劉晶晶 李玉華

內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼市食品藥品檢驗(yàn)所，內(nèi)蒙古 通遼 028000

塔斯音-10由蓽撥、雕糞炭、寒水石(煅)、萬(wàn)年灰(制)、鐵線透骨草、全石榴、干姜、光明鹽、蘇格木勒、肉桂等10味藥組成[1]，主治胃火衰弱、胃寒食積、消化不良等[2]。蓽茇為胡椒科植物蓽茇PiperlongumL. 的干燥近成熟果穗，作為中、蒙藥常用藥材，近些年來(lái)藥理研究發(fā)現(xiàn)蓽撥中所含胡椒堿Piperine具有抗氧化、抗炎殺菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜、抗焦慮、抗胃潰瘍、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種藥理作用[3-4]。作為臨床常用的蒙藥醫(yī)院制劑，目前為止，塔斯音-10質(zhì)量控制方面的標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)重缺失，只有簡(jiǎn)單的外觀性狀和檢查項(xiàng)目[2]。建立塔斯音-10主要藥效成份胡椒堿含量測(cè)定的方法，能有效控制該成藥的內(nèi)在質(zhì)量，為該成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考。

1 儀器及試藥

1.1 儀器 Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀，Shimadzu LC-2030C液相色譜儀，InertSustain AQ-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。92SM-202A型電子天平，XS3DU電子天平，KQ5200DE超聲波清洗機(jī)。

1.2 試藥 對(duì)照品胡椒堿(批號(hào)：110775—201706，98.9%)由中國(guó)食品藥品檢定研究院所提供；樣品塔斯音-10來(lái)源：1號(hào)樣品(批號(hào)：20190909)由通遼市蒙醫(yī)整骨醫(yī)院提供；2號(hào)樣品(批號(hào)：20181221)由庫(kù)倫旗蒙醫(yī)院制劑室提供；3號(hào)樣品(批號(hào)：20190223)由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供。水為高純水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 HPLC 方法學(xué)考察

2.1 色譜條件[5]色譜柱：InertSustain AQ C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Sepax Bio C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)343 nm。流動(dòng)相：甲醇-水(77∶23)，流速為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取胡椒堿對(duì)照品10.32 mg，置100 mL棕色量瓶中，加無(wú)水乙醇至刻度，搖勻，精密量取1 mL置10 mL棕色量瓶中，加無(wú)水乙醇至刻度，搖勻即得胡椒堿對(duì)照品溶液(10.32 μg·mL-1)。

2.3 供試品溶液配制[6]取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約0.1 g，精密稱定，置具塞棕色瓶中，精密加入無(wú)水乙醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 Hz)30 min，放冷，再稱定重量，用無(wú)水乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 專屬性試驗(yàn) 取按處方比例制備的不含胡椒堿藥材的陰性對(duì)照供試品，按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備法制得陰性對(duì)照溶液。在上述色譜條件下，分別精密吸取對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液、供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果陰性對(duì)照色譜圖中在與胡椒堿對(duì)照品以及供試品色譜圖相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明該方法專屬性強(qiáng)，其他組分對(duì)胡椒堿的測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖如圖1所示。

A. 陰性樣品； B.對(duì)照品； C.供試品圖1 HPLC色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取胡椒堿對(duì)照品0.00645 g，置25 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，做為胡椒堿對(duì)照品儲(chǔ)備液(258 μg·mL-1)。精密吸取該貯備液40、200、400、600、800、1000 μL，分別置于10 mL量瓶中，用無(wú)水乙醇稀釋定容后得到含有1.032 μg·mL-1、5.16 μg·mL-1、10.32 μg·mL-1、15.48 μg·mL-1、20.64 μg·mL-1、25.8 μg·mL-1的胡椒堿對(duì)照品系列濃度溶液。精密量取上述各濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以對(duì)照品峰面積Y為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的對(duì)照的量X為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。得到胡椒堿回歸方程為：Y=71998X，r=0.9993，表明胡椒堿在0.0103～0.2580 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 按2.3項(xiàng)下供試品溶液配制方法，精密稱取內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供，批號(hào)為20190223的樣品約0.1012 g，配制成精密度試驗(yàn)溶液，精密吸取樣品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積的RSD值為0.36%，表明該方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供，批號(hào)為20190223的樣品約0.1012 g，按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法配制穩(wěn)定性試驗(yàn)溶液，室溫放置，分別在0、1、3、6、12、24 h進(jìn)樣，記錄譜圖，測(cè)得峰面積。結(jié)果24 h內(nèi)峰面積的RSD值為0.59%，表明該方法提取的樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供，批號(hào)為20190223的樣品6份，每份約0.1 g，精密稱定，按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法配制重復(fù)性試驗(yàn)溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果6份平行樣的含量RSD值為1.48%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 準(zhǔn)確度及范圍[7-8]取已知含量的樣品(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供的，批號(hào)為20190223)9份，每份約0.05 g，精密稱定，置50 mL棕色量瓶中，分別加入2.5項(xiàng)下胡椒堿對(duì)照品貯備液380 μL、650 μL、1105 μL，按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成加標(biāo)回收溶液，配制成高、中、低三個(gè)濃度的加樣回收溶液，精密量取上述9份樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。三個(gè)濃度加標(biāo)回收率平均值為99.86%，RSD值為0.76%。表明胡椒堿含量在1.9～5.7 μg·mL-1范圍內(nèi)測(cè)得的結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.10 不同色譜柱和儀器設(shè)備的耐用性試驗(yàn) 換不同廠家、不同型號(hào)的色譜柱及不同的液相色譜儀，取內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供，批號(hào)為20190223的樣品，精密稱定，按2.3項(xiàng)下供試品溶液配制方法配制樣品溶液，精密吸取該樣品溶液和2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液各10 μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品中胡椒堿含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同色譜柱、不同儀器的耐用性試驗(yàn)

從表中數(shù)據(jù)可以看出，胡椒堿的含量變化不大(RSD值0.89%)，表明該方法對(duì)不同色譜柱和儀器設(shè)備耐用性良好。

3 樣品含量測(cè)定[9-10]

分別取三個(gè)廠家提供的塔斯音-10樣品粉末約0.1 g，精密稱定，按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法提取制備樣品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 3批蓽茇藥材中胡椒堿含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

4 討論

成藥粉末以甲醇和無(wú)水乙醇作為提取溶劑進(jìn)行超聲提取(功率120 W，頻率40 kHz)，結(jié)果無(wú)水乙醇提取效率高于甲醇，故提取溶劑定為無(wú)水乙醇。為保證胡椒堿成分提取完全，實(shí)驗(yàn)中考察了超聲提取15 min、30 min和60 min，結(jié)果胡椒堿的含量基本一致(RSD 0.31%)，故提取時(shí)間定為30 min。

柱溫對(duì)胡椒堿與其它干擾組分的分離度影響較大。柱溫40 ℃時(shí)胡椒堿拖尾嚴(yán)重，與相鄰干擾組分峰分離度變小(R值為1.218，小于1.5)，分不開(kāi)。柱溫調(diào)整至30 ℃時(shí)，胡椒堿拖尾因子變小，與相鄰組分分離度變大，分離較好(R值為1.653)。故將柱溫設(shè)定為30 ℃。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)專屬性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)、不同色譜柱及儀器設(shè)備的耐用性考察，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確可靠，可作為塔斯音-10中胡椒堿含量測(cè)定的方法。