陳慶鑫，褚泰偉

(北京大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，放射化學(xué)與輻射化學(xué)重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，北京 100871)

葡萄糖是糖在血液中的運(yùn)輸形式并能在體內(nèi)氧化供能，在機(jī)體糖代謝中占據(jù)主要地位。惡性腫瘤細(xì)胞的異常增殖需要大量葡萄糖[1]，葡萄糖代謝旺盛的部位極有可能是潛在的腫瘤病灶。因此，葡萄糖代謝顯像的臨床意義重大。

氟代脫氧葡萄糖(18F-FDG)是目前研究最多的正電子葡萄糖代謝顯像劑[2-4]，然而正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(PET)及加速器售價(jià)昂貴。故此，研究和發(fā)展新型的非加速器核素制備的葡萄糖代謝顯像劑仍是一項(xiàng)十分重要的工作。

由于放射性核素99Tcm具有良好的物理性能(t1/2=6 h，Eγ=140 keV)，而且價(jià)格低廉、來(lái)源廣泛，所以99Tcm是單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像技術(shù)(SPECT)診斷中常見(jiàn)的放射性核素。

然而，以往報(bào)道的99Tcm標(biāo)記葡萄糖代謝顯像劑都是先將葡萄糖和有機(jī)配體偶聯(lián)，再與放射性核素99Tcm配位，形成一個(gè)體積龐大的分子探針。這種體積龐大的放射性核素及有機(jī)配體對(duì)葡萄糖基團(tuán)有很大影響，偶聯(lián)物體積龐大也是造成其生物評(píng)價(jià)效果不佳的主要原因[5-8]。 比如，Yang等[6]將一個(gè)N2S2配體與葡萄糖分子偶聯(lián)(即ECDG)，該化合物可以與99Tcm形成穩(wěn)定配合物；99Tcm-ECDG的動(dòng)物體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該化合物具有良好的瘤肉比，但血中放射性活度一直是腫瘤的兩倍，不利于顯像。分析可能的原因是該化合物可以被葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體識(shí)別，但無(wú)法被細(xì)胞內(nèi)的己糖激酶磷酸化，所以很快被排出細(xì)胞外。

環(huán)辛炔與疊氮的[3+2]環(huán)加成點(diǎn)擊反應(yīng)[9]，具有在生物體系內(nèi)反應(yīng)速度快、無(wú)副反應(yīng)發(fā)生等優(yōu)點(diǎn)，有可能解決上述99Tcm標(biāo)記的葡萄糖代謝顯像劑存在的缺點(diǎn)[10-13]。

本工作旨在將點(diǎn)擊化學(xué)應(yīng)用到“預(yù)著靶-再快速、高效尋靶”的放射性葡萄糖代謝顯像中，合成只含有小體積的疊氮基團(tuán)的葡萄糖衍生物，首先完成葡萄糖基團(tuán)在體內(nèi)的預(yù)著靶，然后注射放射性核素標(biāo)記的環(huán)辛炔探針進(jìn)行再尋靶，通過(guò)高效體內(nèi)點(diǎn)擊反應(yīng)實(shí)現(xiàn)葡萄糖代謝顯像。

1 試劑與儀器

二苯并環(huán)辛炔、丁二酸單甲酰氯、三溴吡啶嗡、叔丁醇鉀、N-羥基琥珀酰亞胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、乙二醇雙2-氨基乙基醚、2-氨基乙硫醇、三苯甲醇、溴乙酰溴、溴乙酸乙酯、D-葡萄糖胺鹽酸鹽、4-溴丁酸乙酯：百靈威科技有限公司；鹽酸羥胺、正辛醇：北京化工廠；苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽：吉爾生化(上海)有限公司；疊氮化鈉：浙江東陽(yáng)市凱明特種試劑有限公司；溴乙酸、3-溴丙酸、草酰氯：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；99Mo-99Tcm核素發(fā)生器：原子高科股份有限公司提供。

Bruker AVANCEⅢ(550 MHz)核磁共振儀、Bruker APEX Ⅳ FTMS 質(zhì)譜儀：瑞士Bruker公司；Wizard Ⅱ 2470 series 自動(dòng)伽馬計(jì)數(shù)器：美國(guó)Perkin Elmer公司；Waters 1525 Binary HPLC Pump高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性昆明小鼠:清潔級(jí)普通動(dòng)物，體重(20±2) g，由中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物所提供。向其左側(cè)腋部皮下移植約106個(gè)S180細(xì)胞，小鼠肉瘤S180細(xì)胞株由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。飼養(yǎng)在開(kāi)放衛(wèi)生環(huán)境里7～8 d后，腫瘤直徑約10～15 mm時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食16 h以上。

3 實(shí)驗(yàn)部分

3.1 標(biāo)記前體的合成

ADIBO-MAMA和N3-DG-1～4的結(jié)構(gòu)示意圖示于圖1。

圖1 ADIBO-MAMA和N3-DG-1～4的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure of ADIBO-MAMA and N3-DG-1～4

(1) Gordon等[14]研究發(fā)現(xiàn)，具有雙苯并的環(huán)辛炔化合物反應(yīng)更為靈敏、反應(yīng)速度更快。故參考文獻(xiàn)[15-16]類(lèi)似方法合成了含有二苯并環(huán)辛炔功能團(tuán)的MAMA配體(ADIBO-MAMA)。

(2) 參照文獻(xiàn)[17-21]合成了2位含有疊氮基且碳鏈長(zhǎng)度不等的一系列葡萄糖衍生物(N3-DG-1～4)。

3.2 體外點(diǎn)擊速率常數(shù)的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[22]報(bào)道的方法，測(cè)定四種2-疊氮葡萄糖化合物和ADIBO-MAMA在生理溫度下的體外點(diǎn)擊反應(yīng)速率常數(shù)。分別配制化合物ADIBO-MAMA(10-3mol/L)、 N3-DG-1～4(2.0×10-2mol/L)的甲醇溶液。各取50 μL，加入400 μL甲醇后于37 ℃反應(yīng)；取不同時(shí)間點(diǎn)的混合液由HPLC測(cè)定化合物ADIBO-MAMA的紫外吸收峰(254 nm)面積A。根據(jù)In(C0/C)=In(A0/A)=K1t，線性擬合求出一級(jí)動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)K1；再結(jié)合K1=K2×C0(N3-DG)，進(jìn)而求出二級(jí)動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)K2。其中，C0為ADIBO-MAMA溶液初始濃度，C為ADIBO-MAMA溶液時(shí)刻t的濃度；A0為ADIBO-MAMA初始峰面積，A為ADIBO-MAMA時(shí)刻t的峰面積。

3.3 99Tcm-ADIBO-MAMA的制備及性質(zhì)測(cè)定

99Tcm-ADIBO-MAMA參照相關(guān)文獻(xiàn)[23]報(bào)道的方法制備。利用三氟乙酸(TFA)和三乙基硅烷對(duì)ADIBO-MAMA配體化合物中巰基基團(tuán)上的三苯甲基進(jìn)行脫除，然后脫保護(hù)后的配體(“N2S2”配體)與中間配合物—99Tcm標(biāo)記的葡庚糖酸鈉(99Tcm-GH)通過(guò)配體交換反應(yīng)制得99Tcm-ADIBO-MAMA。

(1) 中間配合物99Tcm-GH的制備

取GH水溶液(0.1 mL，0.1 g/mL)，加入SnCl2·2H2O的鹽酸(0.1 mol/L)水溶液(10 μL，2 g/L)，振蕩混勻后利用氫氧化鈉水溶液(0.1 mol/L)調(diào)節(jié)pH至中性(14.5 μL)；加入Na99TcmO4(活度約3.7×107Bq)，渦旋混合2 min，室溫放置反應(yīng)10 min，得到中間配合物99Tcm-GH，利用radio-HPLC測(cè)定其放化純度。

(2)99Tcm-ADIBO-MAMA的制備

取1.0 mg ADIBO-MAMA溶于0.1 mL苯甲醚和0.4 mL無(wú)水甲醇， 冰水浴下加入100 μL TFA，反應(yīng)2 min后加入50 μL三乙基硅烷，攪拌反應(yīng)10 min；旋干，加入0.5 mL無(wú)水乙醇溶解稀釋?zhuān)淙肷倭繗鍤獗Ｗo(hù)巰基；加入99Tcm-GH，振蕩混勻，100 ℃下反應(yīng)5 min，制得99Tcm-ADIBO-MAMA的乙醇溶液儲(chǔ)備液；冷卻至室溫，利用radio-HPLC測(cè)定其放化純度。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將99Tcm-ADIBO-MAMA的乙醇溶液儲(chǔ)備液，利用生理鹽水稀釋至20%乙醇溶液。

(3) 標(biāo)記物的理化性質(zhì)測(cè)定

標(biāo)記物穩(wěn)定性測(cè)定。常溫下，標(biāo)記物在空氣中放置8 h；于不同時(shí)間取樣利用radio-HPLC測(cè)定樣品，分析標(biāo)記物放化純度的變化，評(píng)價(jià)其自身穩(wěn)定性。

脂水分配系數(shù)的測(cè)定。取0.1 mL標(biāo)記物儲(chǔ)備液，加入到裝有0.9 mL PBS(0.1 mol/L，pH 7.4)和1.0 mL正辛醇的離心管中，在室溫下渦旋混合5 min，在2 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min；從水相和有機(jī)相中分別取0.1 mL樣品溶液，利用 Wizard Ⅱ 2470 series自動(dòng)伽馬計(jì)數(shù)器測(cè)定其放射性計(jì)數(shù)NW(水相中的計(jì)數(shù))和NO(有機(jī)相中的計(jì)數(shù))，根據(jù)脂水分配系數(shù)計(jì)算公式LogP(O/W)=Log(NO/NW)，計(jì)算得出標(biāo)記物的脂水分配系數(shù)。平行三次，取平均值。

3.4 小鼠體內(nèi)分布

取健康雄性昆明小鼠，以99Tcm-ADIBO-MAMA作為空白對(duì)照。預(yù)著靶策略：N3-DG-1或N3-DG-2(0.02 mol/L，0.1 mL)在小鼠腫瘤組織著靶2 h后，尾靜脈注射99Tcm-ADIBO-MAMA(比活度約0.5 MBq/mL，0.1 mL)，通過(guò)體內(nèi)點(diǎn)擊反應(yīng)進(jìn)行尋靶。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程為：荷瘤小鼠尾靜脈注射標(biāo)記物后1、2、4、8 h，進(jìn)行眼眶取血，斷頸處死，解剖，取腦、肌肉、腫瘤、心、骨、胃、腸、腎、脾、肺和肝，清除內(nèi)容物，清水洗滌，拭干，稱(chēng)重，自動(dòng)伽馬計(jì)數(shù)器分別測(cè)其放射性活度，計(jì)算每克組織器官占注射劑量的百分比(%ID/g)以及腫瘤與血液(T/B)、腫瘤與肌肉(T/M)的放射性攝取比值。每組五只小鼠，最終結(jié)果表示為(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。使用SPSS 26.0(Statistical Product and Service Solutions 26.0)分析數(shù)據(jù)之間差異的顯著性。

4 結(jié)果與討論

4.1 化合物鑒定

實(shí)驗(yàn)中合成的化合物均通過(guò)1H NMR、13C NMR檢測(cè)，結(jié)果顯示均為目標(biāo)產(chǎn)物。

ADIBO-MAMA1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ 7.42-7.33(m,15H),7.26(s,4H),7.22(s,4H),7.21-7.14(m,8H),7.13-7.05(m,5H),3.80(s,2H),3.53-3.43(m,9H),3.36(dt,J=15.5,5.0 Hz,4H),3.07-2.93(m,6H),2.57-2.22(m,10H)。13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ 144.68,144.59,130.26,129.57,129.54,128.87,128.71,128.54,128.00,127.96,127.63,127.50,126.86,126.77,97.64,70.26,70.15,69.88,69.56,67.09,66.84,60.37,55.94,53.00,39.24,38.94,38.19,31.97,31.36,30.78。

N3-DG-11H NMR(500 MHz,CDCl3)δ 5.56(d,J=8.6 Hz,1H),5.14-5.00(m,2H),4.30(dt,J=12.6,4.3 Hz,1H),4.14-4.05(m,1H),3.81(ddd,J=9.7,4.5,2.2 Hz,1H),3.70-3.60(m,1H),2.19(s,3H),2.09(d,J=3.7 Hz,3H),2.08(s,3H),2.03(s,3H)。13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ 170.50,169.75,169.60,168.53,92.61,72.80,72.76,67.88,62.64,61.45,20.86,20.67,20.62,20.54。

N3-DG-21H NMR(500 MHz,CDCl3)δ 6.45(d,J=9.3 Hz,1H),5.80(d,J=8.7 Hz,1H),5.26(dd,J=10.4,9.4 Hz,1H),5.14(t,J=9.6 Hz,1H),4.32-4.25(m,1H),4.22(dd,J=10.3,9.2 Hz,1H),4.18-4.10(m,1H),3.91(s,2H),3.88-3.81(m,1H),2.12(s,3H),2.09(s,3H),2.05(d,J=1.0 Hz,6H)。13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ 170.90,170.59,169.28,169.25,167.02,92.25,72.96,72.20,67.78,61.65,53.28,52.63,20.84,20.68,20.56,20.55。

N3-DG-31H NMR(500 MHz,CDCl3)δ 6.21(d,J=3.6 Hz,1H),5.75(d,J=8.9 Hz,1H),5.24(dt,J=23.9,9.6 Hz,2H),4.50(td,J=10.4,3.6 Hz,1H),4.30-4.22(m,1H),4.07(dd,J=12.4,2.2 Hz,1H),3.66-3.50(m,3H),2.38-2.31(m,2H),2.20(s,3H),2.09(s,3H),2.06(s,3H),2.05(s,3H)。13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ 171.79,170.64,169.90,169.06,168.55,90.51,77.27,77.01,76.76,70.59,69.80,67.48,61.55,51.26,47.13,35.70,20.85,20.79,20.65,20.53。

N3-DG-41H NMR(500 MHz,CDCl3)δ 5.93(dd,J=33.1,10.3 Hz,1H),5.73(d,J=8.8 Hz,1H),5.23(dd,J=10.5,9.5 Hz,1H),5.13(t,J=9.7 Hz,1H),4.38-4.22(m,2H),4.14(dd,J=12.5,2.2 Hz,1H),3.86(ddd,J=9.9,4.7,2.3 Hz,1H),3.32(t,J=6.5 Hz,2H),2.30-2.16(m,2H),2.11(d,J=3.7 Hz,3H),2.09(s,3H),2.05(d,J=1.0 Hz,6H),1.94-1.77(m,2H)。13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ 171.89,171.23,170.69,169.46,169.35,92.52,72.86,72.57,67.98,61.76,52.98,50.51,33.06,24.55,20.87,20.73,20.67,20.58。

4.2 體外點(diǎn)擊速率的測(cè)定

化合物ADIBO-MAMA與化合物N3-DG-1～4體外點(diǎn)擊反應(yīng)的各級(jí)動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)列于表1。

表1 ADIBO-MAMA與N3-DG-1～4體外點(diǎn)擊 反應(yīng)的各級(jí)動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)Table 1 Kinetic study of the click reaction between ADIBO-MAMA and N3-DG-1～4

由表1可知，疊氮基團(tuán)與糖環(huán)相隔一定距離(N3-DG-2～4)與其直接連在糖環(huán)上(N3-DG-1)相比，點(diǎn)擊速率大幅提升，可能的原因是糖環(huán)的位阻效應(yīng)阻礙了三唑的形成。然而，一旦疊氮基團(tuán)伸出糖環(huán)，隨著其與糖環(huán)距離的進(jìn)一步延長(zhǎng)，反應(yīng)速率并未有顯著改變。

從表1結(jié)果可見(jiàn)，N3-DG-2更有希望成為合適的葡萄糖探針?lè)肿印Ｗ罱K挑選N3-DG-1作為對(duì)照組和N3-DG-2進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

4.3 標(biāo)記物的制備及性質(zhì)測(cè)定

通過(guò)對(duì)標(biāo)記體系中pH、SnCl2用量、反應(yīng)溫度、中間絡(luò)合劑等條件進(jìn)行優(yōu)化后，所得99Tcm-ADIBO-MAMA的標(biāo)記率大于95%，如圖2所示。常溫下，標(biāo)記物在空氣中放置8 h后放化純度大于95%，具有較好的體外穩(wěn)定性。99Tcm-ADIBO-MAMA標(biāo)記物L(fēng)ogP(O/W)=0.98±0.01，顯示為脂溶性。

4.4 體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)

99Tcm-ADIBO-MAMA(空白對(duì)照)及其與N3-DG-1，N3-DG-2體內(nèi)點(diǎn)擊產(chǎn)物在荷S180腫瘤小鼠體內(nèi)的生物分布結(jié)果列于表2～表4。

圖的Radio-HPLC分析圖Fig.2 Radio-HPLC (a), 99Tcm-GH (b), 99mTc-ADIBO-MAMA (c)

表2 99Tcm-ADIBO-MAMA在荷瘤小鼠體內(nèi)的放射性攝取率(n=5)Table 2 Biodistribution results of 99Tcm-ADIBO-MAMA in tumor-bearing mice (n=5)

續(xù)表2

表3 99Tcm-ADIBO-MAMA與N3-DG-1體內(nèi)點(diǎn)擊后在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布結(jié)果(n=5)Table 3 Biodistribution results of 99Tcm-ADIBO-MAMA’s click reaction product with N3-DG-1 in tumor-bearing mice (n=5)

表4 99Tcm-ADIBO-MAMA與N3-DG-2體內(nèi)點(diǎn)擊后在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布結(jié)果(n=5)Table 4 Biodistribution results of 99Tcm-ADIBO-MAMA’s click reaction product with N3-DG-2 in tumor-bearing mice (n=5)

從表2～表4可以看出，99Tcm-ADIBO-MAMA、99Tcm-ADIBO-MAMA與N3-DG-1，N3-DG-2體內(nèi)點(diǎn)擊產(chǎn)物的肝攝取較高；這與化合物呈脂溶性相關(guān)。心、肺、胃和肌肉在開(kāi)始有少量攝取，但很快清除。腦中則幾乎無(wú)攝取。

另外，從腫瘤/血液比值數(shù)據(jù)(表5)可以看出，在時(shí)間點(diǎn)為1 h，99Tcm-ADIBO-MAMA與N3-DG-1，N3-DG-2體內(nèi)點(diǎn)擊產(chǎn)物的瘤血比均比99Tcm-ADIBO-MAMA有較大提高，存在顯著性差異；在時(shí)間點(diǎn)為2 h，99Tcm-ADIBO-MAMA與N3-DG-2體內(nèi)點(diǎn)擊產(chǎn)物的瘤血比與99Tcm-ADIBO-MAMA的類(lèi)似，沒(méi)有顯著性差異；在4 h和8 h，99Tcm-ADIBO-MAMA與N3-DG-2體內(nèi)點(diǎn)擊產(chǎn)物的瘤血比大于99Tcm-ADIBO-MAMA與N3-DG-1體內(nèi)點(diǎn)擊產(chǎn)物，有顯著性差異。相比于N3-DG-1(對(duì)照組)，99Tcm-ADIBO-MAMA與N3-DG-2體內(nèi)點(diǎn)擊更易發(fā)生，具有更好的腫瘤攝取和滯留。該結(jié)果與體外點(diǎn)擊反應(yīng)速率快慢(表1)一致。

表5 99Tcm-ADIBO-MAMA (a)及其與N3-DG-1 (b)， N3-DG-2 (c) 體內(nèi)點(diǎn)擊產(chǎn)物在荷S180腫瘤小鼠體內(nèi)的瘤血比(n=5) Table 5 Comparison of tumor/blood ratios among 99Tcm-ADIBO-MAMA (a), its click reaction product with N3-DG-1 (b)，N3-DG-2 (c) in tumor-bearing mice (n=5)

從腫瘤/肌肉比值數(shù)據(jù)(表6)來(lái)看，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，99Tcm-ADIBO-MAMA與N3-DG-2體內(nèi)點(diǎn)擊產(chǎn)物的瘤肉比均比99Tcm-ADIBO-MAMA有較大的提高，存在顯著性差異；同樣，相比于N3-DG-1(對(duì)照組)，99Tcm-ADIBO-MAMA與N3-DG-2體內(nèi)點(diǎn)擊產(chǎn)物的瘤肉比提高的幅度更為明顯，存在顯著性差異，在時(shí)間點(diǎn)8 h時(shí)，瘤肉比高達(dá)10.27±3.30。該結(jié)果與體外點(diǎn)擊反應(yīng)速率快慢(表1)也一致。因此，N3-DG-2比N3-DG-1的體內(nèi)分布效果好，更具有作為葡萄糖代謝顯像劑的潛力。

表6 99Tcm-ADIBO-MAMA (a)及其與N3-DG-1 (b)， N3-DG-2 (c) 體內(nèi)點(diǎn)擊產(chǎn)物在荷S180腫瘤小鼠體內(nèi)的瘤肉比(n=5)Table 6 Comparison of tumor/muscle ratios among 99Tcm-ADIBO-MAMA (a), its click reaction product with N3-DG-1 (b)，N3-DG-2 (c) in tumor-bearing mice (n=5)

5 結(jié)論

合成了MAMA偶聯(lián)的二苯并環(huán)辛炔配體和四種2-位含有疊氮基的小分子葡萄糖基團(tuán)，體外反應(yīng)速率測(cè)定實(shí)驗(yàn)選定了兩種葡萄糖衍生物N3-DG-1(速率最慢，作為對(duì)照組)和N3-DG-2(速率最快)；接下來(lái)采用配體交換的方法完成了ADIBO-MAMA的99Tcm標(biāo)記，標(biāo)記條件優(yōu)化后，標(biāo)記率在95%以上。基于體內(nèi)點(diǎn)擊化學(xué)，首先完成N3-DG-1和N3-DG-2在體內(nèi)的預(yù)著靶，再注射99Tcm-ADIBO-MAMA進(jìn)行尋靶，發(fā)生體內(nèi)點(diǎn)擊反應(yīng)，以99Tcm-ADIBO-MAMA為空白對(duì)照，根據(jù)動(dòng)物分布結(jié)果篩選出最合適的葡萄糖代謝顯像劑。從動(dòng)物分布實(shí)驗(yàn)來(lái)看，N3-DG-1和N3-DG-2相比，后者的瘤血比和瘤肉比也要優(yōu)于前者，但N3-DG-2預(yù)著靶策略對(duì)瘤肉比的改善較為明顯，對(duì)瘤血比的改善效果不佳，所以，還有待尋找其他的小分子葡萄糖基團(tuán)以及對(duì)二苯并環(huán)辛炔改性(提高其水溶性)來(lái)進(jìn)一步提高瘤血比。