李昕悅，梁社往，李冬雪，郭 婷，趙會玉，郭春平，何忠俊

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 資源與環(huán)境學院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學與生物技術(shù)學院，云南 昆明 650201； 3.曲靖市土壤肥料工作站，云南 曲靖 655000；4.玉溪市農(nóng)田建設(shè)與土壤肥料工作站，云南 玉溪 653100)

穩(wěn)定氫氧同位素技術(shù)具有示蹤、整合和指示等多項功能，在大氣科學、地球化學、植物水循環(huán)[1]等方面發(fā)揮著巨大優(yōu)勢。在自然界中，生物體內(nèi)的H、O等同位素組成受生物代謝類型、環(huán)境、氣候等因素的影響而發(fā)生自然分餾效應，從而使不同來源的物質(zhì)中同位素自然豐度存在差異[2]。這些差異不易受加工條件以及人為因素改變，利用生物體中同位素差異，能夠區(qū)分其產(chǎn)地[3-4]。近年來，穩(wěn)定同位素分析技術(shù)已在食品產(chǎn)地溯源中成功運用，在牛肉[5]、羊肉[6]、葡萄酒[7]、茶葉[8]、青稞[9]等的產(chǎn)地和真?zhèn)舞b別起到了較大作用。對人指甲、頭發(fā)[10]中穩(wěn)定氫氧同位素的研究表明，不同城市常住居民頭發(fā)、指甲與其飲用水中δD、δ18O比率具有顯著相關(guān)性。王慧文等[11]分析了雞肉、飼料、和水中的δD，發(fā)現(xiàn)雞肉δD與飲水中的δD呈高度正相關(guān)。

三七(Panaxnotoginseng)為五加科人參屬植物[12]。以塊根、蘆頭用藥，味甘、微苦、性溫。主治出血癥，跌打損傷，瘀血腫痛。對于腦血管病、心血管病、血栓、血瘀有較好的功效。還具有消腫定痛，改善心肺血液循環(huán)、以及提高人體免疫力、改善淋巴循環(huán)的功能。蘆頭在三七地下部分中所占比例小，皂苷含量高，主要用于制藥企業(yè)提取皂苷組分的原料[14-15]。三七在云藥產(chǎn)業(yè)中占有及其重要的地位，2015年我國三七種植面積達70萬畝，產(chǎn)量超過3.5萬噸，種植業(yè)產(chǎn)值突破120億元，全國以三七為主的系列產(chǎn)品產(chǎn)值超過500億元?！拔纳饺摺钡谝慌ㄟ^GAP(國家食品藥品監(jiān)督管理局組織制定和實施的行業(yè)管理法規(guī))基地認證，第一個獲得國家地理標志成品保護中藥材[16]，2016年《文山三七道地藥材》行業(yè)標準發(fā)布實施。2016年云南省批準三七莖葉作為地方特色食品[16]，筋條和須根主要用于藥膳[14]。因此，三七各部位產(chǎn)地鑒別均具有重要意義。

三七主產(chǎn)于云南文山州各縣，近年來，隨著三七連作障礙加重、道地產(chǎn)區(qū)租地成本增加和三七需求量的增長，推動了三七價格上漲，三七種植區(qū)域已由文山州向周邊州市大面積擴展，另外，云南周邊的廣西白色、貴州興義、四川西昌等地也有種植。市場上充斥著真假難辨的三七。產(chǎn)地是道地藥材形成的一個重要原因[14]，由于道地藥材盲目引種導致的質(zhì)量下降，生產(chǎn)及銷售等環(huán)節(jié)可能存在偽劣藥材，增加了中藥材安全事故發(fā)生的風險。目前中藥材產(chǎn)地的判別方法主要依靠形態(tài)、理化鑒別及指紋圖譜、二維碼等技術(shù)，其精確度較低，說服力不足[17]。何忠俊等[17-18]發(fā)現(xiàn)三七塊根δ18O主要受1月平均溫、7月最高溫、1月最低溫、緯度、濕度、年均溫、年降水量的影響；塊根δ13C受產(chǎn)地的1月最低溫、7月平均溫、年均溫、經(jīng)度的綜合影響。但關(guān)于三七各部位穩(wěn)定氫氧同位素特征、相關(guān)性及其與灌溉水的關(guān)系研究甚少。因此，本研究對三七各部位穩(wěn)定氫氧同位素特征及其影響因素進行研究，擬為三七產(chǎn)地溯源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 三七主產(chǎn)區(qū)采樣調(diào)查

采集三七產(chǎn)區(qū)三年生春三七整株及灌溉水樣品?？刂品N源一致(即文山種源)，分別采自廣西靖西片區(qū)4點，云南文山片區(qū)15點、云南新拓展片區(qū)24點(紅河、昆明、曲靖、玉溪、騰沖)。三個片區(qū)采樣點數(shù)根據(jù)種植面積確定，廣西靖西片區(qū)由于三七種植面積小，故采樣點小于其余兩個片區(qū)；云南新拓展片區(qū)覆蓋5個州市，種植面積大于文山片區(qū)，故采樣點最多。采樣地基本情況列于表1。

表1 采樣地基本情況Table 1 Basic situation of sampling site

利用隨機多點取樣法進行采集，每個樣點按地塊東、南、西、北、中隨機采集三七植株15株。現(xiàn)場測定經(jīng)緯度、海拔等地理信息。將活體樣本帶回實驗室，用滴加少許洗潔精的自來水洗去泥土，然后用2%的檸檬酸蒸餾水洗去附著的礦質(zhì)元素，最后用蒸餾水反復沖洗干凈。涼去附著的水分，將莖葉、蘆頭、塊根、筋條、須根分開，稱鮮重。105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干至恒重，稱干重、粉碎過100目篩，備用。

采集樣點附近灌溉水約500 mL密封，于4 ℃條件保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 穩(wěn)定氫、氧同位素測定

三七各部位及灌溉水穩(wěn)定氫、氧同位素在中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所穩(wěn)定同位素實驗室進行。

1.2.1三七(各部位)穩(wěn)定氫、氧同位素測定 稱取一定量樣品(0.5 mg)放入元素分析儀 (PYRO-cube,德國Elementar 公司)樣品盤中，經(jīng)燃燒爐高溫裂解后，樣品中的氫元素和氧元素轉(zhuǎn)化為純凈的H2和CO氣體后，進入氣體同位素質(zhì)譜儀(Isoprime 100，德國Elementar公司)進行檢測。元素分析主要條件：裂解管主要填料為碳玻璃，燃燒爐溫度為1 450 ℃，高純氦氣(He，99.999%)作為載氣。同位素質(zhì)譜主要條件：氦氣流量為125 mL·min-1，CO阱電流200 μA，H2阱電流400 μA。采用稀釋器對CO氣體進行稀釋，實現(xiàn)兩種氣體的同時測定。以USGS54、USGS55和USGS56作為標準樣對樣品進行校正。

穩(wěn)定氫同位素比率用δD表示，即δ2H，相對標準為V-SMOW(標準平均海洋水)。計算公式為:

δD‰= (R樣品/R標準-1) ×1 000

(1)

式中：R=2H/1H[18]。其中R樣品為被測樣品的同位素比值，R標準為標準品的同位素比值，下同。

1.2.2灌溉水穩(wěn)定氫、氧同位素測定 用注射器吸取水樣2 mL，經(jīng)直徑13 mm、孔徑0.45 μL的尼龍66針筒式過濾器過濾后加入微量瓶中，進入元素分析儀，經(jīng)1 450 ℃高溫裂解成H2，進入同位素質(zhì)譜儀進行檢測，控制氦氣流量為125 mL·min-1。分析過程中每12個樣品穿插一個國際標樣IAEACH-7(δDV-SMOW=(-100.3±2)‰)。

穩(wěn)定氧同位素比率用δ18O表示，δ18O的標準物質(zhì)為SMOW (標準平均海洋水)。計算公式為:

δ18O‰=(R樣品/R標準-1)×1 000

(2)

式中：R=18O/16O[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excle 2010軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 19.0進行Duncan’s法多重比較分析、相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地三七各部位δD、δ18O差異

三個片區(qū)三七各部位δD差異列于表2。經(jīng)Duncan’s法多重比較，三個產(chǎn)區(qū)中三七莖葉、筋條、須根δD無顯著差異；蘆頭和塊根中δD以廣西靖西片區(qū)顯著高于云南文山片區(qū)和云南新拓展片區(qū)，而云南文山片區(qū)和云南新拓展片區(qū)差異不顯著。各部位δD值具有顯著性差異，總體趨勢為蘆頭、塊根、筋條顯著高于莖葉和須根。

表2 不同產(chǎn)地間三七各部位δD組成差異分析Table 2 Analysis of the difference in the δD composition of each organ of Panax notoginseng among different producing areas

三個片區(qū)三七各部位δ18O差異列于表3。三七莖葉、蘆頭、塊筋條、須根中δ18O均無顯著差異；而塊根δ18O則以云南新拓展片區(qū)顯著高于廣西靖西片區(qū)，云南文山片區(qū)與廣西靖西片區(qū)、云南新拓展片區(qū)無顯著差異。三個片區(qū)各部位δ18O值中，廣西靖西片區(qū)以塊根顯著高于蘆頭和須根，與莖葉、筋條差異不顯著；云南文山片區(qū)以塊根顯著高于蘆頭、莖葉和須根，而與筋條差異不顯著，莖葉、蘆頭顯著高于須根；云南新拓展片區(qū)中莖葉、蘆頭、塊根、筋條之間無顯著差異，但顯著高于須根。各部位間δ18O值大小順序為塊根>筋條>莖葉>蘆頭>須根。

表3 不同產(chǎn)地間三七各部位δ18O組成差異分析Table 3 Difference analysis of δ18O composition of various organs of Panax notoginseng among different producing areas

2.2 三七各部位中穩(wěn)定氫氧同位素間及其與地理信息的相關(guān)性

三七各部位中穩(wěn)定氫同位素間的相關(guān)性分析列于表4。由表4可知，莖葉δD與蘆頭、須根δD呈顯著正相關(guān)；蘆頭δD與塊根、筋條、須根δD呈極顯著的正相關(guān)，與莖葉δD呈顯著正相關(guān)；須根δD與莖葉、筋條δD呈顯著相關(guān)，與蘆頭δD呈極顯著的正相關(guān)。總體上，僅蘆頭δD與其余各部位δD均達到極顯著和顯著的正相關(guān)。莖葉δD與經(jīng)度呈極顯著的負相關(guān)、與緯度呈極顯著的正相關(guān)；蘆頭δD與海拔呈極顯著的負相關(guān)，筋條δD與經(jīng)度呈顯著的正相關(guān)。須根、筋條由于樣本不足，僅有21組數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析，所以筋條與經(jīng)度的相關(guān)系數(shù)絕對值大于莖葉與經(jīng)度的相關(guān)系數(shù)卻未達到極顯著相關(guān)。

表4 三七各部位中穩(wěn)定氫同位素間的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of stable hydrogen isotope in various organs of Panax notoginseng

三七各部位中穩(wěn)定氧同位素間的相關(guān)性分析列于表5。由表5結(jié)果可知，除塊根δ18O與筋條、須根δ18O相關(guān)性不顯著外，三七各部位間δ18O均呈極顯著正相關(guān)。三七各部位δ18O與經(jīng)度呈極顯著的負相關(guān)，與緯度呈極顯著的正相關(guān)，與海拔呈顯著正相關(guān)。

表5 三七各部位中穩(wěn)定氧同位素間的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of stable oxygen isotope in various organs of Panax notoginseng

2.3 灌溉水氫氧同位素與經(jīng)緯度、海拔及三七各部位δD、δ18O關(guān)系

不同三七產(chǎn)區(qū)灌溉水穩(wěn)定同位素組成差異列于表6。經(jīng)Duncan’s法多重比較，灌溉水δD、δ18O變化規(guī)律基本相同，以廣西靖西片區(qū)灌溉水中δD、δ18O顯著高于云南文山片區(qū)和云南新拓展片區(qū)，云南文山片區(qū)與云南新拓展片區(qū)差異不顯著。灌溉水中δD、δ18O之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.958，P<0.01)。

表6 不同產(chǎn)地間灌溉水同位素組成差異分析Table 6 Analysis of the difference in isotope composition of irrigation water between different producing areas

對灌溉水δD、δ18O與經(jīng)緯度、海拔相關(guān)性研究，結(jié)果列于表7。表7結(jié)果表明，灌溉水δD、δ18O與經(jīng)度呈顯著的正相關(guān)，與緯度呈顯著的負相關(guān)，與海拔呈極顯著的負相關(guān)。對灌溉水與各部位氫氧同位素進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，僅蘆頭中δD與灌溉水中δD呈顯著正相關(guān)關(guān)系。而其余部位δD、δ18O與灌溉水中δD、δ18O均無顯著相關(guān)。

表7 灌溉水中δD、δ18O與經(jīng)緯度、 海拔及三七各部位δD、δ18O相關(guān)性分析Table 7 Correlation analysis of δD and δ18O in irrigation water with latitude and longitude altitude and δD and δ18O of various organs of Panax notoginseng

3 討論

三七分布區(qū)地理、氣候、土壤、地質(zhì)背景差異明顯。根據(jù)本課題組前期研究，目前三七分布區(qū)地理范圍經(jīng)度在98.501°～106.470°，緯度在22.942°～25.677°之間，海拔在490～2 319 m，年均溫12.9～19.9 ℃、年降水932～1 664 mm、≥10 ℃積溫3 125.3～6 688 ℃(根據(jù)經(jīng)緯度和海拔由TCMGIS-1計算得出)，跨越南亞熱帶、中亞熱帶、北亞熱帶、南溫帶、中溫帶五個熱量帶，濕潤和半濕潤2個水分區(qū)[17-19]。三七種植區(qū)具有地域范圍相對較小，但海拔、氣候類型、地質(zhì)背景、土壤類型差異大的特征。

三個三七產(chǎn)區(qū)中莖葉、筋條、須根δD、δ18O無顯著差異；蘆頭和塊根中δD以廣西靖西片區(qū)顯著高于云南文山片區(qū)和云南新拓展片區(qū)，而云南文山片區(qū)和云南新拓展片區(qū)差異不顯著。符合隨海拔、緯度增加而降低的規(guī)律[20]。而δ18O的變化規(guī)律則與δD相反，有隨緯度、海拔增加而增加的趨勢。以云南新拓展片區(qū)顯著高于廣西靖西片區(qū)，云南文山片區(qū)與廣西靖西片區(qū)、云南新拓展片區(qū)無顯著差異。各部位δD、δ18O值具有顯著差異，δD總體趨勢為蘆頭、塊根、筋條顯著高于莖葉和須根，δ18O值大小順序為：塊根>筋條>莖葉>蘆頭>須根。由于纖維素合成過程中氧同位素高度富集，使三七主根δ18O由地表水δ18O的負值變?yōu)檎礫17]，致使其與δD規(guī)律相反，掩蓋了地表水δ18O的地域性規(guī)律。本課題組前期研究表明，三七塊根內(nèi)氧同位素主要受產(chǎn)地溫度狀況、緯度、濕度、年降水的影響，具有顯著的地域特征[17]。

部位間δD、δ18O相關(guān)性研究表明，塊根δD、δ18O與筋條、須根δD、δ18O相關(guān)性均不顯著。蘆頭δD與其余各部位δD均達極顯著和顯著正相關(guān)。莖葉δD與經(jīng)度呈極顯著的負相關(guān)、與緯度呈極顯著的正相關(guān)，蘆頭δD與海拔呈極顯著的負相關(guān)，筋條δD與經(jīng)度呈顯著正相關(guān)。三七各部位間δ18O均呈極顯著正相關(guān)。三七各部位δ18O與經(jīng)度呈極顯著的負相關(guān)，與緯度呈極顯著的正相關(guān)，與海拔呈顯著正相關(guān)?？傮w上看，除塊根與筋條、須根外，三七各部位間δ18O及其與經(jīng)緯度的相關(guān)性均呈極顯著相關(guān)，與海拔呈顯著相關(guān)。說明三七各部位δ18O地域特征明顯，可以相互預測，均可作為產(chǎn)地溯源指標。而三七各部位δD能否作為溯源指標值得做進一步的探討。

三七產(chǎn)區(qū)地表水具有明顯的經(jīng)度、緯度和高程效應[21]。地表水δD、δ18O與經(jīng)度呈顯著的正相關(guān)，與緯度呈顯著的負相關(guān)，與海拔呈極顯著的負相關(guān)。灌溉水中δD、δ18O之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。但僅蘆頭中δD與灌溉水中δD呈顯著正相關(guān)關(guān)系。而其余部位δD、δ18O與灌溉水中δD、δ18O均無顯著相關(guān)。孫淑敏等[6]通過對羊肉樣品和當?shù)匮蝻嬎笑腄進行分析，發(fā)現(xiàn)羊肉中δD與飲用水δD呈極顯著正相關(guān)；郭波莉等[22]發(fā)現(xiàn)不同牧區(qū)牦牛肉中δD與飲水密切相關(guān)，且均有隨海拔升高而降低的趨勢。由于三七不同部位化學成分、生理生化特征等的不同，加之三七次生代謝產(chǎn)物占有很高的比例，與動物和以初生代謝產(chǎn)物為主的植物對灌溉水δD、δ18O分餾、富集規(guī)律可能有所不同，導致不同部位δD、δ18O與灌溉水δD、δ18O關(guān)系發(fā)生改變。

4 結(jié)論

利用元素分析儀-同位素比率質(zhì)譜儀測定了不同產(chǎn)區(qū)春三七各部位及灌溉水氫氧同位素比率，并結(jié)合Duncan’s多重比較和相關(guān)分析研究了三七各部位氫氧同位素特征及其與經(jīng)緯度、海拔和灌溉水氫氧同位素的關(guān)系。結(jié)果表明，三七各部位δD符合隨海拔、緯度增加而降低的規(guī)律，而δ18O的變化規(guī)律則與δD相反。三七各部位δD、δ18O值具有顯著差異，變化規(guī)律各異。三七各部位δ18O地域特征明顯，除塊根與筋條、須根之間外，其余部位間可以相互預測，均可作為產(chǎn)地溯源指標。三七產(chǎn)區(qū)灌溉水中δD、δ18O之間呈極顯著正相關(guān)，具有明顯的經(jīng)度、緯度和高程效應，但僅蘆頭δD與灌溉水δD呈顯著正相關(guān)。