廖夢根，王 黎，柳 焜，胡 寧，余 楊

（武漢科技大學(xué) 環(huán)境污染綠色控制與修復(fù)技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430081）

CO2是溫室氣體的主要成分之一，近年來森林的大量砍伐導(dǎo)致CO2的固定受到影響，需要找到替代的方法。利用生物電化學(xué)生產(chǎn)燃料受到了眾多科學(xué)家的廣泛關(guān)注［1-3］。在眾多CO2還原方法中，微生物電合成系統(tǒng)（MES）是最有效的方法之一，不但反應(yīng)速率可控，而且產(chǎn)物選擇性高［4］。陰極材料、陰極微生物、陰極電勢、質(zhì)子交換膜等材料的選擇會對MES系統(tǒng)的合成效果產(chǎn)生影響［5-7］。DONG等［8］通過構(gòu)造包含粒狀活性炭顆粒的流化三維電極使乙酸的體積產(chǎn)率提高了2.8倍。VU等［9］通過在MES中加入導(dǎo)電納米磁鐵使甲烷產(chǎn)率提高了22.1%。ARYAL等［10］修改3D石墨烯網(wǎng)絡(luò)，使CO2電合成乙酸的速率提高了6.8倍。陰極材料作為MES的核心可使微生物更加高效地進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，其表面可形成致密的生物膜并完成底物的質(zhì)量傳遞［11-13］。泡沫銅（CuF）的三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有電導(dǎo)率高、比表面積大、有利于微生物附著、成本低廉等優(yōu)點，完美地契合了電極材料的選擇要求。

本工作將金屬電極與碳基材料相結(jié)合，制備了還原氧化石墨烯/泡沫銅電極，對微生物沒有排斥作用，并且提高了CO2電合成有機(jī)物的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化效率。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑和儀器

MES菌種來自武漢市某污水處理廠厭氧池的活性污泥。

泡沫銅：孔隙率0.88，昆山富匯立電子有限公司；陽離子交換膜：美國萘酚公司；鈦板：歐帝富有限公司；鈦絲：歐帝富有限公司；天然鱗片狀石墨：南京嘉慧碳素材料有限公司。

所用試劑均為分析純。CO2，N2：純度大于99.999%。

XL30 ESEM-TMP型環(huán)境掃描電子顯微鏡：荷蘭Philips公司；ISC-90型高效液相色譜儀：塞默飛世爾科技公司；TRACE1300型氣相色譜儀：塞默飛世爾科技公司；PB-10型精密pH 計：上海佑科儀器儀表有限公司；218型Ag/AgCl參比電極：相對于氫標(biāo)準(zhǔn)電極電位為+197 mV，上海雷磁儀器有限公司；CHI660E型電化學(xué)工作站：上海辰華儀器有限公司。

1.2 MES

MES的陰極室與陽極室間用陽離子交換膜隔開。陽離子交換膜在使用前分別用30%（w）過氧化氫溶液、0.5 mol/L濃硫酸和去離子水煮沸1 h進(jìn)行預(yù)處理，以增加孔隙率并激活負(fù)責(zé)離子轉(zhuǎn)移的磺化基團(tuán)。陰、陽2室的有效容積均為600 mL，用直徑0.5 mm的鈦絲作導(dǎo)線，陰極以還原氧化石墨烯改性后的泡沫銅（5.00 cm×5.00 cm×0.02 cm）作為工作電極，陽極以鈦板（6.00 cm×6.00 cm×0.05 cm）作為對電極，參比電極采用Ag/AgCl電極并置于陰極電解室中。

陽極室電解液：濃度為0.05 mol/L的磷酸緩沖溶液，pH＝6.8。

陰極室液體培養(yǎng)基： K2HPO42.18 g/L，KH2PO41.70 g/L，NH4Cl 1.25 g/L，KCl 0.10 g/L，NaCl 0.80 g/L，MgCl2·6H2O 1.00 g/L，CaCl2·2H2O 0.30 g/L，NaHCO32.50 g/L，維生素溶液 10 mL/L，微量元素溶液 10 mL/L，pH ＝6.8。

1.3 實驗方法

1.3.1 氧化石墨烯的制備

先用改良Hammers法［14］制備氧化石墨烯。用稀鹽酸洗滌產(chǎn)物至pH=7，再用去離子水充分洗滌至濾液中無SO42-，最后用真空干燥箱干燥24 h。

1.3.2 還原氧化石墨烯/泡沫銅電極的制備

按照文獻(xiàn)［10］的方法將氧化石墨烯涂覆在泡沫銅上，隨后將覆蓋氧化石墨烯的泡沫銅用60 mL含量為0.5 mg/mL的抗壞血酸溶液還原2 h。用超純水充分洗滌還原氧化石墨烯/泡沫銅電極，最后將還原氧化石墨烯/泡沫銅電極放入真空干燥箱干燥12 h。

1.3.3 MES中有機(jī)物的CO2還原合成

分別取50 mL馴化好的活性污泥接入改性泡沫銅MES（改性后MES）［10］和未改性泡沫銅MES（改性前MES）中，同時在陰極室中加入500 mL液體培養(yǎng)基。通過向陰極室中加入2-溴乙基磺酸鈉抑制污泥中產(chǎn)甲烷菌的活性［15］。設(shè)置陰極電勢為-0.8 V（vs Ag/AgCl），反應(yīng)溫度為（36±1）℃，陰極液pH為（6.0±0.1）。在陰極室的底部通入CO2進(jìn)行微孔曝氣（曝氣流量20 mL/min，曝氣時間40 min，靜止時間4 h）。陽極進(jìn)行沒有微生物的氧化反應(yīng)，陰極進(jìn)行有電化學(xué)功能菌的還原反應(yīng)。反應(yīng)溫度用數(shù)顯恒溫水浴鍋進(jìn)行控制，反應(yīng)裝置穩(wěn)定運(yùn)行即成功啟動。同時設(shè)置無微生物對照組，其運(yùn)行條件均與實驗組一致。

1.4 分析方法

1.4.1 微生物形態(tài)的SEM表征

用無菌剪刀從陰極泡沫銅上剪取1 cm×1 cm大小的薄片，用w=2.5%的戊二醛溶液固定24 h；分別用w=25%，50%，70%，85%，95%，100%的乙醇各脫水1次，每次15 min；最后用乙酸異戊酯置換2次，每次15 min。試樣干燥后噴金，采用掃描電子顯微鏡觀察陰極電極上微生物的形態(tài)。

1.4.2 電化學(xué)分析

MES穩(wěn)定運(yùn)行一段時間后，陽極連接對電極，陰極連接工作電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，記錄電流隨時間的變化情況。在本研究中，所有的電位數(shù)據(jù)均相對于Ag/AgCl參比電極，電壓輸出、電流監(jiān)測均采用電化學(xué)工作站。一個周期運(yùn)行結(jié)束后，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對時間與電流積分，計算出一個運(yùn)行周期輸入的電量。設(shè)置工作電壓為-0.8 V，掃描頻率為0.01 kHz～100 kHz，振幅為5 mV，通過等效電路模型得到陰極的電化學(xué)阻抗。利用電化學(xué)工作站對MES進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃描參數(shù)：掃描電勢范圍-1.0 V ～0.8 V，掃描頻率0.005 V/s。

1.4.3 電化學(xué)功能菌的DNA高通量測序

采用454高通量測序技術(shù)［16］對MES反應(yīng)前和反應(yīng)10 d后還原氧化石墨烯/泡沫銅電極表面的微生物群落進(jìn)行DNA高通量測序。

2 結(jié)果與討論

2.1 SEM分析

改性前后泡沫銅電極的SEM照片見圖1。由圖1a可以看出泡沫銅的表面為三維多層孔洞結(jié)構(gòu)，為其提供更大的比表面積。由圖1b可見少量微生物附著在泡沫銅表面。由圖1c可以明顯看到改性后的泡沫銅電極表面覆蓋了一層還原氧化石墨烯，顯著增加其比表面積。由圖1d可見，改性的泡沫銅電極表面附著了更多的微生物，微生物的形態(tài)多樣，主要以桿狀菌為主，且微生物主要附著在還原氧化石墨烯上。這表明還原氧化石墨烯相比泡沫銅更有利于微生物的附著生長，改性后的電極材料具有良好的生物親和性。

圖1 改性前后泡沫銅電極的SEM照片

2.2 電化學(xué)分析

2.2.1 電流

在MES運(yùn)行期間，用電化學(xué)工作站記錄改性前后MES與無微生物對照組的電流變化情況，其電流隨反應(yīng)時間的變化見圖2。

由圖2可見，在改性前MES的最大電流為26.28 mA，改性后MES的最大電流為34.09 mA。此結(jié)果表明還原氧化石墨烯改性MES可以提高陰極電流，這是因為泡沫銅電極經(jīng)過改性后提高了比表面積，使得反應(yīng)過程中電子的傳遞量增加，并且還原氧化石墨烯自身就具有導(dǎo)電性，因而MES的電流增大。無微生物對照組在外加電勢相同的情況下幾乎沒有產(chǎn)生電流。而系統(tǒng)中電流越大也就意味著陰極得到的激發(fā)態(tài)電子越多，陰極發(fā)生催化還原的反應(yīng)越劇烈，越有利于電化學(xué)功能菌還原CO2生成有機(jī)物。

圖2 MES電流隨反應(yīng)時間的變化

2.2.2 循環(huán)伏安曲線

MES的循環(huán)伏安曲線見圖3。由圖3可見：改性前MES和改性后MES與對照組相比，一個反應(yīng)周期結(jié)束后的電流相應(yīng)增加，表明實驗組具有生物膜的陰極的電化學(xué)活性較高；改性前MES的循環(huán)伏安曲線在-0.50 V左右處出現(xiàn)了一個還原峰，改性后MES的循環(huán)伏安曲線在-0.63 V附近處出現(xiàn)了還原峰，與對照組比對，可以排除是因為析氫反應(yīng)造成的，由此確定該峰為CO2的還原峰；MES的循環(huán)伏安曲線為非對稱曲線，表明CO2還原過程是不可逆的。以上結(jié)果表明，采用微生物陰極構(gòu)建的微生物電化學(xué)合成系統(tǒng)確實可以降低CO2還原的過電位。

圖3 MES的循環(huán)伏安曲線

2.2.3 電化學(xué)阻抗譜

改性前后生物陰極電極的電化學(xué)交流阻抗譜圖見圖4。

圖4 改性前后生物陰極電極的電化學(xué)交流阻抗譜圖

由圖4可見：電化學(xué)交流阻抗譜圖均由兩部分組成，一部分為半圓弧型的高頻區(qū)，另一部分為斜直線的低頻區(qū)；高頻區(qū)半圓弧曲線描述的是反應(yīng)物在電極表面處發(fā)生氧化還原反應(yīng)時的反應(yīng)阻抗，圓弧直徑與MES系統(tǒng)的電荷轉(zhuǎn)移電阻成正比；低頻區(qū)的斜線表示反應(yīng)底物在電極表面擴(kuò)散時的擴(kuò)散阻抗，影響擴(kuò)散阻抗的主要因素是涂層材料的微觀結(jié)構(gòu)，其斜線的長度與擴(kuò)散阻抗呈正相關(guān)。

圖4的等效電路見圖5。根據(jù)圖5對生物陰極電極電化學(xué)交流阻抗譜的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到的擬合參數(shù)見表1。由表1可見，改性前生物陰極電極和改性后生物陰極電極的電荷轉(zhuǎn)移電阻分別為39.75 Ω和30.84 Ω，均高于對照組，表明生物陰極電極掛膜和改性后能顯著提高電子傳遞速率，從而提高產(chǎn)酸和產(chǎn)氣效果；另外，對比改性前后陰極電極的內(nèi)阻發(fā)現(xiàn)，對照組的內(nèi)阻為26.07 Ω，改性后生物陰極電極的內(nèi)阻為44.06 Ω，表明陰極電極掛膜后和改性后提高了電極的內(nèi)阻；而改性前生物陰極電極的內(nèi)阻為62.09 Ω，對比改性前后內(nèi)阻發(fā)現(xiàn)，改性后生物陰極電極的內(nèi)阻更低，表明生物陰極改性可以降低系統(tǒng)生物陰極內(nèi)阻。

圖5 生物陰極電極電化學(xué)交流阻抗譜的等效電路

表1 生物陰極電極電化學(xué)交流阻抗譜等效電路的擬合參數(shù)

2.3 MES的有機(jī)物產(chǎn)量

在外加陰極電勢為-0.8 V的條件下，改性前后MES的乙酸、丁酸產(chǎn)量和pH的變化見圖6。由圖6可見：在改性前MES的反應(yīng)周期內(nèi)，陰極室中第一天就能測到乙酸的生成，其質(zhì)量濃度為57.0 mg/L；而丁酸的生成是在反應(yīng)周期的第3天開始的，在第4天時質(zhì)量濃度達(dá)到10.3 mg/L，反應(yīng)進(jìn)行到第10天時乙酸生成速率明顯減慢，乙酸和丁酸的積累量達(dá)到最大，質(zhì)量濃度分別為246.0 mg/L和90.4 mg/L，這可能是由于隨著反應(yīng)進(jìn)行，部分乙酸通過鏈延長的方式轉(zhuǎn)化成了丁酸［17］，導(dǎo)致乙酸生成速率的下降；隨著乙酸、丁酸的積累，pH數(shù)值從7.1下降至6.3。

圖6 改性前后MES的乙酸、丁酸產(chǎn)量和pH的變化

由圖6還可見：在改性后MES的反應(yīng)周期內(nèi)，乙酸的積累量隨著反應(yīng)的進(jìn)行呈現(xiàn)出先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢，而丁酸的生成比改性前MES提前了1 d；pH隨著乙酸、丁酸的積累，數(shù)值從7.1下降至6.0，相比于改性前數(shù)值略微降低，原因主要是乙酸、丁酸產(chǎn)量相對增多；經(jīng)過10 d的積累，乙酸的質(zhì)量濃度最終達(dá)到265.0 mg/L，丁酸的質(zhì)量濃度最終達(dá)到122.5 mg/L，相比于改性前分別增長了8%和35%。

2.4 電化學(xué)功能菌的DNA高通量測序

將MES反應(yīng)前和反應(yīng)10 d后還原氧化石墨烯/泡沫銅電極表面微生物群落的DNA高通量測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比較，在科水平上進(jìn)行分類，得到還原氧化石墨烯/泡沫銅電極表面的微生物菌群結(jié)構(gòu)，見圖7。

圖7 還原氧化石墨烯/泡沫銅電極表面的微生物菌群結(jié)構(gòu)

由圖7可見：反應(yīng)前電極表面的優(yōu)勢菌種分屬于瘤球菌科（Ruminococcaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、乳酸細(xì)菌科（Lactobacillaceae）、消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）和芽孢桿菌科（Bacillaceae），相對豐度分別為28.97%、26.48%、12.37%、10.83%、10.19%和6.06%；反應(yīng)后電極表面優(yōu)勢菌種主要分屬于瘤球菌科和梭菌科［18-19］，其相對豐度分別為57.52%和34.69%；相對于反應(yīng)前的優(yōu)勢菌種，反應(yīng)后電極表面瘤球菌科和梭菌科細(xì)菌的相對豐度分別提高0.98倍和0.31倍，其他菌種由于不適應(yīng)環(huán)境而數(shù)量大幅減少。目前有較多文獻(xiàn)報道表明梭菌科細(xì)菌可以利用電子和質(zhì)子還原CO2生成乙酸、丁酸，而瘤球菌科細(xì)菌的主要產(chǎn)物為乙酸［13，20］。通過DNA高通量測序進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，通過生物陰極外加電勢確實可以改善MES生物陰極表面生物膜上的菌群結(jié)構(gòu)，篩選出能夠利用CO2的具有電化學(xué)活性的微生物。

3 結(jié)論

a）泡沫銅電極經(jīng)還原氧化石墨烯改性后，三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更有利于微生物的附著，同時表現(xiàn)出更好的電化學(xué)性能。改性后的陰極電極不僅能夠降低CO2還原的過電位，而且還具有更好的催化性能。

b）在外加陰極電勢為-0.8 V條件下，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到第10天時，改性前MES中乙酸和丁酸的積累量達(dá)到最大，質(zhì)量濃度分別為246.0 mg/L和90.4 mg/L；改性后MES中乙酸和丁酸的最終質(zhì)量濃度分別達(dá)到265.0 mg/L和122.5 mg/L，相比于改性前分別增長了8%和35%。

c）反應(yīng)后還原氧化石墨烯/泡沫銅電極表面瘤球菌科（Ruminococcaceae）和梭菌科（Clostridiaceae）細(xì)菌的相對豐度相比反應(yīng)前分別提高0.98倍和0.31倍，其豐度分別為57.52%和34.69%。其他菌種由于不適應(yīng)環(huán)境而數(shù)量大幅減少。