取卵同時獲取精子，若精子濃度<10×106/ml或 a 級精子百分比<10%則釆用ICSI授精。

卵泡期長方案：在月經(jīng)周期第2～5天皮下注射長效醋酸曲普瑞林(達菲林，益普生，法國)3.75 mg后30～40 d，達到降調(diào)節(jié)標準(血清E2≤183.5 pmol/L，LH≤5 U/L)后開始促排卵。每日注射重組人促卵泡激素(果納芬，默克雪蘭諾，瑞士)和/或注射用尿促卵泡素(麗申寶，珠海麗珠制藥)，酌情添加重組人促黃體生成素(樂芮，默克雪蘭諾，瑞士)。當≥2個優(yōu)勢卵泡平均直徑達18 mm時，注射重組人絨毛膜促性腺激素(艾澤，默克雪蘭諾，意大利)250 μg，36～38 h后經(jīng)陰道超聲引導下穿刺取卵。取卵后4～6 h行IVF或ICSI，受精卵在體外培養(yǎng)3 d后在超聲引導下進行胚胎移植，剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)或冷凍保存。

黃體期長方案：黃體中期注射長效醋酸曲普瑞林(達菲林，益普生，法國)0.94 mg，注射后14～21 d抽血查激素水平并行陰道超聲檢查，達到降調(diào)節(jié)標準后啟動周期，余同卵泡期長方案。

拮抗劑方案：月經(jīng)周期第2～3天開始啟動，給予Gn促排卵，給藥6 d 或卵泡直徑達到14 mm開始加用醋酸西曲瑞克(思則凱，默克雪蘭諾，德國)0.25 mg qd，直至扳機日，余同卵泡期長方案。

取卵后1 d開始黃體支持，肌內(nèi)注射黃體酮(浙江仙琚制藥)40 mg qd，同時口服地屈孕酮片(達芙通，雅培，荷蘭)10 mg bid。胚胎移植后28～30 d行超聲檢查，宮內(nèi)可見胎囊定義為臨床妊娠。孕12周內(nèi)妊娠丟失定義為早期流產(chǎn)。妊娠持續(xù)至12周后稱為持續(xù)妊娠。如胚胎種植在子宮腔以外的部位定義為異位妊娠，納入胚胎著床。

2.抽吸宮腔液和胚胎移植：所有入組患者取卵后第3天移植卵裂期胚胎，移植前患者適當憋尿充盈膀胱。胚胎移植準備如下：生理鹽水擦拭外陰及陰道，拭凈陰道分泌物，棉簽蘸取胚胎培養(yǎng)液輕輕擦拭宮頸管，將宮頸黏液盡量拭凈，腹部超聲監(jiān)測下，輕柔插入胚胎移植管(Wallace管，史密斯，英國)外套管至宮頸內(nèi)口水平，助手用5 ml注射器連接胚胎移植管內(nèi)管，在超聲監(jiān)測下輕輕插入至宮底下方，注意避免碰觸宮底，手動抽吸形成負壓緩慢移出，抽吸后將移植管中的宮腔液在500 μl的PBS緩沖液中輕輕吹打3遍，4℃放置(放置時間不超過24 h)或-20℃長期保存用于后續(xù)外泌體提取。抽吸完畢，實驗室人員按常規(guī)把胚胎裝入移植管內(nèi)管(新的內(nèi)管)，超聲監(jiān)視下進行胚胎移植，將胚胎注入宮腔內(nèi)合適部位。

3.外泌體的提取與鑒定：采用超速離心法提取外泌體，具體步驟如下：4℃下10 000g×30 min離心后取上清液；用0.22 μm濾膜過濾上清液；4℃下120 000g×1.5 h后棄上清；沉淀用15 ml PBS吹打洗滌，4℃下100 000g×1 h，沉淀即為外泌體。

透射電子顯微鏡鑒定外泌體：將10 μl外泌體混懸液滴于超薄碳支持膜銅網(wǎng)上吸附1 min；銅網(wǎng)邊緣的多余混懸液用清潔濾紙吸除，用過濾后的PBS清洗5～10 s；隨后用2%醋酸鈾負染5～10 s，重復3次；用清潔濾紙吸除銅網(wǎng)邊緣的多余染液，靜置晾干。用200 KV透射電子顯微鏡觀察并拍照。

Western Blot檢測外泌體表面標志物：提取外泌體，用BCA法測定蛋白濃度用于定量分析，-80℃保存?zhèn)溆?。?0 μg蛋白樣品，使用12% SDS-PAGE凝膠，80 V恒壓電泳0.5 h，再120 V恒壓電泳1 h；隨后200 mA恒流電轉(zhuǎn)1.5 h(根據(jù)蛋白分子量不同適當調(diào)整電泳及轉(zhuǎn)膜時間)至PVDF膜；放入5%脫脂奶粉封閉液中室溫封閉1 h；1×TBST緩沖液洗膜后加入CD81、TSG101、ALIX抗體，4℃搖床過夜；1×TBST緩沖液洗膜后，將膜與辣根過氧化物酶標記的抗IgG抗體孵育，室溫輕搖1 h，1×TBST緩沖液洗膜后加入ECL發(fā)光液顯色，測定各條帶吸光度值進行定量分析。

粒徑分析：利用ZETAVIEW顆粒電位滴定及粒度分析儀，采用激光光源照射納米顆粒懸浮液，并對納米顆粒的散射光進行檢測，通過統(tǒng)計散射顆粒的數(shù)量來計算納米顆粒濃度。同時采用納米顆粒跟蹤分析(NTA)追蹤納米顆粒布朗運動的軌跡，進而計算出單位時間間隔下納米顆粒的均方位移(MSD)，并根據(jù)NTA結(jié)果得出納米顆粒粒徑分布圖。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)(第25位百分位數(shù)，第75位百分位數(shù))[M(P25，P75)]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料以率(%)表示，組間比較采用卡方檢驗。使用Logistic單因素/多因素模型分析影響臨床妊娠、持續(xù)妊娠的因素，檢驗水準α為0.05。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、患者一般資料比較

兩組患者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、不孕年限、原發(fā)不孕比例、抗苗勒管激素(AMH)均無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)；兩組間促排卵方案占比有統(tǒng)計學差異，研究組卵泡期長方案比例顯著高于對照組，拮抗劑方案比例顯著低于對照組(P均<0.05)(表1)。兩組間不孕原因占比有統(tǒng)計學差異，研究組子宮內(nèi)膜異位癥比例顯著高于對照組(19.0% vs.8.9%，P<0.05)。

表1 兩組患者基本資料比較[M(P25，P75)，n(%)]

二、兩組患者妊娠結(jié)局比較

兩組患者的獲卵數(shù)、可利用胚胎數(shù)、臨床妊娠率、胚胎著床率及持續(xù)妊娠率均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但研究組的臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率稍高于對照組(表2)。

表2 兩組患者妊娠結(jié)局比較[M(P25，P75)，%]

三、妊娠結(jié)局的單因素及多因素相關性分析

由于兩組之間不孕原因及促排卵方案有差異，為明確這些差異對妊娠結(jié)局的影響，將年齡、BMI、不孕年限、不孕類型、不孕原因(輸卵管因素、子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征、卵巢儲備功能下降、男方因素和不明原因)、促排卵方案(卵泡期長方案、黃體期長方案和拮抗劑方案)、獲卵數(shù)、可利用胚胎數(shù)及是否提取宮腔液納入單因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示僅促排卵方案與妊娠結(jié)局相關。為了進一步排除干擾因素，結(jié)合文獻和臨床經(jīng)驗，納入可能對妊娠結(jié)局有影響的因素，包括年齡、BMI、促排卵方案及是否提取宮腔液進行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示是否提取宮腔液不影響妊娠結(jié)局，僅有黃體期長方案為影響持續(xù)妊娠率的獨立因素(P<0.05)，與持續(xù)妊娠率正相關(表3)。

表3 妊娠結(jié)局影響因素的多因素Logistic回歸分析

四、宮腔液中是否存在外泌體

本研究中所有患者均可抽吸得到微量(10 μl左右)宮腔液。約5%的宮腔液樣本出現(xiàn)血染，視為不合格樣本。其余樣本中共有62個樣本可以檢測出外泌體，13個樣本未檢測到外泌體。使用透射電子顯微鏡觀察宮腔液中提取的外泌體，可以看到有完整包膜的橢圓或圓形囊泡樣結(jié)構，直徑約50～150 nm，與外泌體的外觀和粒徑相符(圖1)；利用Western Blot對宮腔液外泌體提純產(chǎn)物進行檢測，外泌體表面標志物CD81、TSG101、ALIX陽性，進一步證實宮腔液中含有外泌體(圖2)；根據(jù)NTA結(jié)果得出納米顆粒粒徑分布圖進一步表明宮腔液中的囊狀小泡為外泌體(圖3)。

圖1 電子顯微鏡下可見直徑約50～100 nm的囊泡樣結(jié)構

樣本1在電子顯微鏡下未見明顯的囊泡樣結(jié)構，對其進行鑒定，發(fā)現(xiàn)無外泌體表面標志物表達；樣本2在電子顯微鏡下可見明確囊泡，對其進行鑒定發(fā)現(xiàn)外泌體表面標志物均表達。圖2 樣本1和2的Western Blot條帶表達示例

圖示宮腔液中囊泡粒徑多在100 nm左右，與外泌體粒徑相符。圖3 宮腔液囊泡粒徑分析的NTA結(jié)果

討 論

迄今為止，子宮內(nèi)膜容受性尚缺乏公認的評估方法，目前的臨床評估包括：組織學評估和超聲形態(tài)學評估；實驗室方面包括檢測整合素等分子標記物、蛋白質(zhì)組學、基因組學等。近年來子宮內(nèi)膜容受性陣列分析(ERA)逐漸開始用于判斷胚胎移植時機，通過比較子宮內(nèi)膜組織活檢樣本與對照組的轉(zhuǎn)錄譜，確認患者的子宮內(nèi)膜容受性狀態(tài)[6]。然而ERA只能在胚胎移植之前的模擬周期進行，借此推算出患者的個性化種植窗以便于下周期胚胎移植，因而其準確性受到一定限制。如果可以在移植的同一個周期采集標本并根據(jù)胚胎是否種植確定子宮內(nèi)膜容受性，可能為判斷子宮內(nèi)膜容受性提供新的思路，這就需要非侵入性的評估子宮內(nèi)膜容受性的新方法。

目前常用的提取宮腔液的方法有兩種：(1)宮腔沖洗：將導管插入子宮腔，一端連接裝有3.5 ml生理鹽水的注射器，將生理鹽水慢慢注入子宮腔并抽吸，重復5次[7]；(2)宮腔液抽吸：將導管插入子宮腔，在距離子宮底部1～2 cm處，用注射器輕柔吸出子宮腔內(nèi)液體[8]。宮腔液抽吸是一種獲得樣本的無創(chuàng)技術，與傳統(tǒng)的子宮內(nèi)膜活檢相比，可以不損傷子宮內(nèi)膜并且在胚胎移植周期進行。與宮腔沖洗相比，不增加宮腔積液及感染的風險。本研究結(jié)果表明在胚胎移植前提取宮腔液并不影響妊娠結(jié)局。為避免研究組與對照組不孕原因及促排卵方案的差異影響結(jié)局判斷，分別通過單因素和多因素Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)抽吸宮腔液與妊娠結(jié)局無關，僅黃體期長方案與妊娠結(jié)局有正相關。但關于促排卵方案與妊娠結(jié)局的關系目前研究結(jié)論尚有爭議，本研究結(jié)果可能與研究納入的黃體期長方案病例數(shù)較少(n=20)有關。van der Gaast等[9]在胚胎移植前收集66名不孕女性的宮腔液，并對其蛋白質(zhì)進行分析，發(fā)現(xiàn)在胚胎移植前提取宮腔液不影響妊娠結(jié)局；同時發(fā)現(xiàn)種植組與非種植組具有不同的蛋白組表達譜。本研究與既往研究結(jié)論[9]一致，即胚胎移植前抽吸宮腔液對胚胎種植是無害的。

宮腔液是一種復雜的分子混合物，主要由子宮內(nèi)膜腺上皮細胞分泌[10]，也可由免疫細胞和外泌體分泌[11]。近年來隨著對宮腔液研究的深入，發(fā)現(xiàn)宮腔液中含有蛋白質(zhì)、電解質(zhì)離子和激素等，這些物質(zhì)對于子宮內(nèi)膜容受性的建立以及受精卵的著床至關重要[12]。Bassil等[13]發(fā)現(xiàn)宮腔液的蛋白質(zhì)組成會發(fā)生周期性變化，提示其可能做為檢測子宮內(nèi)膜容受性的方式之一。有研究發(fā)現(xiàn)，敲除Wnt7a、Wnt4、Foxa2等子宮特異性基因的小鼠表現(xiàn)出子宮內(nèi)膜腺體發(fā)育不良及宮腔液成分的改變，繼而導致胚胎著床失敗[10，14]。宮腔液中眾多蛋白質(zhì)參與了母胎對話過程，如白血病抑制因子(LIF)是第1個被發(fā)現(xiàn)與胚胎著床相關的來源于子宮內(nèi)膜腺體的蛋白質(zhì)，LIF基因敲除會導致小鼠胚胎著床失敗和不孕，而胚胎著床前外源性的LIF補充可以使其受孕[10]。

目前對宮腔液成分的研究正在逐漸深入，作為一種獨特的細胞間通訊形式，外泌體在生殖和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。Blesa等[15]發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜上皮細胞釋放入宮腔液中的外泌體可能與子宮內(nèi)膜的容受性和胚胎植入有關；Machtinger等[16]發(fā)現(xiàn)宮腔液中的外泌體可以協(xié)助精子成熟、頂體反應、獲能和受精；還有研究發(fā)現(xiàn)來自于胚胎和子宮的外泌體能在宮腔液中交換信息繼而促進胚胎植入[17-18]。關于外泌體的研究表明外泌體中含有多種不同的非編碼RNA(ncRNA)，如miRNA、tsRNAs、lncRNAs和circRNAs[19-21]，有些miRNAs在與胚胎著床高度相關的生物途徑中具有潛在的靶點[9]。

本研究提出了宮腔液外泌體的提取及鑒定方法，為后續(xù)的進一步研究奠定了基礎。目前對于宮腔液及外泌體的認識還非常有限，做為一種無創(chuàng)的研究方法，宮腔液外泌體的研究將為子宮內(nèi)膜容受性評估及妊娠結(jié)局預測提供新的選擇。

但本研究尚存在一些不足之處，受樣本量及非隨機入組的影響，研究組與對照組的不孕原因和促排卵方案構成比尚存在一定差異，經(jīng)單因素及多因素分析后，提示患者妊娠結(jié)局受促排卵方案的影響，而與是否抽吸宮腔液無關。此結(jié)論有待開展進一步的隨機對照試驗(RCT)加以證實。

綜上，本研究結(jié)果提示胚胎移植前進行宮腔液抽吸不會對胚胎著床造成明顯的負面影響，同時證實宮腔液中可以檢測到外泌體以供后續(xù)研究，并且移植周期采樣能夠反映同期子宮內(nèi)膜的容受性狀態(tài)，這些成果可能為子宮內(nèi)膜容受性的預測提供新的方法。