何秀娟 劉青武 陳 佳 馬慧可 林 燕 李 萍

慢性創(chuàng)面是創(chuàng)面正常的愈合順序被破壞，盡管進(jìn)行了適當(dāng)?shù)闹委?，但愈合過(guò)程延長(zhǎng)。最常見的慢性創(chuàng)面主要有靜脈或動(dòng)脈潰瘍，壓瘡或糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer，DFU)[1]。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)能降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分，炎癥期清除損傷的蛋白質(zhì)和臨時(shí)ECM，增殖期降解毛細(xì)血管基膜，重塑期收縮和重塑組織，參與細(xì)胞遷移和血管生成。創(chuàng)面的高M(jìn)MPs活性及其與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(matrix metalloproteinase tissue inhibitors，TIMPs)失衡是導(dǎo)致慢性創(chuàng)面不易愈合的重要原因。

一、MMPs分類和功能

MMPs屬于Zn2+依賴金屬蛋白酶超家族，分為膠原酶、明膠酶、間充質(zhì)溶解素類、膜型-MMPs、基質(zhì)溶解素類和非定義類型[2]。MMPs可由多種細(xì)胞分泌并在細(xì)胞膜上聚集，在靜止期幾乎檢測(cè)不到。當(dāng)創(chuàng)傷時(shí)MMPs被激活，對(duì)促進(jìn)組織再生具有重要作用[3]。

1.膠原酶:包括間質(zhì)膠原酶(MMP-1)、中性粒細(xì)胞膠原酶(MMP-8)、膠原酶-3(MMP-13)和 MMP-18。傷口邊緣的MMP-1降低了α1β2整合素和Ⅰ型膠原之間的親和力，從而使傷口邊緣的角質(zhì)形成細(xì)胞遷移來(lái)閉合創(chuàng)面。慢性創(chuàng)面中發(fā)現(xiàn)大量α2-巨球蛋白(α2M)和MMP-1的復(fù)合物。MMP-8主要由中性粒細(xì)胞表達(dá)和儲(chǔ)存，能有效切割Ⅰ型膠原。糖尿病足潰瘍患者比非糖尿病患者的MMP-1和 MMP-8水平明顯升高，高蛋白水解環(huán)境導(dǎo)致糖尿病患者皮膚創(chuàng)面愈合不良。MMP-13影響角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移和血管生成，MMP-13敲除小鼠的成纖維細(xì)胞減少，創(chuàng)面收縮程度減輕。

2.明膠酶:包括MMP-2(明膠酶A)和MMP-9(明膠酶B)。MMP-2和MMP-9 釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) 可誘導(dǎo) ECM 及血管生成因子的釋放，促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織的纖維蛋白形成。角質(zhì)形成細(xì)胞、上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞都可以產(chǎn)生MMP-9。MMP-9能影響角質(zhì)形成細(xì)胞遷移和上皮再生。DFU患者受損皮膚中 MMP-9水平高于健康人和糖尿病患者的健康皮膚，且MMP-9上調(diào)程度與定植細(xì)菌數(shù)呈正相關(guān)[4]。難愈性糖尿病性潰瘍MMP-9基因表達(dá)異常[5]。使用siRNA技術(shù)降低糖尿病小鼠傷口MMP-9表達(dá)，可顯著加速傷口愈合過(guò)程并改善新生組織的質(zhì)量[6]。使用MMP-9抑制劑局部治療db /db糖尿病小鼠創(chuàng)面，可使創(chuàng)面愈合加速，再上皮化增多，細(xì)胞凋亡顯著減少。使用殼聚糖及硫酸軟骨素溶液加入Ⅰ型膠原制成的基質(zhì) GBT013 敷料作用于糖尿病小鼠慢性傷口，能夠降低MMP-9酶活性，促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合[7]。慢性DFU 滲出物中MMP-2 增高，對(duì)降解膠原蛋白和組織破壞具有顯著影響[8]。

3．其他：MMP-3 參與組織重塑，降解膠原纖維，并激活其他MMPs。MMP-14位于細(xì)胞表面，可切割細(xì)胞周圍的膠原纖維。

二、TIMPs分類和功能

TIMPs能夠結(jié)合并可逆性阻斷 MMPs活性，包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3 和TIMP-4。TIMP-1是MMP-9的特異性抑制劑，可促進(jìn)人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，減少細(xì)胞凋亡，主要在燒傷創(chuàng)緣強(qiáng)表達(dá)。TIMP-2抑制所有MMPs，主要抑制MMP-2前體與活性形式，在焦痂下基質(zhì)中大量表達(dá)，在遷移上皮創(chuàng)面邊緣缺乏。TIMP-3與周圍基質(zhì)緊密相連，可以抑制MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-13。TIMP-2和TIMP-3是MMP-14的抑制劑。TIMP-4在真皮創(chuàng)傷中作用較小。

慢性創(chuàng)面表皮中TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3的表達(dá)均降低，出現(xiàn)了MMPs與TIMPs的失衡。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病皮膚組織和糖基化終末產(chǎn)物處理的人成纖維細(xì)胞中 TIMP-1的表達(dá)均顯著降低；采用 TIMP-1載體介導(dǎo)基因治療糖尿病大鼠創(chuàng)面后，創(chuàng)面愈合明顯改善。采用激光照射體外培養(yǎng)的糖尿病患者皮膚成纖維細(xì)胞，可增加TIMP-1表達(dá)，減少基質(zhì)降解，促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合。

三、MMPs在創(chuàng)面愈合中的研究進(jìn)展

MMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-14、MMP-2和MMP-9在急性創(chuàng)傷皮膚再上皮化和消除瘢痕組織的作用已經(jīng)被報(bào)道。目前，大多數(shù)MMPs基因敲除的小鼠研究涉及傷口的急性炎癥，并不能說(shuō)明MMPs對(duì)慢性皮膚創(chuàng)面的作用。例如，MMP-3-/-動(dòng)物發(fā)生皮膚接觸性超敏反應(yīng)受損，MMP-9-/-小鼠皮膚炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少和清除細(xì)菌效率降低。MMP-9已知是維持慢性皮膚傷口的因素，因此是有害的，然而其在急性炎癥中發(fā)揮促血管生成作用，甚至可能是有益的。這說(shuō)明對(duì)于愈合遲緩性皮膚傷口，MMPs的作用取決于疾病或治療階段。

MMPs以無(wú)活性的酶原形式生成，受到TIMPs和α2-巨球蛋白的嚴(yán)格控制。大多數(shù)MMPs在皮膚中如何被激活，以及是否有活性都是未知的。隨著MMPs活性形式的研究深入，如果能開發(fā)出一種專門結(jié)合活性MMPs的阻斷劑結(jié)合樹脂，就可以在慢性傷口愈合領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展。MMP-9在糖尿病創(chuàng)面中表達(dá)上調(diào)，可作為糖尿病創(chuàng)面的標(biāo)志物。在糖尿病患者和非糖尿病患者的傷口中均檢測(cè)到MMP-8。此外，抑制MMP-9和給予外源性MMP-8治療可加速糖尿病小鼠傷口愈合。MMP-8和MMP-9抑制劑的聯(lián)合治療產(chǎn)生了疊加結(jié)果，表明基于藥理學(xué)抑制MMPs和外源酶替代的新療法是可行的[9, 10]。目前迫切需要對(duì)靜脈功能不全和壓瘡引起的慢性傷口的類似研究。MMPs的廣泛分析，酶活性測(cè)試和扎實(shí)的臨床工作將明確有害的和有益的MMPs，然后選擇最佳的選擇性MMPs抑制劑和理想的重組酶聯(lián)合治療特定的慢性傷口[11]。

一項(xiàng)把靜脈性腿部潰瘍患者創(chuàng)面滲出液中9種MMPs和4種人TIMPs水平進(jìn)行比較的研究表明，肉芽創(chuàng)面滲出液中MMP-1和MMP-13的水平高于炎性創(chuàng)面，而炎性創(chuàng)面滲出液中MMP-2、MMP-9和MMP-12的含量顯著高于肉芽創(chuàng)面[12]。在炎性創(chuàng)面滲出液中TIMP-1和TIMP-2水平較高，而在肉芽創(chuàng)面滲出液中TIMP-4水平較高。當(dāng)人骨髓單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞被創(chuàng)面滲出液刺激時(shí)，MMP-1、MMP-8和MMP-9水平在接觸炎性創(chuàng)面滲出物后升高，而MMP-3、MMP-7、MMP-12和MMP-13水平用肉芽創(chuàng)面分泌物刺激時(shí)升高。舒洛地希是一種治療靜脈性腿部潰瘍的糖胺聚糖(glycosaminoglycans, GAGs)，其在體外使肉芽創(chuàng)面滲出液刺激的THP-1細(xì)胞MMP-2水平升高，MMP-7水平降低，并使炎性創(chuàng)面滲出液刺激的THP-1細(xì)胞MMP-8水平顯著降低。上述結(jié)果闡明了MMPs水平的階段特異性差異，提供了一種針對(duì)不同疾病狀態(tài)獲取生化標(biāo)志物的篩選方法和標(biāo)準(zhǔn)，以客觀的方式評(píng)估臨床治療效果，但是尚不能確定這些分子是難愈合性靜脈創(chuàng)面的原因還是結(jié)果。由于沒有理想的慢性靜脈潰瘍的動(dòng)物模型，這些分子和治療方案尚未在體內(nèi)進(jìn)行研究。

另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，各種形式的MMP-9在壓瘡患者創(chuàng)面表達(dá)上調(diào)[13]。對(duì)MMP-9基因啟動(dòng)子(-1562 C->T)單核苷酸多態(tài)性的研究發(fā)現(xiàn)，T等位基因表達(dá)較高。一項(xiàng)由22例DFU患者參加的研究顯示，第0、12周“愈合良好者”MMP-1水平顯著高于“愈合不良者”；MMP-9水平顯著低于“愈合不良者”。研究通過(guò)分析MMP-9水平，MMP-1/TIMP-1和MMP-9/TIMP-1比率，提出了一種“不良治愈評(píng)分系統(tǒng)”，其可以在患者入院時(shí)確定，有可能在臨床上用作治愈的預(yù)測(cè)因子，從而采取適當(dāng)?shù)闹委熡?jì)劃[14]。

一項(xiàng)研究把靜脈性腿部潰瘍(VLU)患者、2型糖尿病神經(jīng)病變足潰瘍(DFU)患者和VLU患者的自體皮膚移植后供體部位(作為愈合對(duì)照傷口)比較，3組傷口液體沒有MMP-9水平的差異；兩個(gè)慢性傷口組 TIMP-1水平顯著降低，導(dǎo)致MMP-9/TIMP-1比率嚴(yán)重不平衡；2型糖尿病患者血清中MMP-9水平較高，因此研究認(rèn)為阻斷MMP-9高酶活性并不一定使慢性創(chuàng)面恢復(fù)正常[15]。

MMPs(包括MMP-9)是重要的免疫調(diào)節(jié)劑。局部使用蛋白酶(如膠原酶)及其抑制劑可模擬正常傷口愈合的過(guò)程，這種局部皮膚治療可能沒有全身不良反應(yīng)。第2種免疫調(diào)節(jié)方法是局部應(yīng)用MMPs誘導(dǎo)劑，例如原則上可以通過(guò)促炎IL-1誘導(dǎo)表達(dá)內(nèi)源性膠原酶，但如果循環(huán)中IL-1水平輕微升高，則可能誘發(fā)全身急性反應(yīng)和發(fā)熱。此外，一種更合適的方法可能是使用趨化因子，如人體內(nèi)主要的中性粒細(xì)胞趨化劑IL-8，IL-8與GAGs局部結(jié)合，并招募和激活中性粒細(xì)胞，產(chǎn)生MMP-8和所有形式的MMP-9[16]。

以蛋白酶抑制劑為基礎(chǔ)的策略來(lái)改善慢性傷口。慢性創(chuàng)傷微環(huán)境MMPs和TIMPs失衡導(dǎo)致外源性生長(zhǎng)因子的降解。因此，解決這個(gè)問(wèn)題的一種方法是提供蛋白酶抑制劑。例如，ND-336可選擇性地抑制MMP-2、MMP-9和MMP-14，可通過(guò)減少炎性反應(yīng)、增強(qiáng)上皮再生和增加血管生成來(lái)加速糖尿病小鼠的傷口閉合。在傷口敷料中加入蛋白酶抑制劑也已被探索。例如，將膠原蛋白和氧化再生纖維素基質(zhì)結(jié)合到傷口敷料中，可以通過(guò)與MMPs結(jié)合和鈍化來(lái)改善傷口修復(fù)。銀敷料和水凝膠是抗菌的，在豬模型和臨床試驗(yàn)中也顯示出了有前景的結(jié)果[17]。此外，銀通過(guò)取代MMPs中的鋅使蛋白酶失活，從而加速肉芽組織的形成。

慢性傷口MMPs的水平增加導(dǎo)致病理性基質(zhì)降解。因此需要功能性生物材料來(lái)恢復(fù)MMPs和TIMPs之間的平衡以促進(jìn)傷口愈合。硫酸化糖胺聚糖GAG衍生物具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，天然GAG與TIMP-3相互作用，前者是功能化生物材料中有希望的候選者。通過(guò)結(jié)合實(shí)驗(yàn)和分子建模方法鑒定了TIMP-3的GAG結(jié)合位點(diǎn)，并揭示GAG衍生物比天然GAG具有更高的螯合TIMP-3的能力，而且不改變其對(duì)MMPs的抑制潛力。因此，含有GAG衍生物的生物材料可以保護(hù)組織免于過(guò)度的蛋白水解降解，通過(guò)重建MMPs/TIMPs平衡來(lái)治療慢性傷口[18]。

四、展 望

MMPs和細(xì)胞因子一樣，可以成為治療常見慢性傷口的有效藥物或藥物靶點(diǎn)?，F(xiàn)有的技術(shù)可以確定在傷口愈合的不同階段的目標(biāo)蛋白酶。例如，MMP-9在炎癥早期是有益的中性粒細(xì)胞源性分子，但一旦形成肉芽組織，它就成為慢性傷口的有害和維持因素。到目前為止，直接促血管生成的治療方法都失敗了，但在動(dòng)物模型研究中，局部蛋白酶和蛋白酶抑制劑治療可促使糖尿病創(chuàng)面更快愈合。用促炎性細(xì)胞因子和趨化因子替代治療可能有助于將張力性肉芽腫性皮膚創(chuàng)面轉(zhuǎn)變?yōu)楦缓艿难仔越M織，這是外科清創(chuàng)術(shù)的一種補(bǔ)充方式?，F(xiàn)今的技術(shù)，例如轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)，用于描述正常和異常的傷口愈合，并且對(duì)于動(dòng)物模型，可以針對(duì)有用的免疫調(diào)節(jié)劑和靶標(biāo)。因此，跨學(xué)科研究的結(jié)合，以及用基礎(chǔ)、臨床前和臨床分子免疫學(xué)的專門研究取代病例報(bào)告，將改變慢性傷口愈合領(lǐng)域的發(fā)展。最后，免疫調(diào)節(jié)療法的臨床轉(zhuǎn)化取決于改進(jìn)給藥方法的發(fā)展[19]。然而，許多已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的療法未起到預(yù)期效果，因?yàn)槟壳暗慕o藥方法依賴于超生理的大劑量，而不是可控的、持續(xù)的釋放。因此，新的傳遞系統(tǒng)對(duì)于目前正在探索和未來(lái)將要探索的治療方法的成功轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。