焦 寒 徐 陽(yáng) 范冰凌 林欣欣 付杰軍

胎盤發(fā)育和功能障礙可導(dǎo)致子癇前期、胎兒生長(zhǎng)受限、復(fù)發(fā)流產(chǎn)等妊娠相關(guān)疾病[1,2]。3M綜合征(OMIM#273750)是一種罕見(jiàn)的以嚴(yán)重宮內(nèi)發(fā)育遲緩和出生后生長(zhǎng)遲緩為主要特征的一種常染色體隱性遺傳病[3]。目前已報(bào)道的3M綜合征的突變基因是定位在常染色體p21.1上的Cul7基因，含有26個(gè)外顯子，編碼1698個(gè)氨基酸[4]。泛素連接酶Cul7基因敲除小鼠的主要表型是胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩，胎盤發(fā)育和結(jié)構(gòu)異常[5]。已報(bào)道3M綜合征患者Cul7基因存在40多個(gè)不同位點(diǎn)的錯(cuò)義突變或無(wú)義突變[6]。近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)3M綜合征患者有常染色體2q35～36.1上的OBSL1(ob-scurin-like 1)基因突變和19q13.2～q13.32上的CCDC8(coiled-coil domain-containing protein 8)基因突變[7,8]。而Cul7是主要致病基因，已報(bào)道3M綜合征中67%有Cul7基因突變，28%是OBSL1基因突變，5%是CCDC8突變。3M突變基因可以形成3M復(fù)合體(FBXW8-Cul7-OBSL1-CCDC8)調(diào)控基因組穩(wěn)定性[6]。然而，Cul7對(duì)小鼠和人胎盤發(fā)育的調(diào)控機(jī)制還不清楚。

Notch信號(hào)通路與胚胎發(fā)育和成人器官組織穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，尤其對(duì)于上皮干細(xì)胞和細(xì)胞分化起重要作用[9]。Notch受體是單一跨膜蛋白，由功能性胞外(NECD)、跨膜(TM)和胞內(nèi)(NICD)結(jié)構(gòu)域組成，NICD為Notch受體的活化形式[10]。哺乳動(dòng)物有4種Notch受體(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)。在妊娠早期，Notch1主要表達(dá)在增殖活躍的近端滋養(yǎng)層柱細(xì)胞，并在絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞(EVT)形成過(guò)程中表達(dá)迅速降低，在妊娠12周的胎盤絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞滋養(yǎng)層柱幾乎檢測(cè)不到Notch1的表達(dá)[11]。Notch1抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和遷移，在滋養(yǎng)層細(xì)胞自發(fā)融合過(guò)程中維持E-cadherin的表達(dá)，抑制人絨毛膜促性腺激素β(hCGβ)表達(dá)及滋養(yǎng)層細(xì)胞融合[9]。筆者前期報(bào)道了Cul7在細(xì)胞滋養(yǎng)層柱高表達(dá)，過(guò)表達(dá)Cul7能引起絨毛癌細(xì)胞JEG3上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)類似的變化[5]。本研究通過(guò)探索Cul7對(duì)Notch1蛋白穩(wěn)定性的影響，揭示Cul7在胎盤發(fā)育中的可能調(diào)控作用。

材料與方法

1.細(xì)胞株：小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)由美國(guó)哈佛醫(yī)學(xué)院貝斯以色列女執(zhí)事醫(yī)療中心病理系魏文毅教授惠贈(zèng)。人絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR8/SVneo由中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所干細(xì)胞與生殖生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王紅梅研究員惠贈(zèng)。

2.主要試劑：胎牛血清購(gòu)自維森特生物技術(shù)(南京)有限公司，RPMI1640高糖培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、opti-MEM減血清培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青霉素鏈霉素混合液100×購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；慢病毒干擾載體PGLV3/H1/GFP+Puro穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G，慢病毒包裝系統(tǒng)干擾Cul7表達(dá)及空載病毒液購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；BCA試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，RIPA buffer購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE3000、TRIzol Reagent、PierceTMPhosphatase Inhibitor Mini Tablets和PierceTMProtase Inhibitor Mini Tablets、EDTA-free購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix試劑盒、anti-HA Magnetic Beads購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

3.抗體：兔抗人Notch1(3439)、兔抗人Notch3(5276)、鼠抗人Myc(2276)、兔抗人Jagged1(2620)、兔抗人IRS-1(3407)、兔抗人survivin(5875)、兔抗人β-catenin(8480)、兔抗人HES1(11988)、兔抗人cyclinD3(2936)、兔抗人P21(2947)、兔抗人Notch4(2423)、兔抗人β-tubulin(2128)、鼠抗人β-actin(3700)、鼠抗人HA(2367)和羊抗鼠IgG(7076)、羊抗兔IgG(7074)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；兔抗人Cul7(C1743)、兔抗人Flag(SAB4301135)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；鼠抗人TRIM24(ab70560)購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

4.細(xì)胞培養(yǎng)：HTR8/SVneo細(xì)胞培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基；MEF細(xì)胞和293T細(xì)胞培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。

5.質(zhì)粒構(gòu)建：根據(jù)pNL-IRES2-EGFP-NICD1的功能編碼區(qū)序列和載體p3×FLAG-CMV-10序列特點(diǎn),選擇EcoRⅠ和BamHⅠ作為雙酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物序列，Notch1上游引物：5′-CGAATTCAGTGCTGCTGTCCCGCAAGCGCCGGCG-3′，下游引物：5′-TAGCGGATCCTCACTTGAAGGCCTCCGGAATGCGGGCGATC-3′。通過(guò)PCR法擴(kuò)增目的序列，采用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR最終產(chǎn)物電泳，在紫外線燈下切取含目的片段的凝膠，回收并純化目的片段。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，選取7個(gè)單克隆菌落，取少量行PCR鑒定，取陽(yáng)性克隆的菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，提取質(zhì)粒，送上海生工生物工程公司測(cè)序。HA-Cul7全長(zhǎng)及不同長(zhǎng)短的質(zhì)粒、各Cullin蛋白家族成員Myc-Cul1、Myc-Cul2、Myc-Cul3、Myc-Cul4A、Myc-Cul4B、Myc-Cul5、Myc-Cul7質(zhì)粒及HA-FBXW7質(zhì)粒由美國(guó)哈佛醫(yī)學(xué)院貝斯以色列女執(zhí)事醫(yī)療中心病理系魏文毅教授惠贈(zèng)。

6.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種到60mm培養(yǎng)皿中，待皿中細(xì)胞生長(zhǎng)到90%以上匯合度時(shí)，按照LipofectAMINE 3000操作說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將10μl P3000TM加入300μl opti-MEM中混勻，將DNA預(yù)混液加入稀釋的P3000TM孵育15min形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，均勻滴入培養(yǎng)皿后在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48h收集蛋白。

7.慢病毒介導(dǎo)shRNA干擾HTR8/SVneo細(xì)胞Cul7的表達(dá)：構(gòu)建慢病毒載體shRNA序列為：Cul7shRNA 5′-GCACATGTTGAGTAGTCCTGATTAT-3′和Cul7shRNA 5′-ATAATCAGGACTACTCAACATGTGC-3′，同時(shí)構(gòu)建陰性對(duì)照shRNA序列為5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。將上海吉瑪生物有限公司構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體shCul7和PGLV3/H1/GFP+Puro穿梭質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G導(dǎo)入293T細(xì)胞中培養(yǎng)48h和72h后收集上清進(jìn)行病毒液濃縮并檢測(cè)病毒的滴度達(dá)到1×109TU/ml。嘌呤霉素篩選穩(wěn)定敲低Cul7的HTR8/SVneo細(xì)胞。

8.real-time PCR檢測(cè)目的基因mRNA的表達(dá)：使用Trizol提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。根據(jù)PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix試劑盒說(shuō)明操作，引物序列如表1所示，總反應(yīng)體系為25μl，反應(yīng)條件為 50℃ 2min； 95℃預(yù)變性 2min，95℃變性 15s、60℃ 1min，40個(gè)循環(huán)。

表1 引物序列

8.Western blot法檢測(cè)目的基因蛋白的表達(dá)：使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量法測(cè)蛋白濃度，蛋白裂解液與上樣緩沖液按2∶1混合煮沸5min，上樣50μg，進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1.5h后加入1∶1000稀釋的一抗4℃孵育過(guò)夜，用TBST洗滌后加入1∶5000稀釋的二抗室溫孵育1h。TBST洗膜，加入ECL發(fā)光試劑利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯示結(jié)果。

9.免疫共沉淀檢測(cè)蛋白相互作用情況：將Flag-Notch1重組質(zhì)粒、HA-Cul7真核表達(dá)質(zhì)粒和HA-FBXW7真核表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染導(dǎo)入HTR8/SVneo細(xì)胞，48h后使用溫和蛋白裂解液裂解細(xì)胞，測(cè)定蛋白濃度，取1mg蛋白進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。將蛋白樣品加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液至500μl，并加入20μl anti-HA Magnetic Beads磁珠，在4℃旋轉(zhuǎn)孵育4h，形成免疫復(fù)合物。用NETN緩沖液將磁珠洗滌3次，棄去緩沖液并加入50μl 2×SDS上樣緩沖液，搖勻煮沸5min后7500r/min離心2min，將上清移入新試管中用于免疫印跡分析。免疫沉淀檢測(cè)使用1∶1000稀釋的兔抗人Flag和鼠抗人HA。

結(jié) 果

1.Notch1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定：將含有人Notch1胞內(nèi)段基因的重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-Notch1送上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，將得到的測(cè)序結(jié)果在NCBI提供的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果與預(yù)期一致，表明已克隆人全長(zhǎng)Notch1基因，并成功構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-Notch1(圖1中A、B)。將HA-Cul7全長(zhǎng)及不同長(zhǎng)截短片段的質(zhì)粒、各Cullin蛋白家族成員Myc-Cul1、Myc-Cul2、Myc-Cul3、Myc-Cul4A、Myc-Cul4B、Myc-Cul5、Myc-Cul7及Flag-Notch1(NICD)真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HTR8/SVneo后收集細(xì)胞蛋白，Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率顯著(圖1中C、D)。

圖1 p3×FLAG-CMV-Notch1質(zhì)粒構(gòu)建及測(cè)序鑒定A.質(zhì)粒圖譜；B.重組質(zhì)粒測(cè)序圖(部分)；C. 轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA-Cul7全長(zhǎng)及Cul7不同長(zhǎng)短的截短質(zhì)粒；D.轉(zhuǎn)染各Cullin蛋白家族成員質(zhì)粒

2.Cul7基因敲除小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)Notch1蛋白表達(dá)升高：首先在MEF細(xì)胞中確定Cul7對(duì)Notch1的調(diào)控作用。Western blot法檢測(cè)野生型MEF細(xì)胞和Cul7基因敲除MEF細(xì)胞中Notch受體Notch1、Notch3、Notch4及配體Jagged1的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示敲除Cul7后Notch1蛋白(圖2)及其下游靶基因HES1和P21蛋白表達(dá)增加。

圖2 Cul7基因敲除MEF細(xì)胞Notch1蛋白表達(dá)升高A.Notch1、HES1及P21蛋白表達(dá)增加；B.Notch1、Notch3及Notch4蛋白表達(dá)增加

3.Cul7負(fù)調(diào)控細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞Notch1蛋白表達(dá)：使用Western blot法檢測(cè)干擾及過(guò)表達(dá)Cul7的HTR8/SVneo細(xì)胞Notch1及其下游靶基因的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示Cul7干擾效率顯著，干擾Cul7后Notch1蛋白表達(dá)升高，其主要下游靶基因HES1和P21蛋白水平同樣升高(圖3A)，而過(guò)表達(dá)Cul7使Notch1蛋白表達(dá)降低(圖3中B、C)。通過(guò)real-time PCR方法進(jìn)一步確定Cul7是否在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控Notch1表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，干擾Cul7的HTR8/SVneo細(xì)胞Notch1 mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.129，圖3D)。

圖3 Cul7抑制HTR8/SVneo細(xì)胞Notch1蛋白的表達(dá)A.干擾Cul7后Notch1蛋白表達(dá)；B、C.過(guò)表達(dá)Cul7后Notch1蛋白表達(dá)；D.干擾Cul7后Notch1 mRNA的表達(dá)水平

4.Cul7對(duì)Notch1蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控：通過(guò)使用蛋白酶體抑制劑MG132確定HTR8/SVneo細(xì)胞Notch1蛋白的泛素-蛋白酶體通路介導(dǎo)降解。不同濃度的MG132(0、0.1、0.5、1、2、4μmol/L)處理HTR8/SVneo細(xì)胞12h后收集蛋白，Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，Notch1蛋白水平隨MG132濃度增加而升高(圖4A)。為了確定Cul7對(duì)Notch1蛋白的調(diào)控作用，將穩(wěn)定干擾Cul7的HTR8/SVneo細(xì)胞使用終濃度為20μg/ml的放線菌酮(CHX)處理，收集不同處理時(shí)間的細(xì)胞蛋白(0、2、4、8、12h)。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，干擾Cul7表達(dá)后Notch1蛋白降解半衰期延長(zhǎng)(圖4B)。Close 等[12]研究發(fā)現(xiàn)FBXW7可直接調(diào)控Notch1蛋白穩(wěn)定性，筆者通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將Flag-Notch1、HA-Cul7和HA-FBXW7真核表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞后使用Co-IP方法檢測(cè)蛋白結(jié)合情況。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)BXW7與Notch1結(jié)合，但Cul7蛋白與Notch1蛋白在人滋養(yǎng)層細(xì)胞中無(wú)結(jié)合(圖4C)。

圖4 Cul7對(duì)Notch1蛋白穩(wěn)定性的影響A.蛋白酶體抑制劑MG132處理；B.放線菌酮處理，箭頭所示為指向Notch1是位于下方的條帶；C.Co-IP檢測(cè)蛋白結(jié)合情況

討 論

Cullin-RING泛素連接酶如Cul1、Cul3、Cul4B和Cul7在小鼠和人胎盤發(fā)育中具有重要調(diào)控作用[13,14]。Chabrun等[15]報(bào)道Cul7 mRNA在宮內(nèi)遲緩發(fā)育(intrauterine growth retardation, IUGR)胎盤組織表達(dá)升高約10倍，在與子癇前期合并的IUGR組織表達(dá)升高約15倍。

Notch通路的異?？赡苁菍?dǎo)致胎盤和滋養(yǎng)層功能異常妊娠疾病的發(fā)病機(jī)制[16]。Notch是絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞(EVT)祖細(xì)胞標(biāo)志物，在體外EVT形成過(guò)程中，檢測(cè)到Notch活性降低，表明Notch可能與滋養(yǎng)層前體的維持和分化有關(guān)[9]。Notch1水平的精確調(diào)節(jié)對(duì)于成功著床和蛻膜化是至關(guān)重要的，人絨毛膜促性腺激素介導(dǎo)的Notch1誘導(dǎo)可促進(jìn)子宮基質(zhì)細(xì)胞的存活并啟動(dòng)蛻膜化，其中Notch1下調(diào)和NUMB上調(diào)是完成分化所必需的[17]。

本研究首先觀察到Cul7基因敲除MEF細(xì)胞的Notch1蛋白表達(dá)升高，同樣觀察到干擾Cul7的HTR8/SVneo細(xì)胞中Notch1蛋白表達(dá)水平升高，而過(guò)表達(dá)Cul7后Notch1蛋白表達(dá)水平降低，提示Cul7在人滋養(yǎng)層細(xì)胞中負(fù)調(diào)控Notch1以及Notch1激活信號(hào)通路下游基因，是胎盤絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞分化過(guò)程中新的Notch1負(fù)調(diào)控的關(guān)鍵因子。為了確定Cul7和Notch1的調(diào)控關(guān)系，筆者使用real-time PCR技術(shù)觀察到，與陰性對(duì)照比較，干擾Cul7后Notch1 mRNA表達(dá)水平變化不顯著，表明此機(jī)制非轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。在使用蛋白酶體抑制劑MG132處理后，發(fā)現(xiàn)Cullin蛋白表達(dá)水平受到抑制時(shí)，Notch1及其下游靶基因分子表達(dá)顯著升高，提示Notch1在人滋養(yǎng)層細(xì)胞中可能受Cullin蛋白泛素化降解調(diào)控從而影響滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和分化。使用放線菌酮處理后發(fā)現(xiàn)干擾Cul7使Notch1降解速率明顯降低，提示干擾Cul7導(dǎo)致Notch1泛素化降解受阻，從而延長(zhǎng)其蛋白降解的半衰期。

本研究在HTR8/SVneo細(xì)胞中導(dǎo)入Flag-Notch1質(zhì)粒、HA-Cul7質(zhì)粒和HA-FBXW7質(zhì)粒，使用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，外源性Cul7與Notch1無(wú)結(jié)合，提示Cul7在HTR8/SVneo細(xì)胞中可能通過(guò)協(xié)同其他泛素連接酶等間接作用抑制Notch1的蛋白表達(dá)。目前仍不清楚Cul7是泛素化降解Notch1還是抑制Notch1蛋白合成。Sun等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Cul1異常介導(dǎo)Neddylation導(dǎo)致P21積累從而調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖分化并導(dǎo)致復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)，表明NEDD8-Cul1介導(dǎo)的P21降解在滋養(yǎng)層的正常發(fā)育中起重要調(diào)控作用，那么Cul7有可能通過(guò)Cul1間接泛素化降解Notch1，此機(jī)制還需進(jìn)行更深入的探索。

綜上所述，本研究通過(guò)人滋養(yǎng)層細(xì)胞系采用蛋白質(zhì)相互作用等分子生物學(xué)手段，研究Cul7泛素化修飾和降解Notch1的分子機(jī)制，明確了Cul7在人滋養(yǎng)層細(xì)胞通過(guò)調(diào)控Notch1蛋白半衰期從而影響其穩(wěn)定性，進(jìn)一步闡明了Cul7與Notch1的相互作用對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控和可能機(jī)制，可為胎兒生長(zhǎng)受限及子癇前期和自然流產(chǎn)等妊娠疾病的研究提供新的思路和理論依據(jù)。