李竹英,陳 璐,王麗潔
(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院呼吸科,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學研究生院,黑龍江 哈爾濱 150040)
哮喘是一種由多種炎性細胞及其組分參與,以可逆性氣流受限為主的氣道異質性疾病。慢阻肺以持續(xù)氣流受限為特征,并呈進行性進展的可防治的慢性炎癥性疾病。麻黃-白果藥對配伍出自《攝生眾妙方》定喘湯經(jīng)典方中君藥藥對,主治素體肺虛,痰濁內蘊之證。麻黃辛溫,既解表散寒,又宣肺平喘?,F(xiàn)代藥理研究表明,麻黃具有抗炎、平喘、鎮(zhèn)咳、緩解支氣管平滑肌痙攣、抗過敏等作用[1-2]。白果甘苦澀平,為斂肺化痰定喘要藥?,F(xiàn)代藥理研究表明,白果具有平喘、祛痰、松弛氣管平滑肌、免疫抑制、抗過敏、抗菌等作用[3-4]。二藥配對,既使肺氣有開有合,增強平喘之效,又可宣肺而不耗氣,斂肺而不留邪,共奏宣降肺氣、祛痰平喘之功,是臨床上治療哮喘和慢阻肺的常用藥對?,F(xiàn)階段對麻黃-白果藥對治療哮喘和慢阻肺的共同機理研究相對欠缺,因此本文基于網(wǎng)絡藥理學的方法,以中醫(yī)“異病同治”的角度為切入點,探討麻黃-白果藥對治療哮喘和慢阻肺的作用機制,為其深入研究及臨床應用提供參考依據(jù)。
1.1 麻黃-白果藥對活性成分及靶點獲取 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP),以口服生物利用度(OB)≥30%,類藥性(DL)≥0.18的標準篩選出麻黃-白果藥對的活性成分及其潛在作用靶點[5],然后利用Uniprot蛋白質數(shù)據(jù)庫校正潛在作用靶點的基因名。
1.2 哮喘和慢阻肺相關靶點的獲取 分別以Asthma和COPD為檢索詞從Genecards數(shù)據(jù)庫中檢索哮喘和慢阻肺的相關靶點,取相關性分數(shù)大于2倍中位數(shù)的靶點基因與藥對預測靶點通過Venny進行比對得到共同靶點。
1.3 藥對-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡構建 將藥對活性成分及獲取的共有靶點導入Cytoscape中構建藥對-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡。
1.4 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡的構建 將共同靶點導入String數(shù)據(jù)庫,篩選出combined score>0.9的PPI數(shù)據(jù)并導入Cytoscape中構建網(wǎng)絡圖。
1.5 KEGG通路富集分析 基于R語言軟件,利用Bioconductor生物信息軟件包對共同靶點進行KEGG通路富集分析及可視化處理。
1.6 分子對接驗證 將構建網(wǎng)絡中度值排名前5的化合物和PPI網(wǎng)絡中度值排名前5的關鍵靶點進行分子對接,評估化合物和靶點蛋白之間的結合潛力,驗證網(wǎng)絡分析的可靠性。首先在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲取化合物結構,通過PDB數(shù)據(jù)庫獲得種屬來源為人類且分辨率較高的靶點蛋白受體結構,然后利用Autodock Vina軟件進行分子對接和結合能打分。最后利用Discovery Studio將對接結果可視化。
2.1 麻黃-白果藥對活性成分及靶點篩選結果 篩選出符合標準的麻黃活性成分19個,白果活性成分11個,其中共有的活性成分5個。將所獲得的活性成分對應的靶點蛋白名導入Uniprot數(shù)據(jù)庫進行基因標準化,刪除重復項,共得到麻黃-白果藥對活性成分的預測靶點288個。
2.2 共同靶點的獲取結果 通過篩選獲取到哮喘相關靶點1475個,慢阻肺相關靶點2059個,與288個預測靶點進行映射取交集得到共同靶點108個。
2.3 藥對-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡構建結果 網(wǎng)絡中共有137個節(jié)點和654條邊(圖1)。度值排名前5位的化合物依次為槲皮素134、山奈酚54、β-谷甾醇30、木犀草素27、柚皮素17,可能是麻黃-白果藥對對哮喘和慢阻肺發(fā)揮“異病同治”作用的關鍵化合物。
注:紅色代表藥對,黃色代表麻黃的活性成分,綠色代表白果的活性成分,紫色代表麻黃和白果共有的活性成分,藍色代表靶點,粉色代表疾病
2.4 PPI網(wǎng)絡構建結果 網(wǎng)絡中包括108個節(jié)點,2269條邊,平均度值為42,節(jié)點的大小表示靶點的度值,顏色由淺到深表示靶點的度值由小到大(圖2)。度值排名前5位的靶點為白介素6(IL-6)92、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)86、白介素1β(IL-1β)86、血管內皮生長因子(VEGF)84、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)83,可能是麻黃-白果藥對發(fā)揮“異病同治”作用的關鍵靶點。
圖2 共同作用靶點PPI網(wǎng)絡圖
2.5 KEGG通路富集分析結果 KEGG通路富集分析得到161條通路(P<0.05),將排名前20的通路繪制成柱狀圖(圖3)。得到麻黃-白果藥對發(fā)揮作用的主要信號通路為TNF信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路和Toll樣受體信號通路。
圖3 KEGG通路富集分析
2.6 分子對接結果 研究表明,結合能小于0表示化合物與受體具有結合活性,結合能<-5表示結合活性較強[6]。分子對接的結合能均<-5,提示麻黃-白果藥對的活性成分與關鍵靶點具有較強的結合性(圖4)。分別選擇與5個關鍵靶點具有最低結合能的化合物繪制對接模式圖(圖5)。
圖4 分子對接結合能熱圖
圖5 關鍵靶點分別與其結合能最低成分的對接模式圖
中醫(yī)藥在治療哮喘和慢阻肺方面具有整體調節(jié)與安全有效的獨特優(yōu)勢,以辨證論治為指導原則,對癥治療?!爱惒⊥巍笔加凇饵S帝內經(jīng)》,確立于《傷寒雜病論》,作為中醫(yī)藥診療疾病的重要指導原則沿用至今,是中醫(yī)學辨證論治的精髓體現(xiàn),指的是針對不同的疾病,若病機相同,發(fā)病過程中出現(xiàn)相同證候,可采用同一治法,即“證同治亦同”。中醫(yī)學認為,哮喘的發(fā)生為宿痰內伏于肺,復加外感、體虛、病后等因素,以使痰阻氣道、肺氣上逆。病理因素以痰為主,“伏痰”遇感引觸,痰隨氣升,相互搏結,壅塞氣道,肺管狹窄,通暢不利,肺失宣降,而致痰鳴如吼,氣息喘促,咳嗽,咳痰等癥。慢阻肺的發(fā)生多由久病肺虛,痰濁潴留所致,每因復感外邪誘使病情發(fā)作或加劇。肺臟虛損,主氣功能失常,不能斂降,氣還肺間,脹滿而喘。肺虛不能宣降,津液不布,聚而化痰,痰濁內生,阻礙氣機,引發(fā)并加重咳喘。由此可見,兩種疾病的病機根本皆在于肺虛失于宣降,痰濁內蘊,故臨床治療均應以宣降肺氣,祛痰平喘為基本原則。麻黃輕清上浮,以宣肺為長,宣肺散邪而平喘;白果性澀而收,以斂肺為長,斂肺定喘而祛痰;二藥配對,一散一收,使肺氣宣肅有度,即宣而無耗散肺氣之弊,斂而不致有肺氣壅塞之虞,共奏宣降肺氣,祛痰平喘之功,這在理論上解釋了麻黃-白果藥對臨床上用于哮喘、慢阻肺異病同治的原因。
本研究結果顯示麻黃-白果藥對治療哮喘和慢阻肺的共有靶點108個,其中按照Degree值排名前五位依次為IL-6、AKT1、IL-1β、VEGF、MAPK3,主要與炎癥反應、氣道重塑、氧化應激、免疫失衡有關。IL-6、IL-1β是氣道炎癥的重要細胞因子,能夠刺激嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等釋放多種炎性介質,誘發(fā)哮喘和慢阻肺的炎癥反應,且與疾病的嚴重程度呈正比[7-8]。AKT1可以通過調控中性粒細胞凋亡、氧化-抗氧化失衡、Th細胞的分化和細胞因子的產(chǎn)生調節(jié)氣道炎癥反應[9]。AKT1能夠通過調節(jié)上皮細胞間充質轉化來參與氣道重塑[10]。VEGF能夠刺激血管內皮細胞增殖,促進氣道血管擴張和通透性增強,促使支氣管周圍纖維化,加重氣道重塑[11]。MAPK3可以通過介導炎癥、免疫應答、氣道結構細胞反應等途徑參與哮喘和慢阻肺的發(fā)生和發(fā)展[12-13]。
通過對共同作用靶點進行KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),麻黃-白果藥對可能主要通過調控TNF信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路和Toll樣受體信號通路對哮喘和慢阻肺發(fā)揮“異病同治”的作用,因此通過文獻檢索對以上通路進行著重分析。TNF信號通路與氣道黏液高分泌密切相關,可以增強表皮生長因子受體(EGFR)磷酸化,進而激活其下游的P13K/AKT通路,促進杯狀細胞增生和氣道黏液分泌,參與哮喘和慢阻肺的發(fā)生[14]。IL-17信號通路可以通過調控氣道炎癥和氣道重塑影響哮喘和慢阻肺的發(fā)生[15-16]。HIF-1信號通路可以通過促進IL-6、IL-1β和TNF-α等炎性因子釋放介導炎癥反應和上調VEGF的表達參與血管生成來影響慢阻肺進程[17]。哮喘患者體內存在缺氧微環(huán)境,缺氧狀態(tài)下HIF-1信號通路呈激活狀態(tài),可參與哮喘的免疫應答[18]。Toll樣受體信號通路能夠通過調控Th1/Th2失衡影響哮喘的發(fā)生[19]。Toll樣受體信號通路活化髓樣分化蛋白分子88(MyD88),激活下游的NF-κB信號通路,介導慢阻肺的炎癥過程[20]。以上的研究結果與本文的網(wǎng)絡藥理學預測結果較為一致,進一步印證了麻黃-白果“異病同治”哮喘和慢阻肺的作用機制。
本文將中醫(yī)“異病同治”傳統(tǒng)理念與現(xiàn)代網(wǎng)絡藥理學研究技術相融合,探究麻黃-白果藥對治療哮喘和慢阻肺的作用機制,主要與氣道炎癥、氣道重塑、免疫應答、氧化應激等相關,這與目前研究哮喘和慢阻肺的機制具有一致性,從一定程度上表明了網(wǎng)絡藥理學研究的可靠性與準確性,為探索中醫(yī)藥治療不同疾病所發(fā)揮協(xié)同作用的藥效機制提供了新的研究思路。