陳 諾，趙芝清，鄭夢(mèng)婷，雷宇芬，沈駱秦，吳燕君

（衢州學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院，浙江 衢州 324000）

有機(jī)氟化物因其優(yōu)異的性能廣泛應(yīng)用于制藥、印染、化工、軍事等領(lǐng)域［1-2］。然而，除了自然界存在的五十幾種外，有機(jī)氟化物大多為人工合成，屬于難生物降解化合物，在水體、土壤、大氣中均有所累積，且具有“三致”性［3-5］。目前，含氟化合物的有效處理已成為研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。迄今為止，相關(guān)學(xué)者已報(bào)道了化學(xué)法［6］、物理法［7］和生物法［8］等含氟化合物處理方法。其中，生物法因其處理成本低、不易產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)備受青睞。生物強(qiáng)化技術(shù)是指向生物處理系統(tǒng)中引入具有特定降解功能的微生物，提高有效微生物的濃度，從而改善原有生物處理體系的廢水處理效果［9］。近年來，相關(guān)學(xué)者已從環(huán)境中分離得到了多株有機(jī)氟化物高效降解菌［10-12］。生物強(qiáng)化技術(shù)成敗的關(guān)鍵是降解功能菌株能否快速定植，而生物膜的形成對(duì)菌株的定植具有重要影響。生物膜形成過程中，除受微生物自身一些內(nèi)在機(jī)制調(diào)控外［13-14］，還受水質(zhì)條件和水力條件等影響，如pH、鹽度和重金屬等［15］，而當(dāng)前有關(guān)此方面的研究甚少。

本研究以前期篩選得到的一株4-氟苯胺（4-FA）高效降解菌——假單胞菌FA4（Pseudomonassp. FA4）為研究對(duì)象，重點(diǎn)考察了pH、重金屬等環(huán)境因子對(duì)其降解性能和生物膜形成的影響，以期為調(diào)控該菌株在實(shí)際廢水處理中的應(yīng)用提供理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑和儀器

所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

4-FA高效降解菌：本課題組前期篩選得到的假單胞菌（Pseudomonassp.），命名為菌株FA4。

培養(yǎng)基：4-FA0.5 g/L，Na2HPO4·2H2O 2.7 g/L，（NH4）2SO40.5 g/L，MgCl20.2 g/L，KH2PO41.4 g/L，CaCl20.01 g/L，酵母提取物 0.02 g/L，微量元素溶液Ⅰ和溶液Ⅱ［16］各1.0 mL/L，pH 7.2。121 ℃高壓滅菌30 min。固體培養(yǎng)基中瓊脂含量為15～20 g/L，半固體培養(yǎng)基中瓊脂含量為5～8 g/L。

Waters高效液相色譜儀：2487型雙波長紫外檢測(cè)器，717型自動(dòng)進(jìn)樣器，沃特世科技（上海）有限公司；Amethyst C18型色譜柱：4.6 mm×250 mm，填料粒徑5 μm，蘇州賽分科技有限公司；722N型可見光分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；Sigma 1-13型離心機(jī)：德國Sigma實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)股份有限公司。

1.2 菌株FA4降解能力的影響

設(shè)置不同環(huán)境因子（4-FA初始質(zhì)量濃度、pH、重金屬種類），考察菌株FA4降解能力的變化：1） 按10%的接種量將600 nm處吸光度（OD600）約為0.5的菌液分別接種至含100～2 400 mg/L 4-FA的培養(yǎng)基中，以30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)3～4 d后，取樣測(cè)定4-FA和氟離子的質(zhì)量濃度、溶液OD600以及1，2-雙加氧酶和2，3-雙加氧酶的酶活；2）用濃度為1.0 mol/L的HCl和NaOH 溶液分別調(diào)整培養(yǎng)基pH為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10，接種振蕩培養(yǎng)3～4 d后取樣分析；3）分別稱取一定量的重鉻酸鉀、氯化鎳、氯化銅和氯化鋅至培養(yǎng)基中，使Cr（Ⅵ）、Ni2+、Zn2+和Cu2+的質(zhì)量濃度均為10 mg/L，接種振蕩培養(yǎng)3～4 d后取樣分析，同時(shí)設(shè)置不投加金屬離子的對(duì)照組，記為CK。

1.3 生物膜形成的影響

基于實(shí)際廢水組分，重點(diǎn)考察了pH、金屬離子種類和NaCl質(zhì)量濃度對(duì)菌株FA4生物膜形成的影響，具體條件如下：1）用HCl和NaOH溶液分別將培養(yǎng)基pH調(diào)至5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，分別取2 mL培養(yǎng)基裝至18支φ10 mm×75 mm試管中，在接種量10%、30 ℃、120 r/min條件下接種、振蕩培養(yǎng)3～4 d；2）向培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的Cu2+、Zn2+、Cr（Ⅵ）和Ni2+，設(shè)置0，1，5，10，20 mg/L 5個(gè)水平，培養(yǎng)條件同上；3）向培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量的NaCl，使NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0，0.10%，0.25%，0.50%，1.00%，2.00%，培養(yǎng)條件同上。培養(yǎng)完成后測(cè)定生物膜形成量，每個(gè)水平設(shè)置3個(gè)平行試樣。

1.4 細(xì)菌群游能力的影響

分別配制不同pH（5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0）、不同NaCl質(zhì)量濃度（0，0.10%，0.25%，0.50%，1.00%）和分別含10 mg/L金屬離子（Cu2+、Zn2+、Cr（Ⅵ）和Ni2+）的半固體培養(yǎng)基，接種OD600約為0.5的菌液1 μL，30 ℃培養(yǎng)3～4 d后測(cè)定細(xì)菌群游直徑［17］。每個(gè)水平設(shè)置3個(gè)平行試樣。

1.5 分析方法

4-FA的質(zhì)量濃度采用高效液相色譜法測(cè)定［16］：水樣經(jīng)12 000 r/min離心5 min并經(jīng)過0.22 μm水系濾膜過濾；流動(dòng)相為甲醇-水溶液（體積比7∶3），柱溫 35 ℃，檢測(cè)波長為230 nm。

1，2-雙加氧酶和2，3-雙加氧酶的酶活測(cè)定方法見文獻(xiàn)［16］；氟離子質(zhì)量濃度的測(cè)定采用氟離子電極法［18］；OD600的測(cè)定采用可見光分光光度法。

生物膜形成量的測(cè)定采用結(jié)晶紫染色法［17］：試管管壁上的生物膜以結(jié)晶紫染色后再用乙醇-丙酮溶液（體積比80∶20）洗脫，測(cè)定洗脫液在波長570 nm處的吸光度（OD570），以O(shè)D570表征生物膜形成量。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同因子對(duì)菌株降解4-FA、脫氟及生長的影響

2.1.1 初始濃度

4-FA初始濃度對(duì)菌株FA4降解能力的影響見圖1。由圖1可知：菌株FA4可有效降解初始質(zhì)量濃度為100～2 400 mg/L的4-FA，去除率維持在90.00%以上；隨4-FA初始質(zhì)量濃度的增大，脫氟率由80.00%左右降至42.90%（最高80.60%），OD600則先由0.139升至0.763再降至0.696。SONG等［8］報(bào)道4-FA降解菌株羅爾斯通氏菌（Ralstoniasp.）FD-1的最高可降解質(zhì)量濃度為1 500 mg/L，故菌株FA4具有良好的降解能力。

圖1 4-FA初始質(zhì)量濃度對(duì)菌株FA4降解能力的影響

采用質(zhì)量濃度為500 mg/L的4-FA培養(yǎng)3 d后，測(cè)定菌液的酶活。結(jié)果顯示，菌液的1，2-雙加氧酶的酶活為（0.027 0±0.002 5）μmol/（mg·min）（以每mg蛋白計(jì)），2，3-雙加氧酶的酶活基本未檢測(cè)到。由此可推測(cè)，4-FA主要通過鄰位開環(huán)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化降解。

2.1.2 金屬離子種類

不同金屬離子的種類和濃度會(huì)對(duì)生化處理系統(tǒng)產(chǎn)生不同的毒性。WANG等［19］研究發(fā)現(xiàn)，5 mg/L的Ni2+對(duì)生化系統(tǒng)的TOC去除率影響不大，而當(dāng)質(zhì)量濃度升至10 mg/L時(shí)則呈現(xiàn)明顯的抑制。CHENG等［20］報(bào)道，5 mg/L的Cr（Ⅵ）即可使生化處理系統(tǒng)的基質(zhì)去除率急劇下降。鮑雪飛［21］研究發(fā)現(xiàn)，9 mg/L的Cu2+可使生物系統(tǒng)的COD去降率下降54.11%。鑒于此，重點(diǎn)考察了10 mg/L的Ni2+、Zn2+、Cu2+和Cr（Ⅵ）對(duì)菌株降解能力的影響。在質(zhì)量濃度均為10 mg/L的條件下，金屬離子種類對(duì)菌株FA4降解能力的影響見圖2。由圖2可知：相比CK，10 mg/L Ni2+和Cr（Ⅵ）均對(duì)4-FA去除率無較大影響；Zn2+對(duì)脫氟過程呈現(xiàn)了促進(jìn)作用；而Cu2+則呈現(xiàn)了較為明顯的抑制作用，4-FA去除率從100%降至53.44%，脫氟率則由76.82%降至3.44%?？梢姡闒A4對(duì)Ni2+、Zn2+和Cr（Ⅵ）具有良好的耐受能力。另一方面，在Ni2+、Zn2+、Cu2+和Cr（Ⅵ）存在下，相比CK，OD600均有所增加，分別由0.250增至0.286、0.305、0.407和0.333。金屬離子環(huán)境下，為了保護(hù)細(xì)胞免受侵害，微生物通常會(huì)分泌出更多的胞外聚合物（EPS），從而影響了OD600的測(cè)定。

圖2 金屬離子種類對(duì)菌株FA4降解能力的影響

2.1.3 pH

pH對(duì)菌株FA4降解能力的影響見圖3。由圖3可見：當(dāng)pH為6.0～10.0時(shí)，4-FA去除率基本維持在99%以上，脫氟率則隨著pH增大而先增加后減小，于pH=7.0時(shí)達(dá)到最大（90.00%）；當(dāng)pH=6.0時(shí)，4-FA去除率、脫氟率和OD600分別為99.67%、65.63%和0.162；而當(dāng)pH降至5.0時(shí)，4-FA去除率、脫氟率和OD600分別降至53.72%、5.51%和0.093。這說明菌株FA4更適宜在中性的環(huán)境中生長。

圖3 pH對(duì)菌株FA4降解能力的影響

2.2 不同因子對(duì)菌株FA4生物膜形成的影響

生物膜是細(xì)菌細(xì)胞在受到pH、鹽度等環(huán)境因子的刺激或誘導(dǎo)后，發(fā)展出的一種具有“應(yīng)激”特征的集體生長形態(tài)［22-23］，其形成過程因細(xì)菌的種類而異。

2.2.1 pH

pH對(duì)菌株FA4染色洗脫液OD570的影響見圖4。由圖4可見，當(dāng)pH由5.0升至10.0時(shí)，OD570先增大后減少，當(dāng)pH為7.0時(shí)達(dá)到最大（0.236），pH為6.0和8.0時(shí)次之，基本與降解特性變化趨勢(shì)一致（見圖3）。表明中性環(huán)境更有利于生物膜的形成，偏酸或偏堿的環(huán)境不利于生物膜的形成。

圖4 pH對(duì)菌株FA4染色洗脫液OD570的影響

2.2.2 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)

NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌株FA4染色洗脫液OD570的影響見圖5。

圖5 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌株FA4染色洗脫液OD570的影響

由圖5可見：當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～0.25%時(shí)，OD570約為0.203，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加OD570基本保持不變，可能是因?yàn)榈蜐舛萅aCl對(duì)菌的生長無影響，沒有激發(fā)菌株的“應(yīng)激”響應(yīng)體系；當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步提升至0.50%和1.00%時(shí)，OD570分別為0.267和0.296，表明生物膜形成量明顯增大，可能是因?yàn)榫暝诿{迫條件下啟動(dòng)了“應(yīng)激”自我保護(hù)，分泌了較多的EPS，從而提高了生物膜形成量；而當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加到2.00%時(shí)，OD570約為0.219，表明生物膜形成量顯著下降，可能是由于NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高導(dǎo)致脫氫酶失活，菌體無法分泌更多的EPS進(jìn)行自我保護(hù)。張?zhí)m河等［24］研究發(fā)現(xiàn)，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.5%時(shí)微生物產(chǎn)生的EPS相對(duì)穩(wěn)定，而當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.5%時(shí)，EPS也快速增多，以抵抗?jié)B透壓升高對(duì)細(xì)胞的破壞?？梢?，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%～1.00%的生長環(huán)境有利于菌株FA4生物膜的形成，這也與熊富忠等［15］的研究結(jié)論基本一致。

2.2.3 重金屬種類及濃度

重金屬種類及濃度對(duì)菌株FA4染色洗脫液OD570的影響見圖6。由圖6可見：Cu2+，Zn2+，Cr（Ⅵ）質(zhì)量濃度為0～20 mg/L時(shí)，Cu2+，Zn2+，Cr（Ⅵ）對(duì)OD570均未有明顯的影響；未添加Ni2+培養(yǎng)時(shí)的OD570為0.269，添加1，5，10，20 mg/L的Ni2+后的OD570分別為0.325，0.509，0.450，0.476，經(jīng)差異性分析發(fā)現(xiàn)，5～20 mg/L的Ni2+對(duì)生物膜形成具有促進(jìn)作用，與相關(guān)報(bào)道一致［25］。因此，投加5～20 mg/L的Ni2+有利于促進(jìn)菌株FA4生物膜的形成。

圖6 重金屬種類及濃度對(duì)菌株FA4染色洗脫液OD570的影響

2.3 菌株FA4的群游能力

具有強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力的細(xì)菌通常能快速與材料表面發(fā)生初始黏附，繼而增殖、擴(kuò)張，形成生物膜［26］。不同環(huán)境因子條件下菌株FA4的群游直徑見圖7。由圖7a可見，當(dāng)pH由5.0升至10.0時(shí)，群游直徑先增大后減少，其中當(dāng)pH為7.0時(shí)達(dá)到最大，為5 mm。由圖7b可見，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%～1.00%時(shí)，群游能力與NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0時(shí)基本相當(dāng)，維持在4～5 mm，而當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加到2.00%時(shí)，群游能力則顯著減小，僅為3 mm。由圖7c可見，相比CK，10 mg/L的 Cu2+和Cr（Ⅵ）使菌株FA4的群游能力有所降低，而Zn2+和Ni2+對(duì)群游能力的影響不明顯。該結(jié)果基本與2.23節(jié)的結(jié)論相一致。

圖7 不同環(huán)境因子條件下菌株FA4的群游直徑

3 結(jié)論

a）菌株FA4能有效降解質(zhì)量濃度為100～2 400 mg/L的4-FA，4-FA去除率維持在90.00%以上，脫氟率為42.90%～80.60%。菌株FA4最適生長pH為7.0，對(duì)10 mg/L 的Ni2+、Zn2+和Cr（Ⅵ）具有良好的耐受能力。

b）菌株FA4生物膜形成的最適條件為pH=7.0、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.50%～1.00%，投加5～20 mg/L的Ni2+可促進(jìn)菌株FA4生物膜的形成。

c）就菌株FA4群游能力而言，最適條件為pH=7.0、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0 ～1.00%，10 mg/L的Zn2+和Ni2+均未對(duì)菌株FA4群游能力產(chǎn)生明顯影響。