湯鳴強(qiáng) 鄭永彬 潘思萍 黃 潔

培養(yǎng)條件對(duì)繡球菌液體菌種制備質(zhì)量的影響

湯鳴強(qiáng)1, 2鄭永彬3潘思萍1黃 潔3

（1. 福建師范大學(xué)福清分校海洋與生化工程學(xué)院，福建 福清 350300；2. 現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)福建省高校工程研究中心，福建 福清 350300；3. 福建容益菌業(yè)科技研發(fā)有限公司，福州 350100）

采用錐形瓶液體培養(yǎng)方式，以廣葉繡球菌（）為試驗(yàn)材料，通過(guò)考察菌絲生物量及菌球大小評(píng)分，研究培養(yǎng)時(shí)間、搖瓶轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)液起始pH及搖瓶裝液量對(duì)繡球菌液體菌種制備質(zhì)量的影響。單因素綜合試驗(yàn)結(jié)果為，適宜培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時(shí)間12天，轉(zhuǎn)速210 r/min，培養(yǎng)溫度26 ℃，pH 3.5，裝液量75 mL，該條件下所形成的菌絲球均勻細(xì)小，菌絲生物量大，菌絲萌發(fā)點(diǎn)多，是良好的液體菌種材料。

廣葉繡球菌；液體培養(yǎng)條件；菌種質(zhì)量

繡球菌（）又名繡球菇、花瓣覃、花椰菜菌，是食藥兩用菌[1]，其突出特點(diǎn)是含有40%以上的β-葡聚糖，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及抗菌抗氧化等多種生物學(xué)活性，可促進(jìn)傷口愈合，增強(qiáng)造血功能，有廣闊的應(yīng)用前景[2-4]。

近年來(lái)，液體菌種所具有的接種方便、生產(chǎn)周期短、菌絲萌發(fā)點(diǎn)多、菌齡一致以及便于連續(xù)化自動(dòng)化操作等優(yōu)點(diǎn)，已獲得業(yè)內(nèi)人士的廣泛認(rèn)同，發(fā)達(dá)國(guó)家為提高產(chǎn)品品質(zhì)和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，已普遍采用液體菌種進(jìn)行食用菌的周年化生產(chǎn)[5-6]。我國(guó)食用菌栽培仍以固體制種為主，僅杏鮑菇、金針菇和蟹味菇等品種的規(guī)模化、工廠化生產(chǎn)采用液體菌種[7]。繼日本、韓國(guó)之后，我國(guó)于2010年底在福建省首次實(shí)現(xiàn)了繡球菌工廠化栽培[8]，由于液體培養(yǎng)條件下繡球菌生長(zhǎng)較為緩慢，國(guó)內(nèi)相關(guān)研究主要關(guān)注固體培養(yǎng)方式[9]。

本課題以廣葉繡球菌（）為供試菌種，采用液體培養(yǎng)方式，考察培養(yǎng)時(shí)間、搖瓶轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)液起始pH、搖瓶裝液量等因素對(duì)菌絲生物量的影響，并結(jié)合感觀指標(biāo)，評(píng)價(jià)不同條件下的液體菌種生長(zhǎng)情況，為繡球菌液體菌種的大規(guī)模生產(chǎn)與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）菌種。廣葉繡球菌（）母種由福建容益菌業(yè)科技研發(fā)有限公司提供。

（2）培養(yǎng)基配方。母種培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200，葡萄糖20，蛋白胨2，硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀1，酵母膏1，復(fù)合維生素B10.01，pH自然。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30，蛋白胨4，磷酸二氫鉀4，硫酸鎂2，玉米漿1.5，pH 自然。

（3）主要儀器。NRY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；BS224S型電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-IFD型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；PH-100型筆式pH測(cè)試筆，上海力辰儀器科技有限公司；LDZX-50KB型蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；TGL-16M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，湖南湘儀室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

（1）菌種活化。在無(wú)菌條件下，用接種鏟取一塊供試菌種接種于母種培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)15天，觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)，待用。

（2）菌絲干重測(cè)定。培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液樣品于8 000 r/ min下離心10 min，收集沉淀物，用去離子水洗滌3次，置于鼓風(fēng)干燥箱中，80 ℃烘干至恒重，測(cè)定菌絲體干重（g/L）。

（3）菌球大小評(píng)分。參照胡衛(wèi)紅[10]的試驗(yàn)方法。將繡球菌液體菌種在不同條件下培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察測(cè)定菌球大小并給予評(píng)分，滿分5分，分?jǐn)?shù)越高，說(shuō)明菌球越小、質(zhì)量越好（表1）。

表1 菌球大小評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表2 單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

（4）培養(yǎng)條件對(duì)繡球菌液體菌種制備質(zhì)量的影響?；A(chǔ)液體發(fā)酵條件設(shè)定為培養(yǎng)時(shí)間10天，轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度26 ℃，裝液量100 mL/250mL，pH自然。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)改變單一因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)（表2），其他條件與基礎(chǔ)條件一致。測(cè)定繡球菌菌絲干重，并對(duì)菌球大小評(píng)分，考察培養(yǎng)條件對(duì)繡球菌液體菌種制備質(zhì)量的影響。

（5）數(shù)據(jù)處理與分析。采用Oringin 2018作圖，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析在spss25.0下完成，利用LSD多重比較法檢測(cè)處理間差異顯著性，顯著性水平設(shè)定為＜0.05。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母表示處理間有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)繡球菌液體菌種制備質(zhì)量的影響

絲狀真菌液體培養(yǎng)菌體的形態(tài)不僅受基因控制，也受培養(yǎng)條件的影響。由圖1可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲干重呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，而菌球大小評(píng)分則呈逐漸增高的趨勢(shì)。培養(yǎng)12天時(shí)，菌絲干重最大，為1.596±0.007 g/L，菌球大小評(píng)分1.31。繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，菌絲干重逐漸降低，菌球大小評(píng)分差異不顯著。綜合考慮，繡球菌液體菌種培養(yǎng)時(shí)間以12天較合適。

2.2 搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)繡球菌液體菌種制備質(zhì)量的影響

液體發(fā)酵中，菌球直徑和菌絲長(zhǎng)度均會(huì)隨轉(zhuǎn)速的增加而減小。轉(zhuǎn)速過(guò)高，有可能降低菌絲體的成球速度甚至無(wú)法成球，進(jìn)而影響到菌體生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的積累。由圖2可以看出，隨著搖瓶轉(zhuǎn)速的增加，菌絲干重呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，而過(guò)高轉(zhuǎn)速對(duì)菌球大小評(píng)分不利。當(dāng)轉(zhuǎn)速為210 r/min和240 r/min時(shí)，菌絲干重分別為1.582±0.007 g/L和1.597±0.141 g/L，兩者差異不顯著。但轉(zhuǎn)速為210 r/min時(shí)，菌球評(píng)分最高，菌球表現(xiàn)均勻、細(xì)小，適合用于接種。

2.3 培養(yǎng)溫度對(duì)繡球菌液體菌種制備質(zhì)量的影響

培養(yǎng)溫度明顯影響繡球菌的生長(zhǎng)（圖3）。當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)，菌絲干重為2.016±0.057 g/L，達(dá)到最大值，菌球評(píng)分為2.19；培養(yǎng)溫度為26 ℃時(shí)，菌絲干重為1.819±0.095 g/L，菌球評(píng)分為3.38。盡管菌絲干重26 ℃條件下顯著低于28 ℃條件，但前者的菌球評(píng)分顯著高于后者，菌球小，萌發(fā)點(diǎn)多，生活力強(qiáng)。綜合考慮，培養(yǎng)溫度宜選擇26 ℃。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間繡球菌液體菌種的制備質(zhì)量

圖2 不同搖瓶轉(zhuǎn)速繡球菌液體菌種的制備質(zhì)量

圖3 不同培養(yǎng)溫度繡球菌液體菌種的制備質(zhì)量

圖4 不同pH繡球菌液體菌種的制備質(zhì)量

2.4 pH對(duì)繡球菌液體菌種制備質(zhì)量的影響

pH不僅影響微生物液體培養(yǎng)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶解、傳遞和相關(guān)代謝酶的活性，而且對(duì)形態(tài)也有重要影響。有研究報(bào)道，冬蟲(chóng)夏草菌絲體液體培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)液pH為6時(shí)，可形成直徑為1.8 mm左右、大小均一且表面光滑的菌絲球；培養(yǎng)液pH為4.0～5.0時(shí)，菌絲球變得大小不一；而培養(yǎng)液pH為8.0～9.0時(shí)則無(wú)法成球[11]。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，pH 3.5時(shí)，菌絲干重為1.751±0.028 g/L，達(dá)到最大值（圖4），與其他處理比較差異顯著。在該條件下，菌球評(píng)分為3.91表現(xiàn)均勻細(xì)小，菌絲萌發(fā)點(diǎn)多。

2.5 裝液量對(duì)繡球菌液體菌種制備質(zhì)量的影響

裝液量明顯影響繡球菌的菌種培養(yǎng)質(zhì)量（圖5）。在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，菌絲干重和菌球大小評(píng)分隨裝液量的增加呈先升后降的變化趨勢(shì)。當(dāng)裝液量為100 mL和125 mL時(shí)，菌絲干重分別為1.724± 0.023 g/L和1.697±0.027 g/L，兩者間差異不顯著，但均顯著大于其他處理；菌球大小評(píng)分則以裝液量為75 mL時(shí)最高，為3.61，顯著高于其他處理。綜合考慮菌球質(zhì)量與菌絲生物量，實(shí)際培養(yǎng)過(guò)程中宜選擇75 mL。

圖5 不同搖瓶裝液量繡球菌液體菌種的制備質(zhì)量

3 小結(jié)與討論

菌種生產(chǎn)是食用菌生產(chǎn)的首道工序，其重要性不言而喻。液體菌種有著固體菌種不可比擬的優(yōu)越性，是當(dāng)前食用菌行業(yè)研究應(yīng)用的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。目前我國(guó)已頒布實(shí)施的食用菌菌種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，只規(guī)定了固體菌種標(biāo)準(zhǔn)，尚無(wú)統(tǒng)一的檢測(cè)液體菌種活力的方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。建立以菌絲體干重、菌絲球大小和密度為指標(biāo)的液體菌種質(zhì)量檢測(cè)體系是液體菌種工廠化生產(chǎn)的發(fā)展態(tài)勢(shì)[12]。

在液體發(fā)酵過(guò)程中，絲狀真菌以絲狀、絮狀、塊狀、刺突狀及球狀等形態(tài)存在，培養(yǎng)條件是影響菌體形態(tài)的重要因素[13]。有學(xué)者認(rèn)為，球形菌體能使發(fā)酵液表現(xiàn)出較低的粘度，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的傳遞[14]。Carlsen等研究發(fā)現(xiàn)，較低pH（3.0～3.5）時(shí)，米曲霉（）主要以松散絲狀形態(tài)存在，而隨pH提高會(huì)出現(xiàn)球形菌體，當(dāng)pH大于6.0時(shí)，絲狀菌體全部消失，菌球逐漸變大[15]。合適的攪拌速度是菌絲球形成的必要條件之一，速度過(guò)低或過(guò)高會(huì)導(dǎo)致菌絲球直徑過(guò)大而松散，或降低菌絲體的成球速度甚至無(wú)法成球[16-17]。高轉(zhuǎn)速產(chǎn)生的剪切力通過(guò)切除菌球表面的刺突部分，抑制菌球直徑增大，使菌球變得光滑[18]。

繡球菌的工廠化生產(chǎn)雖已告成功，但一些問(wèn)題仍困擾其發(fā)展與壯大，如勞動(dòng)強(qiáng)度大、周期長(zhǎng)、制種工藝不成熟等[19]。而應(yīng)用液體菌種則能縮短栽培周期，提高菌種質(zhì)量，增加接種效率[20]。本研究根據(jù)菌絲干重與菌球大小評(píng)分得出，較合適的培養(yǎng)條件是培養(yǎng)時(shí)間12天，溫度26 ℃，轉(zhuǎn)速210 r/min，pH 3.5，裝液量75 mL。該條件下形成的菌絲球均勻細(xì)小，菌絲萌發(fā)點(diǎn)多，是良好的液體菌種材料。不過(guò)這一結(jié)果僅是單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)各因素間的交互影響如何，尚缺試驗(yàn)驗(yàn)證。

[1] 禹國(guó)龍, 葉琳, 苑世婷, 等. 繡球菌多糖的提取與抗氧化活性研究[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 19(4): 11-14.

[2] 王宏雨, 林勇, 林衍銓, 等. 繡球菌多糖研究進(jìn)展綜述[J]. 食藥用菌, 2016, 24(5): 281-284.

[3] 楚杰, 王瑩, 郝永任, 等. 繡球菌菌絲體多糖的抗氧活性[J]. 食用菌學(xué)報(bào), 2017, 24(4): 50-54.

[4] 楊亞茹, 郝正祺, 常明昌, 等. 繡球菌酸性多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及抗氧化活性研究[J]. 食用菌學(xué)報(bào), 2019, 26(3): 105-112.

[5] 李賀, 王相剛, 李艷芳, 等. 食用菌液體菌種生產(chǎn)研究進(jìn)展[J]. 園藝與種苗, 2012(6): 123-125.

[6] 王濤, 譚琦, 李玉, 等. 杏鮑菇液體菌種應(yīng)用工藝參數(shù)的優(yōu)化[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2019, 35(1): 33-37.

[7] 張勝友. 中國(guó)液體菌種生產(chǎn)新技術(shù)[M]. 武漢: 華中科技大學(xué)出版社, 2010.

[8] 董彩虹, 馬琪琪. 珍稀食用菌繡球菌研究進(jìn)展[J]. 菌物研究, 2014, 12(3): 172-177.

[9] 耿緣. 繡球菌栽培關(guān)鍵參數(shù)研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2017.

[10] 胡衛(wèi)紅. 茶樹(shù)菇不同配方的不同培養(yǎng)條件的研究[J]. 現(xiàn)代食品, 2019(5): 104-107.

[11] Liu Y S, Wu J Y. Effects of tween 80 and pH on mycelial pellets and exopolysaccharide production in liquid culture of a medicinal fungus[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2012, 39: 623-628.

[12] 許瀛引, 王勇, 彭衛(wèi)紅, 等. 六妹羊肚菌工廠化制備液體菌種繁育條件的優(yōu)化[J]. 菌物學(xué)報(bào), 2019, 38(6): 863-874.

[13] Kossen N W F. The morphology of filamentous fungi[J]. Adv Biochem Eng Biotechnol, 2000, 70: 31-33.

[14] Chain E, Gualandi G, Morisi G. Aeration studies: IV. Aeration conditions in 3000 litre submerged fermentations with various microorganisms[J]. Biotechnol Bioeng,1966(8): 595-619.

[15] Carlsen M, Spohr A B, Nielsen J, et al. Morphology and physiology of an alpha-amylase producing strain ofduring batch cultivations[J]. Biotechnol Bioeng, 1996, 49: 266-276.

[16] Tepwong P, Giri A, Ohshima T. Effect of mycelial morphology onergothioneine production during liquid fermentation of[J]. Mycoscierbce, 2012, 53: 102-112.

[17] Park J P, Kim Y M, Kim S W, et al. Effect of agitation intensity on the exobiopolymer production and mycelial morphology in[J]. Lett Appl Microbiol, 2002, 34(6): 433-438.

[18] YQ Cui，R. G. J. M. van der Lans，KCAM Luyben. Effects of agitation intensities on fungal morphology of submerged fermentation[J]. Biotechnol Bioengineering, 1997, 55(5): 715-726.

[19] 阮曉東, 阮時(shí)珍, 阮周禧, 等. 繡球菌栽培新技術(shù)[J]. 食藥用菌, 2014, 22(6): 343-345.

[20] 王忠艷, 陳艷秋, 張吉子, 等. 長(zhǎng)白山繡球菌菌絲營(yíng)養(yǎng)特性研究[J]. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 34(4): 319-323.

Effects of culture conditions on liquid spawn quality of

Tang Mingqiang1, 2Zheng Yongbin3Pan Siping1Huang Jie3

(1. School of Ocean and Biochemical Engineering, Fuqing Branch of Fujian Normal University, Fuqing, Fujian 350300, China; 2. Engineering Research Center of Modern Facility Agriculture of Fujian University, Fuqing, Fujian 350300, China; 3. Fujian Rongyi Medicinal Fungus Technology R. & D. Co., Ltd., Fuzhou, Fujian 350100, China)

To meet the purpose of liquid spawn application in large-scale edible mushroom production, taking dry weight of mycelial biomass and mycelial ball diameter score as response value, the study was carried out to optimize the effects of liquid culture conditions (incubation time, temperature, rotational speed, initial pH value and volume of medium in flask) on the quality ofliquid spawn. The results showed that the optimum quality of liquid spawn could be attained along with evenly small mycelial ball, high mycelial biomass and abundant development under the incubation conditions of incubation time 12 d , rotational speed 210 r/min, temperature 26 ℃, initial pH value 3.5, and the volume of medium 75 mL.

; liquid culture conditions; liquid spawn quality

S646

B

2095-0934（2021）04-313-05

福州市科技項(xiàng)目-星火項(xiàng)目“繡球菌液體發(fā)酵工藝優(yōu)化研究” {榕財(cái)教（指）[2019]52號(hào)}

湯鳴強(qiáng)（1966—），男，博士，教授，主要從事微生物科學(xué)技術(shù)研究。E-mail：mqt-1022@163.com。