金 麗 杭 娟 張曉丹

無(wú)錫聯(lián)勤保障中心藥品儀器監(jiān)督檢驗(yàn)站，江蘇 南京 210002

鐵必康膠囊由磁石、骨碎補(bǔ)、葛根、黃精、枸杞子、熟地黃、漏蘆、石菖蒲和酒大黃9味藥組成，為上海長(zhǎng)征醫(yī)院的非標(biāo)準(zhǔn)復(fù)方制劑，具有補(bǔ)腎健脾、益氣活血的作用。臨床主要用于治療慢性缺鐵性耳聾以及與鐵代謝障礙相關(guān)的各類非感染性、非遺傳性感音神經(jīng)性耳聾或梅尼埃病引起的耳鳴、耳聾與眩暈等。該制劑原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)過(guò)于簡(jiǎn)單，僅設(shè)置了骨碎補(bǔ)和葛根的薄層色譜鑒別，且未設(shè)置含量測(cè)定項(xiàng)。為了更有力地控制該制劑的內(nèi)在質(zhì)量，提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在原標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，本文修訂了葛根的薄層色譜鑒別，刪除了原標(biāo)準(zhǔn)中骨碎補(bǔ)的鑒別，并新增了大黃和枸杞子的鑒別。同時(shí)，以該制劑中葛根的主要有效成分——葛根素為指標(biāo)，新增高效液相色譜法測(cè)定其含量，控制其內(nèi)在質(zhì)量，以保證臨床用藥的有效性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)、MS105 電子天平、AL104電子天平(Mettler Toledo)、KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)。

1.2 試藥 葛根對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121551-201103)、大黃對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：120984-201202)、枸杞子對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121072-201410)、葛根素對(duì)照品(純度：95.5%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110715-201318)、大黃素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110756-200110)、大黃酚對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110796-201319)；鐵必康膠囊(規(guī)格：0.6 g/粒，上海長(zhǎng)征醫(yī)院，批號(hào)：171026，170912，170916)，陰性對(duì)照樣品由上海長(zhǎng)征醫(yī)院提供；硅膠G板(青島海洋化工廠分廠)；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 葛根的鑒別[1-3]取本品10粒的內(nèi)容物，加甲醇50 mL，超聲30 min，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，加等量乙酸乙酯提取2次，棄去乙酸乙酯液，水層再加等量的正丁醇振搖提取2次，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取葛根對(duì)照藥材0.2 g，加甲醇10 mL，放置2 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。取按樣品同樣工藝制備而成的缺葛根的陰性樣品6 g，按照供試品溶液的制備方法制備缺葛根的陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法[4](通則0502)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各5 μL，對(duì)照藥材溶液1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(7∶2.5∶0.25)為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸氣中熏15 min，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。結(jié)果如圖1所示。

2.1.2 大黃的鑒別[1,3,5]取本品10粒的內(nèi)容物，加甲醇50 mL，浸漬1 h，超聲30 min，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)?0 mL水使溶解，加鹽酸2 mL，置水浴中加熱30 min后，立即冷卻，用乙醚振搖提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。另取大黃對(duì)照藥材0.1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取大黃酚和大黃素對(duì)照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含0.5 mg的對(duì)照品溶液。取按樣品同樣工藝制備而成的缺大黃的陰性樣品6 g，按照供試品溶液的制備方法制備缺大黃的陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法[4](通則0502)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL、大黃對(duì)照藥材溶液1 μL、大黃酚對(duì)照品溶液2 μL、大黃素對(duì)照品溶液1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈365 nm下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)；置氨蒸氣中熏后，日光下檢視，顯相同的紅色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。結(jié)果如圖2所示。

2.1.3 枸杞子的鑒別[1,6]取本品10粒，內(nèi)容物加水50 mL，煮沸10 min，離心(3000轉(zhuǎn)/min)10 min，取上清液，加乙酸乙酯振搖萃取2次，每次30 mL，分取乙酸乙酯液，濃縮至2 mL，作為供試品溶液。另取枸杞子對(duì)照藥材0.5 g，加水35 mL，煮沸15 min，放冷，濾過(guò)，濾液用乙酸乙酯振搖萃取2次，每次15 mL，分取乙酸乙酯液，濃縮至1mL，作為對(duì)照藥材溶液。取按樣品同樣工藝制備而成的缺枸杞子的陰性樣品6 g，按照供試品溶液的制備方法制備缺枸杞子的陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法[4](通則0502)試驗(yàn)，吸取對(duì)照藥材溶液5 μL、供試品溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(15∶8∶1.5)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈365 nm下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。結(jié)果如圖3所示。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件[7-12]色譜柱：Dubhe C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(25∶75)；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm ；理論塔板數(shù)按葛根素峰計(jì)算不低于2500。

2.2.2 溶液的制備 ①對(duì)照品儲(chǔ)備液:稱取葛根素對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加稀乙醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得。②對(duì)照品溶液：精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，置于10 mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。③供試品溶液：取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，取約0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)1 h，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。④陰性對(duì)照溶液:按處方比例稱取缺葛根的其余藥味，按鐵必康膠囊制備工藝制備陰性樣品，然后按2.2.2③項(xiàng)下方法操作，制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各5 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的保留時(shí)間處有同一色譜峰，而陰性對(duì)照溶液在相應(yīng)保留時(shí)間處則無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明鐵必康膠囊中其他成分對(duì)葛根素的測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)果如圖4所示。

2.2.4 線性關(guān)系的考察 取葛根素對(duì)照品約12.5 mg，精密稱定(12.48 mg)，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解稀釋至刻度，搖勻，作為葛根素對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密葛根素儲(chǔ)備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置10 mL容量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為：

Y=21113X-3620.6，r=1.0000，n=6

結(jié)果表明：葛根素濃度在23.84～143.02 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取葛根素對(duì)照品約10 mg，精密稱定(9.51 mg)，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解稀釋至刻度，搖勻，作為葛根素對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取葛根素儲(chǔ)備液5.0 mL，置10 mL容量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，葛根素峰面積的RSD為0.28%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品(批號(hào)：170916)，按2.2.2③項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別于0、2、4、6、8、10和12 h進(jìn)樣，記錄葛根素峰面積，得峰面積的RSD為0.60 %，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品6份(批號(hào)：170916)，按2.2.2③項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄葛根素峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算葛根素的含量，測(cè)得其平均含量為7.2911mg·g-1，RSD為0.31%(見表1)，結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.8 加樣回收率 稱取6份已知含量的樣品(批號(hào)：170916，葛根素含量為7.2911 mg·g-1)，各約0.3 g，精密稱定，分別加入濃度為0.1906 mg·mL-1的對(duì)照品溶液(精密稱取葛根素對(duì)照品22.88 mg，置100 mL量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得)10 mL，按2.2.2③項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄葛根素峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算葛根素的含量，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.2.9 耐用性試驗(yàn) 流動(dòng)相比例的考察：取樣品(批號(hào)：170916)，按2.2.2③項(xiàng)下方法制備供試品溶液，調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄葛根素峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算每1 g樣品中葛根素的含量(mg/g)。結(jié)果表明，流動(dòng)相中甲醇的比例增大對(duì)含量測(cè)定結(jié)果影響相對(duì)更大些，但基本能剛好滿足樣品檢測(cè)的要求，見表3。

色譜柱的考察：取樣品(批號(hào)：170916)，使用不同品牌的色譜柱，按2.2.2③項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄葛根素峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算每1 g樣品中葛根素的含量(mg/g)。結(jié)果表明，不同色譜柱對(duì)含量測(cè)定結(jié)果影響很小，見表4。

表3 流動(dòng)相比例試驗(yàn)結(jié)果

表4 流動(dòng)相比例試驗(yàn)結(jié)果

柱溫的考察：取樣品(批號(hào)：170916)，在不同柱溫下，按2.2.2③項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄葛根素峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算每1 g樣品中葛根素的含量(mg/g)。結(jié)果表明，不同的柱溫對(duì)含量測(cè)定結(jié)果影響很小，見表5。

表5 柱溫試驗(yàn)結(jié)果

流速的考察：取樣品(批號(hào)：170916)，在不同流速下，按2.2.2③項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄葛根素峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算每1 g樣品中葛根素的含量(mg/g)。結(jié)果表明，不同的流速對(duì)含量測(cè)定結(jié)果影響很小，見表6。

表6 流速試驗(yàn)結(jié)果

以上結(jié)果表明該方法有較好的耐用性。

2.2.10 含量測(cè)定 取3批樣品，按2.2.2③項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄葛根素峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見表7。

表7 鐵必康膠囊中葛根素含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別

3.1.1 磁石 磁石是一種氧化物類礦物尖晶石族磁鐵礦，主含四氧化三鐵，因此，本試驗(yàn)嘗試?yán)描F鹽的鑒別反應(yīng)對(duì)其鑒別。參照文獻(xiàn)[13]和鐵鹽的一般鑒別方法[4](通則0301)，對(duì)磁石進(jìn)行化學(xué)鑒別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰性樣品對(duì)磁石的鑒別存在干擾。因此，磁石未能納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3.1.2 骨碎補(bǔ) 原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中設(shè)置了骨碎補(bǔ)的薄層色譜鑒別，但通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，供試品色譜中未能檢出相應(yīng)斑點(diǎn)。參考現(xiàn)行版藥典[1]和相關(guān)文獻(xiàn)[14-16]，采用多種預(yù)處理方法(正丁醇萃取、過(guò)大孔樹脂柱等)嘗試對(duì)制劑中的骨碎補(bǔ)進(jìn)行薄層色譜鑒別，均未能檢出相應(yīng)斑點(diǎn)。這可能與骨碎補(bǔ)主成分柚皮苷的性質(zhì)有關(guān)。柚皮苷在水中的溶解度為0.1%，75℃時(shí)也僅可達(dá)10%，結(jié)合該制劑水煮醇沉的生產(chǎn)工藝，考慮可能柚皮苷的轉(zhuǎn)移率過(guò)低，難以鑒別。因此，骨碎補(bǔ)未能納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3.1.3 石菖蒲和黃精 石菖蒲和黃精為方中臣藥，原標(biāo)準(zhǔn)均未建立它們的薄層色譜鑒別方法。參考文獻(xiàn)和藥典收載的石菖蒲和黃精相關(guān)鑒別方法[1,17-18]，采用對(duì)照藥材法，對(duì)該制劑中的石菖蒲和黃精進(jìn)行了鑒別。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試品色譜中未能檢出與相應(yīng)對(duì)照藥材色譜相對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)。因此，石菖蒲和黃精均未能納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 含量測(cè)定

3.2.1 指標(biāo)成分的選擇 鐵必康膠囊處方中的君藥為磁石和骨碎補(bǔ)，磁石是一種氧化物類礦物尖晶石族磁鐵礦，主含四氧化三鐵，藥典收載的磁石含鐵量的測(cè)定方法為重鉻酸鉀滴定法。由于中成藥的組分多，制成的滴定用供試品溶液顏色深，嚴(yán)重干擾滴定終點(diǎn)顏色的判斷，且各中藥組分的重金屬含量也會(huì)影響滴定的結(jié)果，因此含鐵量不宜作為該制劑的定量指標(biāo)；骨碎補(bǔ)的有效成分為柚皮苷，其水溶性差，且含量低，經(jīng)過(guò)該制劑水提醇沉的工藝后該成分的損耗更大，在前期的薄層色譜鑒別研究中未能檢出該成分，而用高效液相色譜法[1,16]預(yù)試驗(yàn)亦未能檢出，因此，骨碎補(bǔ)中的主成分柚皮苷亦不宜作為該制劑的定量指標(biāo)。鑒于以上情況，根據(jù)君臣佐使的原則，考慮選擇葛根的有效成分葛根素來(lái)控制制劑的有效性。

3.2.2 提取方法及條件的選擇 在樣品提取條件及方法的研究中，按正交表L9(34)設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)，考察了四個(gè)因素：提取方法(超聲、加熱回流、振搖)、溶劑種類(50%甲醇、稀乙醇、30%乙醇)、溶劑量(40、50、60 mL)和提取時(shí)間(30、60、90 min)對(duì)提取效率的影響。結(jié)果表明，最佳提取條件為：以40 mL稀乙醇為提取溶劑，超聲提取1 h?？紤]到精密加入溶劑的準(zhǔn)確性，選擇溶劑量為50 mL，最終采用稀乙醇50 mL超聲提取1小鐘制備供試品溶液。

3.2.3 流動(dòng)相的選擇 參考相關(guān)文獻(xiàn)[1,7-12]，選擇對(duì)甲醇-水和乙腈-水兩種流動(dòng)相體系及比例進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)甲醇-水(25∶75)和乙腈-水(11∶89)條件下，供試品中葛根素的出峰時(shí)間和分離效果都很好，均可滿足檢測(cè)要求?？紤]溶劑的毒性與檢測(cè)成本，本研究選擇了甲醇-水(25∶75)為流動(dòng)相。

3.2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 葛根素為異黃酮類衍生物，有紫外吸收，可用HPLC-UV測(cè)定。以甲醇-水(25∶75)為流動(dòng)相，分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液5 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。葛根素對(duì)照品和供試品中葛根素色譜峰的二極管陣列檢測(cè)器紫外吸收光譜圖如圖5所示。由圖可知，葛根素的最大吸收波長(zhǎng)為249 nm，參照現(xiàn)行版藥典中相關(guān)葛根素含量測(cè)定方法，選擇250 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。通過(guò)峰純度分析，在250 nm波長(zhǎng)下供試品溶液色譜圖中葛根素色譜峰的峰純度指數(shù)為1.00000，因此該波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)，能滿足含量測(cè)定的要求。

鐵必康膠囊由9味藥材制成，然而原標(biāo)準(zhǔn)中檢驗(yàn)項(xiàng)目極為簡(jiǎn)單，項(xiàng)目設(shè)置非常不完善，無(wú)法真實(shí)客觀評(píng)價(jià)鐵必康膠囊產(chǎn)品的質(zhì)量狀況，更加無(wú)法有效地控制產(chǎn)品質(zhì)量。本研究從質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的角度對(duì)鐵必康膠囊的薄層色譜鑒別和含量測(cè)定方法進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，進(jìn)一步完善了該制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，可更加科學(xué)、有效地評(píng)價(jià)該制劑的內(nèi)在質(zhì)量，保障臨床用藥的有效性。