鄒鴻遠，朱成悅，張姍姍，孔銳琦，張云*，劉可春*

(1.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 山東省科學院生物研究所 山東省人類疾病斑馬魚模型與藥物篩選工程技術研究中心，山東 濟南 250103; 2.烏克蘭基輔國立工藝設計大學，烏克蘭 基輔 01011)

牡丹籽油是由牡丹籽提取的木本堅果植物油，其不飽和脂肪酸質(zhì)量分數(shù)高達85%左右，主要為油酸、亞麻酸和亞油酸。其中人體必需脂肪酸α-亞麻酸質(zhì)量分數(shù)超過40%以上，是常用植物油的幾十倍[1]。由于牡丹籽油脂肪酸構成比較獨特，又富含多種有益的微量成分，如角鯊烯、巖藻甾醇、牡丹酚等，因此具有醫(yī)療保健作用，被稱為植物油中的珍品[2]。牡丹種子的化學成分中含有萜類、甾醇類、茋類和類黃酮等化合物[3]，牡丹籽油中約有四十多種脂肪酸，主要包括C9至C26的脂肪酸，其中亞油酸的質(zhì)量分數(shù)約為30%，具有抗心血管疾病、降低血糖、抗氧化等作用[4-5]。牡丹籽油中含有的角鯊烯、維生素E、植物甾醇和多不飽和ω脂肪酸等成分，具有調(diào)節(jié)身體機能功效、改善新陳代謝、抑制脂質(zhì)過氧化、延遲衰老的作用，其高附加值產(chǎn)品有很大的發(fā)展?jié)摿?。然而，由于不飽和脂肪酸對溫度、光照等外環(huán)境因素敏感，穩(wěn)定性較差，在加工、貯藏過程中易被氧化，影響其品質(zhì)[6-7]，將牡丹籽油進行微囊化處理，對提高其化學穩(wěn)定性、保證生物功能、改善生物利用度等具有重要意義。

目前，實驗動物模型大多使用傳統(tǒng)的模式生物，如小鼠和爪蟾，這些生物仍然存在諸如實驗期長和觀察困難等缺點。而作為整體動物模型的斑馬魚[8-10]和人類的基因同源序列達到87%相似度，在生理結(jié)構和分子水平方面高度相似。斑馬魚個體小，所需的生活空間較小，易于人工飼養(yǎng)，也容易管理。斑馬魚產(chǎn)卵周期較短、繁殖速度快、卵的產(chǎn)量大，可在短期內(nèi)進行大量實驗。斑馬魚在體外進行受精與發(fā)育，胚胎透明，可以直接在顯微鏡下觀察其發(fā)育過程，易于進行胚胎畸形評價。斑馬魚胚胎能通過卵黃囊吸收營養(yǎng)物質(zhì)，不用喂食，可在多孔板中存活數(shù)天[11]。在實驗中可以節(jié)省所需藥物的使用，還可以減少對實驗動物培養(yǎng)的時間和成本。因此，斑馬魚是一種既有細胞實驗的經(jīng)濟性特點，又有體內(nèi)實驗的全面性和可靠性等優(yōu)勢的模式動物，已經(jīng)應用于藥理學、毒理學等多個研究領域。

異煙肼(INH)是一線抗結(jié)核類藥物，但在用藥過程中發(fā)現(xiàn)其具有潛在的毒副作用。INH會通過胎盤進入胎兒體內(nèi)，使胎兒的血藥濃度高于母體，影響胎兒和新生兒的發(fā)育[12]。馬瑞嬌等[13]的抗結(jié)核藥物對斑馬魚肝臟的毒性大小比較研究表明，隨著INH劑量的增加和給藥時間的延長，幼魚的死亡率和畸形率隨之升高。

本文利用斑馬魚模型，評價牡丹籽油微囊粉(PSO)的安全性，并研究PSO對INH發(fā)育毒性的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 斑馬魚及飼養(yǎng)條件

1.1.2 儀器與試劑

儀器：斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛生科技有限公司)；SPX-280B-G型博訊光照培養(yǎng)箱 (上?；巧锟萍加邢薰?；體視熒光顯微鏡(Olympus公司)；DP2-BSW圖像軟件(Olympus公司)；IE204E型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；低溫臺式離心機(Eppendorf公司)；XW-80A 微型旋渦混合儀(上海滬西分析器廠有限公司)；HL398S超低溫冰箱(中科美菱低溫科技有限責任公司)；Zebrabox斑馬魚行為分析儀(法國Viewpoint 公司)；EQ2200DV型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TD5A-WS臺式低速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)。

試劑：牡丹籽油微囊粉(PSO)由山東省科學院生物研究所藥物篩選技術重點實驗室提供；INH購自Fluka公司；甲基纖維素(methylcellulose)購自Sigma公司；無水乙醇和亞甲基藍購自國藥集團化學試劑有限公司。PSO和INH用斑馬魚養(yǎng)殖水溶解稀釋。甲基纖維素用純水配置成濃度為80 mg/mL的溶液，經(jīng)超聲充分混勻，放于4 ℃保存。斑馬魚養(yǎng)魚水的配方為0.17 mmol/L KCl、0.4 mmol/L CaCl2、0.16 mmol/L MgSO4和5 mmol/L NaCl。

1.2 方法

1.2.1 牡丹籽油微囊粉的制備

1.2.2 處理斑馬魚幼魚的方法

當斑馬魚胚胎發(fā)育2 hpf(hour post fertilization)時，選擇健康的受精卵并小心地吸入12孔板各孔中，每孔放入15枚胚胎。設定空白對照組(養(yǎng)殖系統(tǒng)制備水)，PSO給藥濃度設置為20、40、80、160、320 μg/mL。每個濃度組設置3個重復孔。在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行控光培養(yǎng)。不間斷給藥5 d，每天定時清除死亡的胚胎和幼魚(以是否有心跳作為判斷斑馬魚是否存活的標準)且更換一半的藥液和對照組養(yǎng)魚水。

當斑馬魚胚胎發(fā)育至2 hpf時，選擇健康的受精卵并小心地吸入12孔板各孔中，每孔放入15枚胚胎。設定空白對照組(養(yǎng)殖系統(tǒng)制備水)、28 mmol/L INH單用藥組、28 mmol/L INH和20 μg/mL PSO聯(lián)合給藥組，每個濃度組設置3個重復孔。在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行控光培養(yǎng)。不間斷給藥5 d，每天定時清除死亡的胚胎和幼魚(以是否有心跳作為判斷斑馬魚是否存活的標準)且更換一半的藥液和對照組養(yǎng)魚水。

1.2.3 斑馬魚死亡率和孵化率

分別在24、48、72、96 hpf時記錄斑馬魚的死亡數(shù)，計算死亡率；在48、72 hpf時記錄胚胎的孵化數(shù)，計算孵化率。

1.2.4 各暴露階段圖像記錄

每天用體視熒光顯微鏡觀察并拍攝每組內(nèi)隨機10條斑馬魚的發(fā)育情況，使用甲基纖維素將麻醉后的斑馬魚幼魚以側(cè)體位固定于載玻片上，對斑馬魚進行形態(tài)評分。評分標準參考文獻[15]，5分：發(fā)育階段的解剖結(jié)構完全正常；4分：形態(tài)上的輕微變化暗示發(fā)育遲緩或異常，有可能恢復；3分：結(jié)構有輕微異常，通常只有1個異常；2分：結(jié)構有中度畸形，通常有兩個或兩個以上的異常；1分：結(jié)構有嚴重畸形，通常伴有多處異常；0.5分：通過大體形態(tài)評估，結(jié)構不明顯。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用mean±SE來表示，通過SPSS 13.0t檢驗來分析統(tǒng)計學差異。P<0.05表明具有統(tǒng)計學差異，P<0.01表明具有顯著統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 PSO對斑馬魚的安全劑量研究

2.1.1 PSO對斑馬魚孵化率、死亡率的影響

觀察斑馬魚胚胎的孵化情況，與對照組相比，PSO濃度為20、40、80 μg/mL的給藥組死亡率無顯著變化。給藥濃度升高到160 μg/mL和320 μg/mL時，孵化率顯著下降，見圖1。

觀察斑馬魚胚胎的存活情況。給藥24、48和72 h后，PSO各給藥組與對照組死亡率無顯著性差異。給藥96 h后，PSO濃度為160 μg/mL和320 μg/mL時，死亡率顯著升高，見圖2。

注：**為存在極顯著差異。圖1 暴露于各濃度PSO的斑馬魚胚胎及幼魚孵化情況Fig.1 Hatching rate of zebrafish embryos and juveniles exposed to various concentrations of PSO

注：*為存在顯著性差異。圖2 暴露于各濃度PSO的斑馬魚胚胎及幼魚死亡情況Fig.2 Mortality rate of zebrafish embryos and juveniles exposed to various concentrations of PSO

2.1.2 PSO對斑馬魚幼魚形態(tài)發(fā)育的影響

觀察各濃度組斑馬魚畸形情況。在PSO濃度為20、40和80 μg/mL時，對斑馬魚幼魚的形態(tài)發(fā)育基本無不良影響，未出現(xiàn)畸形的情況，可以確定為斑馬魚幼魚的安全劑量，各組斑馬魚形態(tài)圖見圖3。

圖3 不同濃度的PSO對斑馬魚幼魚形態(tài)的影響Fig.3 Effects of various concentrations of PSO on morphology of juvenile zebrafish

2.2 PSO對INH發(fā)育毒性的保護作用

2.2.1 PSO對INH導致的斑馬魚死亡率的影響

觀察斑馬魚胚胎的存活情況。給藥24、48 和72 h后，各給藥組與對照組死亡率無顯著統(tǒng)計學差異。給藥96 h后，INH給藥組死亡率明顯上升。與INH單用藥組相比，PSO和INH聯(lián)用組的死亡率有所下降，見圖4。

注：**為存在極顯著差異，*為存在顯著性差異。圖4 暴露于28 mmol/L INH和20 μg/mL PSO中斑馬魚胚胎和幼魚的死亡情況Fig.4 Mortality rate of zebrafish embryos and juveniles exposed to 28 mmol/L isoniazid and 20 μg/mL PSO

2.2.2 PSO對INH導致斑馬魚幼魚發(fā)育畸形的影響

與對照組相比，INH單獨給藥組隨時間和濃度的增加，斑馬魚幼魚出現(xiàn)明顯的畸形，如心包水腫、脊柱畸形、卵黃囊吸收延滯和魚鰾缺失等。PSO和INH聯(lián)合給藥組的幼魚畸形情況得到了顯著緩解，見圖5。圖中紅色箭頭為卵黃囊吸收延滯，綠色箭頭為魚鰾缺失，藍色箭頭為尾部彎曲，黑色箭頭為心包水腫。圖6為96 hpf各組斑馬魚形態(tài)畸形圖。對照組的斑馬魚形態(tài)正常，評分為5分。單獨加入INH組魚體出現(xiàn)明顯畸形，評分下降顯著，多為1～3分。PSO 20 μg/mL和INH聯(lián)合給藥組的幼魚畸形情況得到了緩解，評分上升，多為3～4分，評分圖見圖7。

圖5 暴露于28 mmol/L INH和20 μg/mL PSO的斑馬魚胚胎及幼魚的形態(tài)圖Fig.5 Morphological images ofzebrafish embryos and juveniles exposed to 28 mmol/L isoniazid and 20 μg/mL PSO

圖6 96 hpf各組斑馬魚形態(tài)畸形圖Fig.6 Images of morphological abnormalities of zebrafish in each group at 96 hpf

注：**為存在極顯著差異，##為存在極顯著差異。圖7 72和96 hpf各組形態(tài)評分圖Fig.7 Morphological score images at 72 and 96 hpf

3 討論

INH是一線抗結(jié)核藥物，但具有一定的發(fā)育毒性。INH的毒性作用機制至今尚不明確，有研究認為INH使線粒體發(fā)生氧化損傷，進而影響細胞的正常能量代謝，造成細胞的大量凋亡，最終導致機體損傷[16]。研究表明，隨著INH劑量的增加和給藥時間的增長，幼魚的死亡率和畸形率隨之升高，造成脊柱彎曲和魚鰾缺失等多種毒效應[17]。

通過微囊化工藝制得的PSO，在保留牡丹籽油有效成分的同時也使其溶解度得到了提高。根據(jù)實驗結(jié)果推測，PSO通過發(fā)揮其抗氧化作用，減弱INH對線粒體的氧化損傷，從而降低INH的發(fā)育毒性。

本文首次應用模式生物斑馬魚進行PSO的安全性評價和預防發(fā)育畸形的活性研究，研究結(jié)果可為PSO的臨床用藥提供理論依據(jù)。