孫琳琳, 張 璇, 石佳敏, 常學(xué)飛, 葉恭銀, 汪 芳

(浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院, 水稻生物學(xué)國家重點實驗室, 杭州 310058)

在自然界中，昆蟲通過接收寄主散發(fā)的化學(xué)物質(zhì)或者釋放及接收昆蟲信息素為自己選擇適宜的食物及繁殖場所，躲避和防御天敵，避免競爭或在競爭中戰(zhàn)勝對手(鄭衛(wèi)青等, 2014; 任炳忠等, 2017)。植食性昆蟲能夠利用寄主植物所釋放的化學(xué)信號來進行寄主定向。比如馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata易受馬鈴薯葉片氣味吸引；許多為害松樹的鞘翅目害蟲如天牛科、象甲科、小蠹蟲科及郭公甲科的昆蟲能被松樹氣味吸引，訪花昆蟲能被植物花散發(fā)的氣味吸引(Chénier and Philogène, 1989; 杜家緯, 2001; Haverkampetal., 2018)。昆蟲信息素對昆蟲的定向、召喚、交尾、產(chǎn)卵、聚集、追蹤、告警、防御以及種間識別等行為也具有重要的作用(鄭衛(wèi)青等, 2014; Albajes and Maderia, 2019)。利用信息化合物開發(fā)引誘劑、驅(qū)避劑等調(diào)控型農(nóng)藥，是害蟲綠色防控的重要發(fā)展方向，已成為害蟲綜合治理的重要措施之一(Albajes and Maderia, 2019)。蘋果醋、葡萄汁、梅子酒、酵母等被用于斑翅果蠅Drosophilasuzukii的監(jiān)測預(yù)報以及誘殺(Bianchietal., 2020; Chenetal., 2020; Papanastasiousetal., 2020)；昆蟲信息素也被廣泛應(yīng)用于蟲情監(jiān)測和誘殺，特別是鞘翅目、鱗翅目和襀翅目石蠅科的昆蟲(李詠玲等, 2010; Hanks and Millar, 2016; Villalobosetal., 2017; Seyboldetal., 2018; Hafsietal., 2019)。然而，不管是植物還是昆蟲釋放的信息化合物，大多都不是單一組分的化合物，而起作用的可能是其中的一種或幾種組分。例如對天?？破鹱饔玫乃蓸錃馕吨饕撬舍樔~揮發(fā)物中的單萜成分，包括α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯和莰烯等(Chénier and Philogène, 1989; Miller and Rabaglia, 2009)；桉樹精油對家蠅的驅(qū)避效應(yīng)可能是由于其中的單萜類物質(zhì)1,8-桉樹腦的作用(Tarellietal., 2009)；一些植物花中的芳樟醇對夜蛾科、菜蛾科和天蛾科的昆蟲具有吸引作用(Raguso, 2016; Heetal., 2019)。分離鑒定起主要作用的化合物組分是研究利用信息化合物的基礎(chǔ)。

篩選和鑒定對昆蟲有作用的揮發(fā)物組分的技術(shù)手段主要包括兩大類。一類是通過電生理技術(shù)測定昆蟲嗅覺感受器對氣味化合物的電反應(yīng)，從而在一系列的化學(xué)物質(zhì)中篩選有效化合物，稱為觸角電位技術(shù)；氣相色譜與觸角電位的聯(lián)用能快速準確地對未知信息化合物進行鑒定(張尚卿等, 2010)。但相對來說，氣相色譜-觸角電位聯(lián)用技術(shù)要求高，對一些小型昆蟲，取觸角、觸角與電位的連接等操作難度大。另一類是通過昆蟲的行為反應(yīng)來篩選和鑒定揮發(fā)物組分的，包括嗅覺儀和風(fēng)洞技術(shù)等。其中，風(fēng)洞試驗是一種模擬昆蟲田間飛行活動空間的物理模型，多用于測定鱗翅目昆蟲的行為反應(yīng)(周弘春和杜家緯, 2001)。Y型嗅覺儀是最早用于昆蟲嗅覺行為研究的技術(shù)手段(李源等, 2010; 王利華等, 2012; 徐蕾等, 2016)；四臂嗅覺儀近來被應(yīng)用于一些活動性較強的昆蟲的嗅覺行為分析(秦卓和康育光, 2014; 吳耀軍等, 2015)。

黑腹果蠅D.melanogaster是行為學(xué)研究常用的模式生物，其嗅覺行為研究常用的手段包括Y型嗅覺儀、四臂嗅覺儀、T型迷宮等，一些試驗以肉眼觀察人工計數(shù)，一些則采用商業(yè)化的軟件或自編的程序?qū)ο鄼C采集到的視頻進行分析(Stensmyretal., 2012; Linetal., 2015; Brownetal., 2019)。相較而言，人工觀察試驗會因人為因素對試驗結(jié)果產(chǎn)生一定的影響且數(shù)據(jù)不可再現(xiàn)。本研究將軌跡跟蹤分析系統(tǒng)與四臂嗅覺儀的結(jié)合，比較分析了氣流速度、味源設(shè)置等實驗條件對黑腹果蠅嗅覺反應(yīng)的影響，提出了更為精細的實驗技術(shù)體系，為其在其他小型昆蟲中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)；同時，我們也進行了多頭試驗與單頭試驗效果的比較，發(fā)現(xiàn)單頭試驗效果優(yōu)于多頭試驗。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

試驗所用黑腹果蠅D.melanogaster為實驗室人工飼料繼代飼養(yǎng)的W1118野生型品系，培養(yǎng)條件為:溫度25±1℃，相對濕度65%±1%，光周期12L∶12D。人工飼料配比：水1 000 mL，玉米粉82 g，綿白糖62 g，瓊脂粉6.2 g，丙酸5 mL，酵母粉2～5 g。選取羽化后3-7 d的雌成蟲進行實驗，在試驗前將果蠅保濕饑餓處理17～24 h。

1.2 儀器與試劑

市售發(fā)酵型蘋果醋飲料(山東煙臺綠杰股份有限公司)、吐溫-20[生工生物工程(上海)股份有限公司]、藍桉Eucalyptusglobulus葉油(澳大利亞慧凝有限公司)。用去離子水將吐溫-20稀釋成5%的水溶液，然后用5%吐溫-20溶液將藍桉葉油稀釋至5%, 1%, 0.2%, 0.04%和0.02% 5個濃度。

四臂嗅覺儀參考Vet等(1983)和Faucher等(2006)所描述的裝置在東莞市嘉城儀器公司定制，以聚四氟乙烯材料制成。行為測試區(qū)為13 cm×13 cm，高1.2 cm，內(nèi)部為四角星狀空間，底部中心有一個圓孔(直徑0.5 cm)用于釋放昆蟲和連接氣泵。其基本組成以及連接順序為：流量計→活性炭干燥塔→味源瓶→四臂嗅覺儀→抽氣泵(圖1: A)，各部分以硅膠管[TYGON LMT-55，圣戈班高功能塑料(上海)有限公司]相連，干燥塔(G.G.-17，250 mL，南京雪萊生物科技有限公司)內(nèi)裝有400 g柱狀活性炭(4.0 mm)。實驗前，硅膠管、味源瓶在75%乙醇中浸泡后用蒸餾水沖洗，四臂嗅覺儀內(nèi)腔用75%乙醇擦拭，于陰涼通風(fēng)處晾干。試驗時，四臂嗅覺儀置于自制試驗箱(80 cm×60 cm×88 cm)內(nèi)的毛玻璃臺上，毛玻璃下方設(shè)有LED光源(220 V, 50～60 Hz, 中山市八度照明有限公司)，攝像機(HDR-PJ610, SONY, 日本)固定于四臂嗅覺儀的正上方，用于錄制受試昆蟲在四臂嗅覺儀內(nèi)的行為反應(yīng)(圖1: B)。實驗時，試驗箱外用遮光布覆蓋，室內(nèi)溫度保持25±1℃。

圖1 四臂嗅覺儀連接示意圖(A)和試驗箱(B)

1.3 氣流速度的篩選及其對黑腹果蠅雌成蟲嗅覺行為的影響測定

無味源試驗：4個味源瓶中均加入20 mL去離子水，在四臂嗅覺儀中央接入1頭黑腹果蠅雌成蟲。采用負壓式氣泵(CAMSONAR SIM-4，北京卡索眾和科技有限公司)抽氣，利用流量計(CAMSONAR，北京卡索眾和科技有限公司)設(shè)置300, 600, 1 200和2 400 mL/min 4個進氣流速度，用攝像機錄制15 min內(nèi)黑腹果蠅在四臂嗅覺儀內(nèi)的行為反應(yīng)。每個氣流速度下錄制15頭黑腹果蠅雌成蟲的行為。

有味源試驗：在味源瓶中分別加入20 mL測試味源物溶液(蘋果醋或0.2%藍桉葉油)及相應(yīng)對照(去離子水或5%吐溫-20溶液)，其他操作方法同上所述。每個氣流速度下錄制15頭黑腹果蠅雌成蟲的行為。

為防止四臂嗅覺儀內(nèi)實際進入氣流的速度大小與流量計示數(shù)不符，實驗過程中，在味源瓶與四臂嗅覺儀之間接入另一流量計進行檢測，得到兩流量計示數(shù)相同?；钚蕴繉饬髯枇Φ挠绊懣珊雎圆挥嫛?/p>

1.4 味源設(shè)置對黑腹果蠅雌成蟲嗅覺行為的影響測定

單味源：在其中一臂對應(yīng)的味源瓶中加入20 mL味源物(蘋果醋或0.2%藍桉葉油)，其余3臂對應(yīng)的味源瓶加入等量的對照物(去離子水或5%吐溫-20溶液)。對角線味源：在四臂嗅覺儀對角線兩臂的味源瓶中各加入20 mL味源物(蘋果醋或0.2%藍桉葉油)，另一對角線的兩味源瓶內(nèi)加入等量的對照物(去離子水或5%吐溫-20溶液)。在四臂嗅覺儀中央接入1頭黑腹果蠅雌成蟲，氣流速度為300 mL/min，錄制并分析15 min內(nèi)黑腹果蠅的行為反應(yīng)。每種味源設(shè)置錄制15頭黑腹果蠅雌成蟲的行為。

1.5 味源物對黑腹果蠅雌成蟲多個體的行為效應(yīng)測定

按單味源設(shè)置在味源瓶中加入相應(yīng)的味源物或?qū)φ?，在四臂嗅覺儀中央接入10～12頭黑腹果蠅雌成蟲，氣流速度為300 mL/min，錄制并分析40 min內(nèi)黑腹果蠅的行為反應(yīng)。每個味源物設(shè)置5組重復(fù)。

1.6 不同濃度藍桉葉油對黑腹果蠅雌成蟲的驅(qū)避效應(yīng)測定

在一個味源瓶加入20 mL藍桉葉油(5%, 1%, 0.2%, 0.04%和0.02%)，其余3個味源瓶加入等量的5%吐溫-20溶液。在四臂嗅覺儀中央接入 1頭黑腹果蠅雌成蟲，氣流速度為300 mL/min，錄制15 min內(nèi)果蠅的行為反應(yīng)，每個濃度設(shè)置15次重復(fù)。

以上所有試驗操作在每次試驗結(jié)束后，將嗅覺儀旋轉(zhuǎn)90°，并用75%乙醇擦拭四臂嗅覺儀內(nèi)腔；每錄制2次視頻，更換味源物質(zhì)以及味源臂位置。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Ethovision XT軟件[諾達思(北京)信息技術(shù)有限公司]對黑腹果蠅的行為反應(yīng)進行分析，包括其在四臂嗅覺儀各區(qū)域內(nèi)的累計停留時間及平均速度。單頭試驗取接蟲后5-15 min的視頻分析黑腹果蠅對味源物的行為反應(yīng)，多頭試驗取接蟲后5-35 min的視頻進行分析，0-5 min內(nèi)幾乎不動的個體(移動速度低于0.02 cm/s)視為無行為反應(yīng)個體被排除；軟件捕獲的四臂嗅覺儀各區(qū)域停留總時長小于分析總時長(單頭試驗，600 s；多頭試驗，1 800 s)的80%的個體作為無效分析個體被排除。無味源物的氣流速度試驗采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及Tukey氏多重比較來分析黑腹果蠅在各區(qū)域內(nèi)停留時長的差異。有味源物的單頭試驗采用t測驗比較味源臂區(qū)域與對照區(qū)域黑腹果蠅停留時長的差異顯著性。多頭試驗采用卡方分析每組中被吸引/驅(qū)避的個體數(shù)與無吸引/驅(qū)避的個體數(shù)的差異。引誘指數(shù)(attraction index,AI)的計算參考Lin等(2015)所描述的方法，具體公式如下所示。味源設(shè)置、試驗個體數(shù)對AI的影響采用t檢驗進行分析，氣流速度、味源物濃度對AI的影響采用單因素方差分析及Tukey氏多重比較來分析各處理下AI的差異。數(shù)據(jù)均采用DPS軟件(version 18.10)進行分析，百分比數(shù)據(jù)在分析時進行反正弦轉(zhuǎn)換。

引誘指數(shù)(AI)=

2 結(jié)果

2.1 最適氣流速度的篩選

在嗅覺儀的四臂均通入經(jīng)活性炭過濾的潔凈空氣，4個氣流速度下黑腹果蠅雌成蟲在嗅覺儀各區(qū)域的停留時間如圖2所示。在300, 600, 1 200和2 400 mL/min4個氣流速度下，黑腹果蠅雌成蟲在4個區(qū)域內(nèi)的停留時長均無顯著性差異(P>0.05)(圖2: B-E)，表明實驗體系對黑腹果蠅雌成蟲的行為無影響。對4個氣流速度下黑腹果蠅雌成蟲的平均運動速度進行分析發(fā)現(xiàn)：當(dāng)氣流速度為300 mL/min時，黑腹果蠅雌成蟲不同個體間的運動速度最為均一(圖2: F)，因此認為300 mL/min是最適氣流速度并用于后續(xù)試驗。

圖2 不同氣流速度下黑腹果蠅雌成蟲在四臂嗅覺儀內(nèi)的行為反應(yīng)

2.2 味源設(shè)置對蘋果醋引誘效果的影響

我們比較了單一臂放置和對角線兩臂放置蘋果醋味源對黑腹果蠅雌成蟲引誘效果的影響，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)單一臂放置蘋果醋味源時，黑腹果蠅雌成蟲在蘋果醋味源區(qū)域的停留時長占比為52.80%，約為對照區(qū)域的停留時長占比(13.18%)的4倍(P<0.01)(圖3: A)；而當(dāng)對角線放置蘋果醋味源時，黑腹果蠅雌成蟲在蘋果醋味源和對照區(qū)域的停留時長占比分別為32.49%和15.01%(P<0.01)(圖3: B)。兩種味源放置下，蘋果醋對黑腹果蠅雌成蟲均有顯著的吸引效果，味源放置方式對引誘指數(shù)AI無顯著影響(P=0.18)(圖3: C)；但與對角線兩臂放置蘋果醋味源相比，單一臂放置蘋果醋味源的實驗效果更佳。

圖3 味源放置方式對蘋果醋(AV)引誘黑腹果蠅雌成蟲效果的影響

2.3 氣流速度對蘋果醋引誘效果的影響

在4個氣流速度下，蘋果醋對黑腹果蠅雌成蟲均有顯著的吸引作用(P<0.05)(圖4: A)。在氣流速度為300，600，1 200和2 400 mL/min時，果蠅在蘋果醋味源區(qū)域的停留時長占比分別為66.12%(n=14), 54.53%(n=13), 76.28%(n=11)和49.23%(n=14)。氣流速度對蘋果醋的引誘指數(shù)AI有顯著的影響(P=0.033)(圖4: B)；在氣流速度為1 200 mL/min時，蘋果醋的AI最高，顯著高于氣流速度為2 400 mL/min時的AI，但與氣流速度為300和600 mL/min時的AI無顯著差異(P>0.05)。然而，氣流速度為1 200 mL/min時，無效個體數(shù)較多(26.7%)。

圖4 氣流速度對蘋果醋引誘黑腹果蠅雌成蟲效果的影響

2.4 蘋果醋對黑腹果蠅雌成蟲多個體的吸引效應(yīng)

考慮到如果能同時對黑腹果蠅雌成蟲多個體進行測試，將大大節(jié)省試驗時間，因此進行了蘋果醋對黑腹果蠅雌成蟲多個體的吸引效果試驗。每組試驗接入10頭黑腹果蠅雌成蟲，利用軟件追蹤每頭雌成蟲在四臂嗅覺儀在各區(qū)域內(nèi)的活動情況；將AI大于0.2(即在蘋果醋味源區(qū)域的停留時長占比大于30%)的雌成蟲定義為被吸引個體，AI為-0.2～0.2之間的為無響應(yīng)個體，小于-0.2的為被驅(qū)避個體，統(tǒng)計每組試驗中各類別的個體數(shù)。5組試驗的有效個體總數(shù)為41頭，其中被蘋果醋吸引的雌成蟲為28頭，無響應(yīng)的雌成蟲13頭，被驅(qū)避的0頭，平均AI為0.42，蘋果醋對黑腹果蠅雌成蟲有吸引效果(χ2=4.78,P=0.028)。但就每組單獨來看，被蘋果醋吸引的黑腹果蠅雌成蟲數(shù)占有效個體總數(shù)的50.0%～87.5%，并不是每組試驗都有顯著的吸引效果(圖5)。

圖5 蘋果醋對黑腹果蠅雌成蟲多個體的引誘效果

2.5 不同濃度藍桉葉油對黑腹果蠅雌成蟲的驅(qū)避效應(yīng)

已有報道表明藍桉葉油對家蠅具有驅(qū)避、毒殺幼蟲和蛹的特性(Abdel Halim and Morsy, 2005)。我們測試了不同濃度藍桉葉油對黑腹果蠅雌成蟲的驅(qū)避效應(yīng)。當(dāng)味源臂為5%, 1%, 0.2%和0.04%藍桉葉油時，黑腹果蠅雌成蟲在對照區(qū)域的停留時長占比顯著高于在味源臂區(qū)域的停留時長占比(P<0.01)(圖6: A-D)，4種濃度藍桉葉油對黑腹果蠅雌成蟲均有顯著的驅(qū)避作用。而當(dāng)藍桉葉油濃度降為0.02%時，黑腹果蠅雌成蟲在味源臂區(qū)域內(nèi)的停留時長與對照區(qū)域無顯著差異(P=0.193)(圖6: E)。濃度對藍桉葉油的驅(qū)避效應(yīng)有顯著的影響(P=0.056)，0.2%藍桉葉油對黑腹果蠅雌成蟲驅(qū)避效果最佳，與濃度為0.02%的藍桉葉油存在顯著的差異(P<0.05)，與其他濃度的AI差異不顯著(P>0.05)(圖6: F)。

圖6 不同濃度藍桉葉油對黑腹果蠅雌成蟲的驅(qū)避效應(yīng)

2.6 味源放置對藍桉葉油驅(qū)避效果的影響

在單一臂和對角線放置味源時，0.2%的藍桉葉油對黑腹果蠅雌成蟲均有顯著的驅(qū)避效應(yīng)(P<0.01)(圖7: A, B)。黑腹果蠅雌成蟲在對照區(qū)域的停留時長占比(單一臂33.26%，對角線41.04%)均顯著高于在味源區(qū)域的停留時長占比(單一臂0.21%，對角線7.28%)。但單一臂放置藍桉葉油味源物比對角線放置味源對黑腹果蠅雌成蟲的驅(qū)避效應(yīng)更好(AI的絕對值越高，驅(qū)避效應(yīng)越好)，味源物的設(shè)置對藍桉葉油的驅(qū)避效果有顯著的影響(P=0.013)(圖7: C)。

圖7 味源放置方式對藍桉葉油(EO)對黑腹果蠅雌成蟲驅(qū)避效果的影響

2.7 氣流速度對藍桉葉油驅(qū)避效果的影響

當(dāng)氣流速度為300, 600和1 200 mL/min時，0.2%的藍桉葉油對黑腹果蠅雌成蟲均有顯著的驅(qū)避效應(yīng)(P<0.01)，黑腹果蠅在味源臂區(qū)域的停留時長占比為0.29%～3.52%，在對照區(qū)域的停留時長為32.16%～33.23%(圖8: A)。但是當(dāng)氣流速度為2 400 mL/min時，黑腹果蠅雌成蟲在藍桉葉油處理區(qū)域的停留時長占比與對照區(qū)域差異不顯著(P>0.05)。氣流速度對藍桉葉油的AI影響不顯著(P=0.076)(圖8: B)。

圖8 氣流速度對藍桉葉油驅(qū)避黑腹果蠅雌成蟲效果的影響

2.8 0.2%藍桉葉油對黑腹果蠅雌成蟲多個體的驅(qū)避效應(yīng)

對每組12頭受試黑腹果蠅雌成蟲的行為進行分析發(fā)現(xiàn)，5組試驗的有效個體總數(shù)為55頭，其中有驅(qū)避效應(yīng)的個體數(shù)為48頭(AI<-0.2，即在藍桉葉油味源區(qū)域的停留時長占比小于30%)，無響應(yīng)的個體數(shù)為7頭(-0.20.2)；平均AI為-0.68，表明藍桉葉油對黑腹果蠅雌成蟲有驅(qū)避效果(χ2=54.08,P<0.001)；每組試驗中被驅(qū)避的黑腹果蠅雌成蟲數(shù)占總數(shù)的比例均極顯著高于無響應(yīng)的個體(P<0.01)(圖9)。但與單頭試驗(AI=-0.99)相比，藍桉葉油對同時多頭黑腹果蠅的驅(qū)避效應(yīng)顯著下降(P=0.014)，黑腹果蠅在藍桉葉油味源區(qū)域內(nèi)的平均停留時長占比增加(7.69%)，驅(qū)避效果相對降低。

圖9 藍桉葉油對黑腹果蠅雌成蟲多個體的驅(qū)避效果

3 討論

果蠅種類多、分布廣、繁殖力強，黑腹果蠅和斑翅果蠅作為果蠅中的優(yōu)勢種，是葡萄、櫻桃、草莓、藍莓、楊梅等具有較高經(jīng)濟價值的水果上的主要害蟲(趙超等, 2017; 高歡歡等, 2018; 代曉彥等, 2019; 王知知等, 2020)。防治果蠅最有效的方法是噴施殺蟲劑，但是長期使用化學(xué)殺蟲劑對環(huán)境和人畜都易產(chǎn)生不良的影響，還會導(dǎo)致果蠅抗藥性倍增。因此生產(chǎn)上都結(jié)合誘殺、“衛(wèi)生”栽培、天敵昆蟲和病原微生物的生物防治等手段進行綜合防治(黃貞光等, 2017; 代曉彥等, 2019; 吳玉新等, 2020)。本研究以黑腹果蠅為試驗對象，結(jié)合四臂嗅覺儀與軌跡跟蹤分析系統(tǒng)建立了昆蟲嗅覺行為分析體系。利用已報道的對黑腹果蠅有吸引和驅(qū)避的化合物驗證了實驗體系的可靠性；同時，比較分析了氣流速度、味源設(shè)置等實驗條件對黑腹果蠅嗅覺反應(yīng)的影響，提出了更為精細的實驗技術(shù)體系，為昆蟲信息化合物有效成分的篩選提供了技術(shù)支持。

嗅覺儀被廣泛應(yīng)用于昆蟲的嗅覺行為分析，四臂嗅覺儀已被應(yīng)用于果蠅、赤眼蜂、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella、柑橘木虱Diaphrinacitri、桉樹枝癭姬小蜂Leptocybeinvasa、韭菜遲眼蕈蚊Bradysiaodoriphaga等昆蟲的嗅覺行為研究。大多數(shù)已有的報道是通過人為觀察來分析昆蟲的行為反應(yīng)的，通過統(tǒng)計各區(qū)域內(nèi)(停留2/4 min以上計1頭)或?qū)?yīng)收集瓶內(nèi)的試蟲數(shù)量來分析味源的引誘或驅(qū)避效應(yīng)(馬濤等, 2013; 吳耀軍等, 2015; 徐蕾等, 2016)。有少部分研究是采用自己編寫或改進的程序來分析統(tǒng)計受試昆蟲進入各區(qū)域的次數(shù)及停留時間(岑伊靜等, 2005; 呂燕青等, 2006; Linetal., 2015)，但是試驗條件各不相同，有單頭試驗的、群體試驗的；有單一臂放置味源，也有對角線設(shè)置味源的。本研究采用的Ethovision XT軌跡跟蹤軟件原本是針對小鼠等小型動物設(shè)計的，目前已被應(yīng)用于黑尾葉蟬Nephotettixcincticeps、舞毒蛾Lymantriadispar和丹溶腔繭蜂Lytopylusrufipes等昆蟲行為的研究(Eberletal., 2018; Wangetal., 2018; Liuetal., 2019)。由于軟件是靠灰度識別對個體進行跟蹤的，一些昆蟲的體色與灰色接近，因此在識別過程中可能會出現(xiàn)部分時間段的跟蹤丟失。試驗時，將軟件捕捉到的時間占視頻錄制總時間80%以上的作為有效個體，可考慮通過調(diào)整光源來改變昆蟲的灰度，從而達到更好的分析效果。

昆蟲個體大小不同，適應(yīng)的氣流速度也不相同，如赤眼蜂適用的氣流速度為100 mL/min，小菜蛾、柑橘木虱等適用氣流速度為200 mL/min，韭菜遲眼蕈蚊適用氣流速度300 mL/min，桉樹枝癭姬小蜂600 mL/min(何衍彪等, 2004; 呂燕青等, 2006; 吳耀軍等, 2015; 徐蕾等, 2016)。因此，需根據(jù)受試昆蟲本身來確定最適氣流速度?？梢圆捎脽熿F在嗅覺儀內(nèi)4個區(qū)域是否有明顯的界限或氣流速度對受試昆蟲的行為是否產(chǎn)生影響來確定最適氣流速度(段立清等, 2005)。我們的結(jié)果表明，無味源時，在4個不同的氣流速度下，黑腹果蠅在嗅覺儀內(nèi)4個區(qū)域的停留時長均無顯著差異；氣流速度對蘋果醋的引誘效果有顯著的影響，當(dāng)氣流速度為2 400 mL/min時，蘋果醋對黑腹果蠅的引誘指數(shù)顯著下降(圖4: A, B)，藍桉葉油對黑腹果蠅也無驅(qū)避效應(yīng)(圖8: B)。因此認為適合于黑腹果蠅嗅覺行為的分析的氣流速度為300～1 200 mL/min，氣流流速過大可能會導(dǎo)致味源在個區(qū)域擴散，從而對受試昆蟲的行為產(chǎn)生干擾。考慮到氣流速度為300 mL/min時，不同黑腹果蠅個體間活動速度的差異較小，推薦氣流速度設(shè)置為300 mL/min。

為了分析味源設(shè)置、受試昆蟲數(shù)量是否會對實驗產(chǎn)生影響，我們比較了單一味源和對角線味源，單頭測試和多頭測試條件下的黑腹果蠅行為反應(yīng)。在兩種味源設(shè)置下，蘋果醋對黑腹果蠅均有顯著的吸引效果，味源設(shè)置方式對其引誘指數(shù)無顯著影響，但單一臂放置蘋果醋味源時，實驗效果更為明顯(圖3)。兩種味源設(shè)置下，藍桉葉油對黑腹果蠅均有顯著的驅(qū)避效應(yīng)，味源設(shè)置方式對藍桉葉油的驅(qū)避效果有顯著影響，單一臂設(shè)置味源時，藍桉葉油的驅(qū)避效應(yīng)顯著優(yōu)于對角線放置味源(圖6)。我們的結(jié)果表明，無論是有吸引效果的還是有驅(qū)避效果的味源物，單一臂設(shè)置味源的實驗效果更好。不同受試昆蟲數(shù)量的試驗結(jié)果表明，不論是蘋果醋吸引試驗還是藍桉葉油驅(qū)避試驗，單頭測試的實驗效果顯著優(yōu)于多頭測試。在多頭試驗中，雖然最終還是能得出相同的結(jié)論，但有可能不同組別的試驗結(jié)果存在一定的差異。如蘋果醋試驗中，就有其中兩組的實驗結(jié)果表明黑腹果蠅對蘋果醋無明顯的行為反應(yīng)(圖5)。因此我們認為，鑒別某種化合物組分對受試昆蟲的行為是否存在效應(yīng)，最可靠的是逐頭進行測試；多頭測試可用于對化合物的初步篩選。

本研究利用已知的效應(yīng)味源物對四臂嗅覺儀行為試驗體系最優(yōu)條件進行了探索，結(jié)果表明對于某種化合物吸引或驅(qū)避效應(yīng)的鑒別來說，在合適的氣流條件下，單一臂設(shè)置味源物逐頭測試受試昆蟲，可得到最優(yōu)的試驗效果；多頭試驗盡管試驗效果沒有單頭測試好，但可用于化合物的初篩試驗。本研究所建立分析體系可用于昆蟲信息化合物有效成分的篩選和效應(yīng)鑒定，在降低人力成本的同時，保證了實驗結(jié)果的可靠性，為農(nóng)業(yè)害蟲的預(yù)測預(yù)報、生物防治以及衛(wèi)生害蟲的防控提供技術(shù)支持。