黃政海，任 超，朱世坤，王雪竹，吳美其，霍 力

(1.原子高科股份有限公司，北京 102413； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科 核醫(yī)學(xué)分子靶向診療北京市重點實驗室，北京 100730)

(E)-4-(2-(6-(2-(2-(2-18F-氟乙氧基)乙氧基)乙氧基)吡啶-3-基)乙烯基)-N-甲基苯胺((E)-4-(2-(6-(2-(2-(2-18F-fluoroethoxy)ethoxy)ethoxy)pyridine-3-yl)vinyl)-N-methyl benzenamine，18F-AV45)是一種由放射性核素氟-18標記的苯乙烯基吡啶衍生物，是美國食品與藥品管理局于2012年批準的第一個用于阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease, AD)診斷的β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein, Aβ)顯像劑。18F-AV45對Aβ斑塊具有良好的親和力，能夠?qū)崿F(xiàn)特異性結(jié)合，在臨床AD患者診斷中發(fā)揮著重要作用[1-3]。

目前，雖然國內(nèi)關(guān)于18F-AV45的臨床研究報道較多，但對18F-AV45的合成研究報道較少，且涉及的化學(xué)合成模塊以國產(chǎn)氟多功能合成模塊為主[4-5]，尚未有文獻報道使用TRACERlab FX2 N合成器開展18F-AV45制備工作，而目前TRACERlab FX2 N合成器市場占有率超過50%，臨床應(yīng)用廣泛，為探索出適用于該合成器合成18F-AV45的合成方法，本文在參考相關(guān)文獻基礎(chǔ)上[6-7]，以AV105為前體，在進口氟多功能合成模塊TRACERlab FX2 N合成器上快捷簡單自動化合成18F-AV45，經(jīng)藥物質(zhì)量控制和倫理審批后，并進行初步臨床驗證。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器

RDS111型回旋加速器：美國CTI公司；TRACERlab FX2 N合成器：美國GE公司，配S1122泵(德國Sykam公司)，DETECTOR 10D紫外檢測器及放射性檢測器；1260 Infinity Ⅱ液相色譜儀：美國Agilent公司，配1260紫外檢測器，F(xiàn)low-RAM放射性HPLC流量檢測器；PoleStar m660型PET/CT掃描儀：賽諾聯(lián)合醫(yī)療科技(北京)有限公司。

1.2 主要試劑

H218O(豐度≥97%)：美國劍橋同位素實驗室公司；氨基聚醚(kryptofix，K2.2.2)：德國ABX公司產(chǎn)品；無水二甲基亞砜(DMSO)：美國Sigma公司；乙腈(色譜級)：美國Fisher公司；乙醇(藥用級)：湖南湘易康制藥有限公司；18F-AV45前體AV105及對照品19F-AV45：江蘇華益科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。Sep-Pak Plus Light QMA、Sep-Pak C18柱：美國Waters公司；InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色譜柱(4 μm，4.6 mm×100 mm)：美國Agilent公司；VP 250/10 NUCLEOSIL 100-5 C18半制備色譜柱：德國MN公司；Millex-GV 0.22 μm除菌過濾器：美國Millipore公司。

1.3 實驗動物

ICR小鼠，12只，雌雄各6只，體重18～22 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。動物實驗經(jīng)過北京協(xié)和醫(yī)院倫理審查委員會批準，倫理批準號：JS-2628。

2 實驗方法

2.1 18F-AV45合成

在TRACERlab FX2 N合成器上進行18F-AV45合成，合成路線示于圖1。首先以AV105為前體，與18F-發(fā)生親核反應(yīng)形成18F-AV45-Boc后，再依次經(jīng)酸水解及堿中和，經(jīng)HPLC分離后經(jīng)固相萃取獲得可供注射的18F-AV45。

圖1 18F-AV45合成路線圖Fig.1 Synthesis of 18F-AV45

2.2 TRACERlab FX2 N合成器合成步驟

TRACERlab FX2 N合成器由管路系統(tǒng)、負壓泵系統(tǒng)、氣液傳輸系統(tǒng)、加熱及冷卻系統(tǒng)、HPLC系統(tǒng)(含流動相，進樣環(huán)，HPLC泵，C18制備柱，紫外探測器及放射性檢測器)及計算機控制系統(tǒng)等組成，圖2為TRACERlab FX2 N合成器示意圖，圖中A點與B點短接。

圖2 TRACERlab FX2 N合成器示意圖Fig.2 Schematic of the TRACERlab FX2 N radiosynthesis module

TRACERlab FX2 N合成器的具體合成步驟如下。(1)18F-制備。加速器經(jīng)18O(p，n)18F反應(yīng)得到18F-，并經(jīng)靶水線傳送到靶水瓶，由氦氣載帶至QMA柱并被捕獲；然后1號試劑瓶中K2CO3/K2.2.2乙腈水溶液1.5 mL(1 mL含15 mg K2.2.2乙腈溶液+0.5 mL含3 mg K2CO3水溶液)淋洗QMA柱，洗脫18F-至反應(yīng)管。反應(yīng)管通入氦氣并60 ℃加熱3分45秒后再90 ℃加熱1分45秒將液體除干，得到無水18F-。(2) 親核反應(yīng)。2號試劑瓶中前體溶液(4 mg AV105溶于1 mL DMSO)在氦氣載帶下進入反應(yīng)管，130 ℃加熱反應(yīng)10 min完成標記。(3) 水解反應(yīng)。將4號試劑瓶中0.8 mL 3.33 mol/L HCl溶液加入反應(yīng)管，130 ℃反應(yīng)5 min，進行水解。(4) 酸堿中和反應(yīng)。水解后將5號試劑瓶中1.35 mL 2 mol/L NaOH溶液及6.65 mL 4%醋酸銨溶液分別加入反應(yīng)管，中和混勻。(5) 固相柱純化。將反應(yīng)管中液體通過C18 1柱(Sep-Pak C18柱)至廢液，用6號試劑瓶中10 mL注射用水沖洗C18 1柱，然后用3號試劑瓶中1.5 mL乙腈將C18 1柱上粗產(chǎn)品洗入TUBE管。(6) 半制備柱分離。粗產(chǎn)品進行HPLC分離，流動相為乙腈-20 mmol/L醋酸銨溶液，體積比45∶55，流速為6 mL/min，紫外檢測波長350 nm，收集產(chǎn)品至裝有30 mL注射用水的稀釋瓶，稀釋混勻。(7) 溶劑轉(zhuǎn)換。將稀釋瓶液體經(jīng)C18 2柱(Sep-Pak C18柱)轉(zhuǎn)移至廢液瓶，然后用10 mL注射用水(9號試劑瓶)清洗C18 2柱，再用1 mL乙醇(10號試劑瓶)將產(chǎn)品從C18 2柱上洗脫至產(chǎn)品瓶，并用9 mL生理鹽水(12號試劑瓶)稀釋，最后通過無菌濾膜得到終產(chǎn)品。

2.3 18F-AV45的質(zhì)量控制

(1) 外觀。通過鉛玻璃觀察產(chǎn)品的顏色和澄明度。

(2) pH。用精密pH試紙測定18F-AV45產(chǎn)品的pH。

(3) 產(chǎn)品鑒別。取18F-AV45產(chǎn)品適量，照半衰期測定法(《中國藥典》2020年版第四部通則1401)測定核素半衰期。利用分析型HPLC測定18F-AV45產(chǎn)品的放化純度，同時用標準品19F-AV45(50 μg/mL)進行比對分析，流動相為乙腈-20 mmol/L醋酸銨溶液，體積比40∶60水溶液，流速為1 mL/min，紫外波長350 nm。

(4) 無菌和內(nèi)毒素。參照2020版《中國藥典》對產(chǎn)品注射液進行無菌和細菌內(nèi)毒素檢查。

(5) 異常毒性檢查。取ICR小鼠12只，其中6只為實驗組，6只為對照組，實驗組小鼠尾靜脈注射18F-AV45產(chǎn)品5.55×107Bq，對照組小鼠注射相同體積生理鹽水，5 s內(nèi)勻速注射完畢，正常飼養(yǎng)，觀察48 h內(nèi)是否正常。

(6) 殘留溶劑檢查。使用碘鉑酸鉀方法測定K2.2.2，使用氣相色譜儀檢測18F-AV45產(chǎn)品的乙腈及DMSO含量。

2.4 18F-AV45體外穩(wěn)定性

將370 MBq/mL18F-AV45產(chǎn)品溶液平均分成兩份，第一份不添加任何試劑，第二份中加入0.5%抗壞血酸鈉。用分析型HPLC分別測定原液和加入抗壞血酸鈉產(chǎn)品于0、2、4及6 h的放化純度，比較有無抗壞血酸鈉對18F-AV45穩(wěn)定性的影響。

2.5 臨床PET/CT顯像

經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意(倫理審查批件編號：JS-2423)，健康對照者：女性1例，56歲；臨床擬診為AD患者：女性1例，50歲，分別簽署知情同意書。

AD患者及健康對照者分別行簡易智力狀態(tài)檢查量表(mini-mental state examination,MMSE)評分，靜脈注射18F-AV45 3.7×108Bq，注射藥物80 min后行頭部1床位PET/CT顯像，采集時間10 min。AD患者及健康對照者分別行低劑量CT掃描(120 kV，100 mAs，螺距1.3，層厚2.5 mm)用于衰減校正。圖像處理在MIM工作站用有序子集最大期望迭代(ordered subset expectation maximization, OSEM)算法(迭代次數(shù)2，子集10，矩陣192×192)及飛行時間(time of flight, TOF)技術(shù)進行圖像重建，行CT、PET圖像顯示與PET/CT融合。

3 實驗結(jié)果

3.1 18F-AV45的自動化合成

本研究利用18F-AV45的標記前體AV105在TRACERlab FX2 N合成器上自動化合成18F-AV45，在半制備HPLC上收集19 min左右的放射峰(圖3)，該方法合成時間從加速器轟擊結(jié)束開始到最終18F-AV45產(chǎn)品共耗時約80 min，不校正合成效率為(17.02±1.52)%(n=6)，比活度為2.22 TBq/mmol，合成穩(wěn)定性和可靠性高。

圖3 18F-AV45半制備HPLC放射性圖譜Fig.3 Radioactive chromatogram of semi-prep HPLC

3.2 18F-AV45的質(zhì)量控制

得到的18F-AV45產(chǎn)品呈無色澄清，pH為6～7，核素半衰期為110 min，用分析型HPLC檢測放化純度，圖4分別為18F-AV45產(chǎn)品及標準品19F-AV45在分析型HPLC中放射性檢測圖譜和紫外圖譜，保留時間分別為11.51 min及11.28 min，18F-AV45產(chǎn)品與其標準品的相對保留時間基本一致，因此，合成產(chǎn)物為目標18F-AV45化合物，且其放化純度大于95%。18F-AV45產(chǎn)品內(nèi)毒素含量低于15 Eu/mL且14 d細菌培養(yǎng)結(jié)果顯示無菌生長。此外，實驗組和對照組ICR小鼠注射后48 h全部存活，未見異常毒性反應(yīng)。K2.2.2含量小于50 μg/mL，乙腈含量小于0.041%，DMSO含量小于0.5%，因此，18F-AV45產(chǎn)品的無菌檢測、細菌內(nèi)毒素檢測、異常毒性檢測、溶劑殘留乙腈及DMSO含量均符合《中國藥典》(2020年版)要求。

圖4 18F-AV45產(chǎn)品的放射性檢測圖譜(a)及標準品19F-AV45的紫外圖譜(b)Fig.4 Radioactive chromatogram of formulated 18F-AV45 (a) and the UV chromatogram of 19F-AV45 (b)

3.3 18F-AV45體外穩(wěn)定性

18F-AV45體外穩(wěn)定性研究表明，當終產(chǎn)品加入0.5%抗壞血酸鈉并放置6 h后，其放化純度仍然大于95%，而不含抗壞血酸鈉的終產(chǎn)品放置0、2、4及6 h后，其放化純度逐漸下降，分別為96.42%、90.06%、81.15%及71.07%，所以，18F-AV45放射性藥物易發(fā)生輻射分解，可在終產(chǎn)品中加入0.5%抗壞血酸鈉用于防止產(chǎn)品輻射分解。

3.4 臨床應(yīng)用

AD患者50歲，女性，無明顯誘因推理能力、記憶力下降8個月，MMSE評分29分，18F-AV45 PET/CT顯像表明：大腦皮層攝取彌漫增高，提示大腦皮層β淀粉樣蛋白沉積(圖5a)。健康對照者，56歲，女性，18F-AV45 PET/CT顯像表明：大腦皮層未見明顯攝取，即大腦皮層未見β淀粉樣蛋白沉積(圖5b)。

a1、b1—PET顯像圖；a2、b2—CT顯像圖；a3、b3—PET/CT融合顯像圖 圖5 AD患者(a)和健康對照者(b)18F-AV45腦顯像圖Fig.5 18F-AV45 brain imaging was performed in an AD patient (a) and a healthy person (b)

4 討論

目前，國內(nèi)合成18F-AV45所用的化學(xué)合成模塊以國產(chǎn)PET-MF-2V-IT-I氟多功能合成模塊為主，還未有國內(nèi)外文獻報道過采用進口氟多功能合成模塊TRACERlab FX2 N合成器開展18F-AV45的制備工作，而本研究建立了一種適用于進口氟多功能合成模塊TRACERlab FX2 N合成器合成Aβ顯像劑18F-AV45的方法，可為其他研究者采用TRACERlab FX2 N合成器合成18F-AV45提供參考和依據(jù)。該方法以AV105為前體，進行18F-標記，制備出的18F-AV45產(chǎn)品無色澄清、pH為6～7及放化純度大于95%，其無菌檢測、細菌內(nèi)毒素檢測、異常毒性檢測、溶劑殘留乙腈及DMSO含量均符合2020版《中華人民共和國藥典》標準，能夠滿足臨床科研要求，對推動國內(nèi)18F-AV45在臨床上的應(yīng)用具有較大的意義。

采用TRACERlab FX2 N合成器合成18F-AV45，在加熱系統(tǒng)方面，與國產(chǎn)氟多功能用的風加熱系統(tǒng)相比，該合成器采用銅加熱套直接加熱，加熱效率高，溫控更準更穩(wěn)定。TRACERlab FX2 N合成器的整個合成過程在真空狀態(tài)下采用液氮冷阱迅速捕獲合成器內(nèi)廢氣，體積小且可防止有機溶劑及放射性氣體蒸出，同時反應(yīng)中除水效率更高。國產(chǎn)氟多功能合成模塊采用氣囊收集放射性廢氣，因此對氣囊氣密性要求高，否則放射性廢氣容易蒸出到環(huán)境中，造成環(huán)境輻射劑量升高，且與液氮冷阱相比，氣囊在收集廢氣時體積變大，在合成熱室內(nèi)占據(jù)更大的空間。但與國產(chǎn)氟多功能合成模塊相比，TRACERlab FX2 N合成器成本更高，價格昂貴。

然而，本研究18F-AV45不校正合成效率為(17.02±1.52)%(n=6)，而多數(shù)文獻報道的不校正合成效率在20%以上[6,8-9]，為了獲得更高的合成效率，將在后續(xù)研究中對反應(yīng)前體量、前體溶劑、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間等合成條件進行優(yōu)化，摸索出適用于TRACERlab FX2 N合成器合成18F-AV45的最佳合成方法。

5 結(jié)論

本研究采用TRACERlab FX2 N合成器合成Aβ顯像劑18F-AV45，整個合成過程快速、簡單、穩(wěn)定及自動化程度高，制備出的18F-AV45質(zhì)量和產(chǎn)量均滿足臨床科研要求，對推動國內(nèi)18F-AV45在臨床上的應(yīng)用具有較大的意義，為AD患者的診斷與科學(xué)研究提供了一定基礎(chǔ)。