李竹英，陳 璐，王麗潔

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，黑龍江 哈爾濱 150040)

哮喘是一種由多種炎性細(xì)胞及其組分參與，以可逆性氣流受限為主的氣道異質(zhì)性疾病。慢阻肺以持續(xù)氣流受限為特征，并呈進(jìn)行性進(jìn)展的可防治的慢性炎癥性疾病。麻黃-白果藥對配伍出自《攝生眾妙方》定喘湯經(jīng)典方中君藥藥對，主治素體肺虛，痰濁內(nèi)蘊(yùn)之證。麻黃辛溫，既解表散寒，又宣肺平喘?，F(xiàn)代藥理研究表明，麻黃具有抗炎、平喘、鎮(zhèn)咳、緩解支氣管平滑肌痙攣、抗過敏等作用[1-2]。白果甘苦澀平，為斂肺化痰定喘要藥。現(xiàn)代藥理研究表明,白果具有平喘、祛痰、松弛氣管平滑肌、免疫抑制、抗過敏、抗菌等作用[3-4]。二藥配對，既使肺氣有開有合，增強(qiáng)平喘之效，又可宣肺而不耗氣，斂肺而不留邪，共奏宣降肺氣、祛痰平喘之功,是臨床上治療哮喘和慢阻肺的常用藥對?，F(xiàn)階段對麻黃-白果藥對治療哮喘和慢阻肺的共同機(jī)理研究相對欠缺，因此本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，以中醫(yī)“異病同治”的角度為切入點(diǎn)，探討麻黃-白果藥對治療哮喘和慢阻肺的作用機(jī)制，為其深入研究及臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 麻黃-白果藥對活性成分及靶點(diǎn)獲取 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP),以口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)篩選出麻黃-白果藥對的活性成分及其潛在作用靶點(diǎn)[5],然后利用Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫校正潛在作用靶點(diǎn)的基因名。

1.2 哮喘和慢阻肺相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 分別以Asthma和COPD為檢索詞從Genecards數(shù)據(jù)庫中檢索哮喘和慢阻肺的相關(guān)靶點(diǎn),取相關(guān)性分?jǐn)?shù)大于2倍中位數(shù)的靶點(diǎn)基因與藥對預(yù)測靶點(diǎn)通過Venny進(jìn)行比對得到共同靶點(diǎn)。

1.3 藥對-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將藥對活性成分及獲取的共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape中構(gòu)建藥對-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫,篩選出combined score>0.9的PPI數(shù)據(jù)并導(dǎo)入Cytoscape中構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 KEGG通路富集分析 基于R語言軟件，利用Bioconductor生物信息軟件包對共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析及可視化處理。

1.6 分子對接驗證 將構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)中度值排名前5的化合物和PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名前5的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，評估化合物和靶點(diǎn)蛋白之間的結(jié)合潛力，驗證網(wǎng)絡(luò)分析的可靠性。首先在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲取化合物結(jié)構(gòu)，通過PDB數(shù)據(jù)庫獲得種屬來源為人類且分辨率較高的靶點(diǎn)蛋白受體結(jié)構(gòu)，然后利用Autodock Vina軟件進(jìn)行分子對接和結(jié)合能打分。最后利用Discovery Studio將對接結(jié)果可視化。

2 結(jié) 果

2.1 麻黃-白果藥對活性成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果 篩選出符合標(biāo)準(zhǔn)的麻黃活性成分19個，白果活性成分11個，其中共有的活性成分5個。將所獲得的活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白名導(dǎo)入Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化，刪除重復(fù)項，共得到麻黃-白果藥對活性成分的預(yù)測靶點(diǎn)288個。

2.2 共同靶點(diǎn)的獲取結(jié)果 通過篩選獲取到哮喘相關(guān)靶點(diǎn)1475個，慢阻肺相關(guān)靶點(diǎn)2059個，與288個預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)行映射取交集得到共同靶點(diǎn)108個。

2.3 藥對-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 網(wǎng)絡(luò)中共有137個節(jié)點(diǎn)和654條邊(圖1)。度值排名前5位的化合物依次為槲皮素134、山奈酚54、β-谷甾醇30、木犀草素27、柚皮素17，可能是麻黃-白果藥對對哮喘和慢阻肺發(fā)揮“異病同治”作用的關(guān)鍵化合物。

注：紅色代表藥對，黃色代表麻黃的活性成分，綠色代表白果的活性成分，紫色代表麻黃和白果共有的活性成分，藍(lán)色代表靶點(diǎn)，粉色代表疾病

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 網(wǎng)絡(luò)中包括108個節(jié)點(diǎn)，2269條邊，平均度值為42，節(jié)點(diǎn)的大小表示靶點(diǎn)的度值，顏色由淺到深表示靶點(diǎn)的度值由小到大(圖2)。度值排名前5位的靶點(diǎn)為白介素6(IL-6)92、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)86、白介素1β(IL-1β)86、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)84、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)83，可能是麻黃-白果藥對發(fā)揮“異病同治”作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 共同作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 KEGG通路富集分析結(jié)果 KEGG通路富集分析得到161條通路(P<0.05)，將排名前20的通路繪制成柱狀圖(圖3)。得到麻黃-白果藥對發(fā)揮作用的主要信號通路為TNF信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路和Toll樣受體信號通路。

圖3 KEGG通路富集分析

2.6 分子對接結(jié)果 研究表明，結(jié)合能小于0表示化合物與受體具有結(jié)合活性，結(jié)合能<-5表示結(jié)合活性較強(qiáng)[6]。分子對接的結(jié)合能均<-5，提示麻黃-白果藥對的活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的結(jié)合性(圖4)。分別選擇與5個關(guān)鍵靶點(diǎn)具有最低結(jié)合能的化合物繪制對接模式圖(圖5)。

圖4 分子對接結(jié)合能熱圖

圖5 關(guān)鍵靶點(diǎn)分別與其結(jié)合能最低成分的對接模式圖

3 討 論

中醫(yī)藥在治療哮喘和慢阻肺方面具有整體調(diào)節(jié)與安全有效的獨(dú)特優(yōu)勢，以辨證論治為指導(dǎo)原則，對癥治療?！爱惒⊥巍笔加凇饵S帝內(nèi)經(jīng)》，確立于《傷寒雜病論》，作為中醫(yī)藥診療疾病的重要指導(dǎo)原則沿用至今，是中醫(yī)學(xué)辨證論治的精髓體現(xiàn)，指的是針對不同的疾病，若病機(jī)相同，發(fā)病過程中出現(xiàn)相同證候，可采用同一治法，即“證同治亦同”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，哮喘的發(fā)生為宿痰內(nèi)伏于肺，復(fù)加外感、體虛、病后等因素，以使痰阻氣道、肺氣上逆。病理因素以痰為主，“伏痰”遇感引觸，痰隨氣升，相互搏結(jié)，壅塞氣道，肺管狹窄，通暢不利，肺失宣降，而致痰鳴如吼，氣息喘促，咳嗽，咳痰等癥。慢阻肺的發(fā)生多由久病肺虛，痰濁潴留所致，每因復(fù)感外邪誘使病情發(fā)作或加劇。肺臟虛損，主氣功能失常，不能斂降，氣還肺間，脹滿而喘。肺虛不能宣降，津液不布，聚而化痰，痰濁內(nèi)生，阻礙氣機(jī)，引發(fā)并加重咳喘。由此可見，兩種疾病的病機(jī)根本皆在于肺虛失于宣降，痰濁內(nèi)蘊(yùn)，故臨床治療均應(yīng)以宣降肺氣，祛痰平喘為基本原則。麻黃輕清上浮，以宣肺為長，宣肺散邪而平喘；白果性澀而收，以斂肺為長，斂肺定喘而祛痰；二藥配對，一散一收，使肺氣宣肅有度，即宣而無耗散肺氣之弊，斂而不致有肺氣壅塞之虞，共奏宣降肺氣，祛痰平喘之功，這在理論上解釋了麻黃-白果藥對臨床上用于哮喘、慢阻肺異病同治的原因。

本研究結(jié)果顯示麻黃-白果藥對治療哮喘和慢阻肺的共有靶點(diǎn)108個，其中按照Degree值排名前五位依次為IL-6、AKT1、IL-1β、VEGF、MAPK3，主要與炎癥反應(yīng)、氣道重塑、氧化應(yīng)激、免疫失衡有關(guān)。IL-6、IL-1β是氣道炎癥的重要細(xì)胞因子，能夠刺激嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等釋放多種炎性介質(zhì)，誘發(fā)哮喘和慢阻肺的炎癥反應(yīng)，且與疾病的嚴(yán)重程度呈正比[7-8]。AKT1可以通過調(diào)控中性粒細(xì)胞凋亡、氧化-抗氧化失衡、Th細(xì)胞的分化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生調(diào)節(jié)氣道炎癥反應(yīng)[9]。AKT1能夠通過調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化來參與氣道重塑[10]。VEGF能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)氣道血管擴(kuò)張和通透性增強(qiáng)，促使支氣管周圍纖維化，加重氣道重塑[11]。MAPK3可以通過介導(dǎo)炎癥、免疫應(yīng)答、氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞反應(yīng)等途徑參與哮喘和慢阻肺的發(fā)生和發(fā)展[12-13]。

通過對共同作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，麻黃-白果藥對可能主要通過調(diào)控TNF信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路和Toll樣受體信號通路對哮喘和慢阻肺發(fā)揮“異病同治”的作用，因此通過文獻(xiàn)檢索對以上通路進(jìn)行著重分析。TNF信號通路與氣道黏液高分泌密切相關(guān)，可以增強(qiáng)表皮生長因子受體(EGFR)磷酸化，進(jìn)而激活其下游的P13K/AKT通路，促進(jìn)杯狀細(xì)胞增生和氣道黏液分泌，參與哮喘和慢阻肺的發(fā)生[14]。IL-17信號通路可以通過調(diào)控氣道炎癥和氣道重塑影響哮喘和慢阻肺的發(fā)生[15-16]。HIF-1信號通路可以通過促進(jìn)IL-6、IL-1β和TNF-α等炎性因子釋放介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和上調(diào)VEGF的表達(dá)參與血管生成來影響慢阻肺進(jìn)程[17]。哮喘患者體內(nèi)存在缺氧微環(huán)境，缺氧狀態(tài)下HIF-1信號通路呈激活狀態(tài)，可參與哮喘的免疫應(yīng)答[18]。Toll樣受體信號通路能夠通過調(diào)控Th1/Th2失衡影響哮喘的發(fā)生[19]。Toll樣受體信號通路活化髓樣分化蛋白分子88(MyD88)，激活下游的NF-κB信號通路，介導(dǎo)慢阻肺的炎癥過程[20]。以上的研究結(jié)果與本文的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果較為一致，進(jìn)一步印證了麻黃-白果“異病同治”哮喘和慢阻肺的作用機(jī)制。

本文將中醫(yī)“異病同治”傳統(tǒng)理念與現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究技術(shù)相融合，探究麻黃-白果藥對治療哮喘和慢阻肺的作用機(jī)制，主要與氣道炎癥、氣道重塑、免疫應(yīng)答、氧化應(yīng)激等相關(guān)，這與目前研究哮喘和慢阻肺的機(jī)制具有一致性，從一定程度上表明了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的可靠性與準(zhǔn)確性，為探索中醫(yī)藥治療不同疾病所發(fā)揮協(xié)同作用的藥效機(jī)制提供了新的研究思路。