喬 恒, 李 慧, 耿薏舒, 趙旭東, 于曉航, 郝德君,*

(1.南京林業(yè)大學南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心, 南京 210037; 2.南京林業(yè)大學林學院, 南京 210037)

美國白蛾Hyphantriacunea屬鱗翅目(Lepidoptera)燈蛾科(Arctiidae)，是一種寄主范圍廣、繁殖力強、適生性強、危害嚴重的世界性檢疫害蟲(季榮等, 2003)。自1979年首次在我國遼寧省丹東地區(qū)發(fā)現(xiàn)以來，至2019年已經(jīng)擴散至北京、天津、河北、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、江蘇、安徽、山東、湖北、河南、湖北、陜西共13個省(區(qū)、市)的近600個縣級行政區(qū)(國家林業(yè)和草原局2020年第3號公告)，對我國的林木資源及相關產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

昆蟲在長期外界溫度脅迫下，進化出復雜而多樣的行為、生理生化及分子機制去抵御外界不利的溫度(Maetal., 2021)，其中熱激蛋白(heat shock protein, HSP)在昆蟲體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用。熱激蛋白又稱熱休克蛋白，是一種物種間和進化上均高度保守的蛋白質(zhì)(王宇萍和蔣建東, 2010)。當生物體遭遇極端溫度、饑餓脅迫、氧化脅迫、重金屬脅迫時，會優(yōu)先轉錄該蛋白，引導其他蛋白質(zhì)的正確折疊，幫助生物體抵御不良環(huán)境(Zhao and Jones, 2012)。關于熱激蛋白的分類，不同的學者有不同的分類方式，但普遍采納根據(jù)蛋白分子量大小將HSP分為以下5個家族：HSP110, HSP90, HSP70, HSP60和sHSP(Watersetal., 1996)。其中HSP70作為熱激蛋白家族的重要組成部分，一直備受國內(nèi)外關注。研究發(fā)現(xiàn)，熱激蛋白70家族主要包括誘導型熱激蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)和組成型熱激蛋白70(heat shock cognate protein 70, HSC70)兩種類型(Simoncellietal., 2010)。HSP70序列由N端保守的ATPase功能域及C端的底物結合功能域構成(Flahertyetal., 1990)。N端的ATPase功能域可水解ATP，C端的底物結合功能域可與未折疊的多肽底物暴露在外的疏水區(qū)域特異性相結合(Kangetal., 1990; Nelsonetal., 1992)。許多學者分別對煙草天蛾Manducasexta(Marinetal., 1994)、二化螟Chilosuppressalis(崔亞東等, 2010)、舞毒蛾Lymantriadispar(Whyardetal., 1986)、粉紋夜蛾Trichoplusiani(Seversonetal., 2005)和葉色草蛉Chrysopaphyllochroma(劉璐, 2014)等昆蟲的HSP70基因序列進行克隆，并發(fā)現(xiàn)其在抵御高溫脅迫中發(fā)揮重要作用。楊廣生等(2020)基于基因組數(shù)據(jù)，篩選了4條美國白蛾HSP70基因，并推測其中一條基因在水解ATP中發(fā)揮著重要作用，但未闡明HSP70基因在美國白蛾高溫脅迫響應中的功能。

在我國，美國白蛾呈現(xiàn)不斷向南擴散的趨勢，而在南方地區(qū)，夏季溫度常達35～40℃(中國天氣網(wǎng)http:∥www.weather.com.cn/)。由此可見，美國白蛾在擴散的過程中，不可避免地遭受高溫脅迫，而目前關于美國白蛾高溫脅迫響應的分子機制研究尚屬空白。因此，本研究以美國白蛾HSP70基因為研究對象，通過基因克隆、高溫脅迫下的表達特性分析、原核表達及純化及ATPase活性測定等技術，探究HSP70基因在美國白蛾高溫脅迫響應中的功能，為美國白蛾發(fā)生區(qū)域的預測預報及其他昆蟲HSP的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

美國白蛾幼蟲于2019年6月采自江蘇省淮安市楚州區(qū)古城墻遺址公園(33.62°N, 119.02°E)，帶回實驗室后利用人工飼料進行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為：溫度26±1℃，相對濕度65%±5%，光周期16L∶8D。成蟲羽化后，提供30%蜂蜜水。以室內(nèi)飼養(yǎng)的第2代4齡幼蟲作為實驗用蟲。

選取新蛻皮的美國白蛾4齡第2天幼蟲，分別在25(對照), 30, 35和40℃下處理1, 2和3 h，每3頭幼蟲混合作為一個樣本，每個處理均進行3次生物學重復。所有的樣本均用1.5 mL的無核酶離心管保存，轉至液氮中速凍，再置于-80℃冰箱中保存用于后續(xù)RNA提取及相關實驗。

1.2 美國白蛾總RNA的提取和cDNA的合成

利用Trizol法提取1.1節(jié)中保存樣本的總RNA，通過微量紫外分光光度儀(NanoDrop ND-2000, Thermo, 美國)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量和濃度。選擇凝膠電泳條帶清晰明亮且OD260/OD280值在1.8～2.0之間的mRNA樣品，按照反轉錄試劑盒HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase(Vazyme, 南京)的步驟，合成cDNA模板。

1.3 美國白蛾熱激蛋白70基因的克隆

基于美國白蛾轉錄組數(shù)據(jù)庫(本實驗室構建，未發(fā)表)，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物HSP70-F1/HSP70-R1和HSC70-F1/HSC70-R1(表1)，引物由南京金斯瑞生物公司合成。以1.2節(jié)中合成的美國白蛾4齡幼蟲cDNA為模板，利用LA Taq聚合酶(TaKaRa, 大連)進行PCR擴增。PCR反應體系(50 μL): dNTP Mix(2.5 mmol/L)8 μL, 10×PCR Buffer 5 μL, Mg2+(25 mmol/L)5 μL, 上下游引物(10 pmol/L)各1 μL, cDNA模板(500 μg/μL)1 μL, LA Taq(5 U/μL)0.5 μL, ddH2O 28.5 μL。PCR反應條件: 95℃ 3 min; 98℃ 10 s, 50℃ 15 s, 72℃ 2 min，循環(huán)35次; 72℃ 10 min。PCR擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且通過DNA回收試劑盒(TIANGEN, 北京)純化，連接至T/A Blunt Vector載體后，導入大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞(Vazyme, 南京)，在含有氨芐青霉素的LB瓊脂板上過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆于LB液體培養(yǎng)基中37℃ 200 r/min孵育2 h，再進行菌液PCR鑒定。將驗證正確的菌液送至杰李(上海)生物技術公司測序。

1.4 生物學信息學分析

利用分子生物學軟件DNAMAN8.0進行序列的對比和拼接，信號肽預測利用SignalP在線網(wǎng)站(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)，等電點及分子質(zhì)量預測利用在線網(wǎng)站(https:∥web.expasy.org/protparam/)，蛋白三維結構預測利用在線網(wǎng)站SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/)。利用在線工具NCBI(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索鱗翅目中已知昆蟲的熱激蛋白70基因序列，利用Clustalx軟件進行序列對比，同源搜索鱗翅目、鞘翅目、半翅目、膜翅目、雙翅目共5個目41種的HSP70和HSC70氨基酸序列，用MEGA 7.0軟件結合鄰接法(neighbor-joining method, NJ)進行1 000次抽樣分析來構建進化樹，并用在線軟件iTOL(https:∥itol.embl.de/)進行修飾。

1.5 qPCR檢測

本實驗選擇EF1α作為美國白蛾4齡幼蟲不同溫度處理下基因表達分析的內(nèi)參基因(陶蓉等, 2019)，內(nèi)參基因的擴增引物為EF1α-F/EF1α-R(表1)。根據(jù)1.3節(jié)中克隆獲得的HSP70基因序列，利用在線網(wǎng)站(https:∥www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool)設計并篩選qPCR引物HSP70-qF/HSP70-qR和HSC70-qF/HSC70-qR(表1)。qPCR反應在Applied Biosystem 7500 System(Thermo Fisher Scientific, 美國)上進行，反應體系(20 μL): SYBR Green Master Mix(YEASEN, 上海)10 μL, 上下游引物(10 pmol/L)各0.4 μL, cDNA模板2 μL, RNase-free H2O 7.2 μL。反應程序: 95℃ 5 min; 95℃ 10 s, 60℃ 40 s，循環(huán)40次; 95℃ 15 s, 60℃ 60 s, 95℃ 15 s形成溶解曲線。每個樣品設置3個生物學重復及3個技術重復。

1.6 美國白蛾熱激蛋白70的重組表達與純化

利用CE Design軟件(Vazyme, 南京)設計美國白蛾熱激蛋白70基因序列的原核表達引物(HSP70-tPCR-F和HSP70-tPCR-R, 表1)，引物包含NheⅠ和BamHⅠ酶切位點。同1.3節(jié)中操作步驟，引物更換為HSP70-tPCR-F和HSP70-tPCR-R，獲得原核表達的DNA模板，隨后將其與線性化的pET-28a載體通過ClonExpress II一步克隆試劑盒(Vazyme, 南京)同源連接，并轉入到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在含有卡那霉素的LB瓊脂板上過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆進行菌液PCR，送至杰李(上海)生物技術公司測序。

表1 本研究所用引物

測序正確的質(zhì)粒轉入到大腸桿菌BL21(Vazyme, 南京)感受態(tài)細胞中進行蛋白表達。次日挑選單克隆將其轉移至含卡那霉素(30 μg/mL)的100 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，然后孵育至OD600=0.5，將異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(Sango, 上海)添加至最終濃度為1 mmol/L，并在30℃ 200 r/min條件下過夜孵育12 h。在4℃ 11 000 r/min離心15 min得到菌液沉淀，并加入平衡緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4和Na2HPO4, 300 mmol/L NaCl, 20 mmol/L咪唑, pH 7.9)，攪拌并通過在冰水中超聲處理破壞混合物。在4℃ 12 000 r/min離心20 min后，獲得上清。重組蛋白通過His60 Ni Superflow樹脂和重力柱(TaKaRa, 北京)純化，純化的重組蛋白用7.5% SDS-PAGE凝膠分析。

1.7 免疫印跡分析

以1.6節(jié)純化的HcHSP70蛋白作為抗原，取20 μL蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉移至0.45 μm的PVDF膜。用5%脫脂奶粉溶液封閉，將膜置于含His-tag抗體(Beyotime, 上海)的一抗孵育液中4℃孵育過夜，用TBST緩沖液洗膜，然后將膜轉入含有辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔IgG的二抗孵育液(Beyotime, 上海)中，室溫輕搖孵育1～2 h，洗膜后將膜置于West Pico ECL(Biosharp, 武漢)顯色拍照。

1.8 美國白蛾熱激蛋白70的酶活性測定

采用Zhang等(2018)的方法測定熱激蛋白70的酶活性。配制100 μL反應體系，包含2.0 μg HcHSP70/BSA/ddH2O, 1.0 mmol/L Bistris, 1.0 mmol/L KCl, 0.1 mmol/L MgCl2和0.01 mmol/L ATP，其中添加BSA/ddH2O為對照。將反應混合物在25, 30, 35和40℃下孵育10 min后，加入10 μL 55% HClO4終止反應。將混合物放置冰上10 min，然后以12 000 r/min 離心3 min。最后，用微量組織無機磷含量測定試劑盒(Solarbio, 北京)確定無機磷的濃度。熱激蛋白70的酶活性定義為1 min內(nèi)1 mg HcHSP70催化的無機磷的產(chǎn)生量(μmol/min·mg)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

利用IBM SPSS Statistics 20軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用單因素分析法中的Duncan氏多重檢驗法對高溫處理下美國白蛾熱激蛋白70基因相對表達量及不同溫度下HcHSP70重組蛋白的ATP酶活性進行差異顯著性分析，差異顯著水平為P<0.05。

2 結果

2.1 美國白蛾HSP70基因的克隆以及序列

克隆獲得美國白蛾2條HSP70基因HcHSP70(GenBank登錄號: MT995848)和HcHSC70(GenBank登錄號: MT261583)，其ORF長度分別為1 917和2 061 bp，分別編碼637和687個氨基酸，分子質(zhì)量分別約為69.66和74.96 kD，等電點分別為5.90和5.96。HcHSP70與HcHSC70氨基酸序列中存在HSP70家族中3個高度保守的區(qū)域GIDLGTTYS, IFDLGGGTFDVSIL和VGGSTRIPKVQ。并具有由AEAYLGKS組成的ATP-GTP結合位點及由PRALRRLRTAAERAKRTL組成的核定位信號標簽和非細胞器基序RARFEEL的3個典型特征也高度保守(圖1)。亞細胞定位預測HcHSP70位于細胞質(zhì)中，HcHSC70位于線粒體中。

圖1 美國白蛾HcHSP70和HcHSC70與其他鱗翅目昆蟲HSP70氨基酸序列對比

利用SWISS-MODEL工具建模，HcHSP70與模板的一致性為53.86%，HcHSC70與模板的一致性為62.27%。預測的美國白蛾HcHSP70和HcHSC70蛋白的三維結構與其他物種熱激蛋白70的三維結構高度相似。如圖2所示，HcHSP70和HcHSC70的三維結構均是由N端ATPase功能域和C端底物結合功能域所組成。

圖2 美國白蛾HcHSC70(A)和HcHSP70(B)的SWISS-MODEL三維結構預測模型

如圖3系統(tǒng)進化樹所示：HcHSP70和HcHSC70分別屬于兩個分支，HcHSP70與鱗翅目HSP70家族的其他成員聚為一支，HcHSC70與鱗翅目HSC70家族的其他成員聚為另一支。此外，鞘翅目、半翅目、膜翅目及雙翅目各目的熱激蛋白70序列同樣分為HSP70及HSC70兩個分支。

圖3 鄰接法構建的基于氨基酸序列的美國白蛾和其他昆蟲HSP70系統(tǒng)進化樹(1 000次重復)

2.2 高溫脅迫下美國白蛾熱激蛋白70基因的相對表達量

從圖4(A)中可以看出，美國白蛾4齡幼蟲在30, 35和40℃下分別處理1, 2和3 h,HcHSP70的表達量與對照(25℃)相比顯著上調(diào)：在1 h時，隨著溫度的升高，HcHSP70基因的相對表達量持續(xù)上升；在35℃ 2 h時，相對表達量達到峰值，約為對照組的183.70倍；但在35和40℃處理3 h時，相對表達量與對照相比則無顯著性差異(P>0.05)。

由圖4(B)可知，與對照組(25℃)相比，HcHSC70在每個溫度梯度、不同時間的相對表達量與對照相比無顯著性差異，如在40℃下3 h時相對表達量最高，為對照組的4.76倍，但與對照相比無顯著性差異(P>0.05)。

圖4 高溫處理不同時間后美國白蛾4齡第2天幼蟲中HcHSP70(A)和HcHSC70(B)的相對表達量

2.3 美國白蛾熱激蛋白70的重組表達與純化

HcHSP70重組質(zhì)粒轉入BL21表達感受態(tài)細胞中的表達產(chǎn)物通過SDS-PAGE分析表明，在69.66 kD處檢測到一條明顯的誘導表達蛋白條帶，而pET-28a空載體則無相應的條帶，這與預測的分子量大小一致(圖5)。使用Ni2+-His柱進一步純化可溶性重組蛋白，并且純化的HcHSP70的濃度為1.7 mg/mL。通過重組蛋白HcHSP70與His-tag抗體發(fā)生特異性反應，表明HcHSP70基因已經(jīng)在大腸桿菌表達系統(tǒng)中正確表達。

圖5 重組蛋白HcHSP70的SDS-PAGE分析

2.4 高溫下HcHSP70蛋白的ATPase活性

在25, 30, 35和40℃的溫度下測定純化的HcHSP70的ATPase活性分別為27.3039, 25.5823, 23.8551和26.2028 μmol/min·mg pro，高于BSA/ddH2O對照組的活性(圖6)。而且，隨著溫度的升高，HcHSP70蛋白的ATPase活性在不同溫度處理之間無顯著性差異(P>0.05)。

3 討論

本研究利用PCR技術首次在美國白蛾中克隆出2條熱激蛋白70家族基因的cDNA序列，分別命名為HcHSP70和HcHSC70。氨基酸序列分析表明，這2條基因具備HSP70家族保守的結構特點，并具有3個HSP70蛋白家族的簽名序列(Gupta, 1995)和3個真核細胞特征基序(圖1)。亞細胞定位的預測結果顯示HcHSP70定位于細胞質(zhì)中，HcHSC70定位于線粒體中。線粒體作為真核細胞的重要“能量工廠”，是細胞進行呼吸等細胞代謝的主要場所(孫飛等, 2008)，所以推測HcHSC70可能參與了高溫下細胞的代謝過程。

熱激蛋白70家族分為誘導型HSP70和組成型HSC70兩種類型(Zhangetal., 2011)，前者在正常生理狀態(tài)下表達量極低，脅迫后大量上調(diào)；后者正常條件下含量較高，受到脅迫后僅微量上調(diào)或不上調(diào)。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，不同鱗翅目昆蟲的誘導型HSP70之間同源性高于同屬于美國白蛾的HcHSP70和HcHSC70之間的同源性，不同鱗翅目昆蟲的組成型HSC70之間的同源性同樣高于同屬于美國白蛾的HcHSP70和HcHSC70之間的同源性(圖3)。這表明雖然誘導型HSP70和組成型HSC70的序列結構特征十分相似，但熱激蛋白70基因在昆蟲進化的早期已經(jīng)出現(xiàn)兩支，使得HSP70和HSC70各自在不同物種間的同源性更高(Delelis-Fanienetal., 1997)。

熱激蛋白70基因在轉錄水平參與美國白蛾幼蟲的熱脅迫響應。美國白蛾4齡幼蟲在熱激處理1 h后，HcHSP70的表達量上調(diào)，并且與溫度梯度呈正相關，在35℃處理2 h時表達量達到峰值(圖4: A)；而HcHSP70在熱激條件下僅微量上調(diào)或不上調(diào)(圖4: B)，暗示了HcHSP70在美國白蛾抵御熱脅迫時發(fā)揮重要作用。但HSP70的上調(diào)表達存在極限，如在40℃下2和3 h時HcHSP70表達量并沒有上調(diào)。這種現(xiàn)象與其他昆蟲熱激蛋白的轉錄響應特性一致，如松墨天牛Monochamusalternatus的MaltHSP21.20在45℃時表達量最高，而在50℃處理組中相對表達量呈現(xiàn)下降趨勢(李慧等, 2018)；煙粉虱Bemisiatabaci在41℃時HSP70基因表達量最高，在43和45℃時表達水平迅速降低(崔旭紅等, 2007)。這些結果表明，昆蟲熱激蛋白70對轉錄響應存在極限，一方面原因是當外界環(huán)境溫度過高時，會破壞昆蟲體內(nèi)的正常生理狀況；另一方面熱激蛋白70過量的表達可能會影響昆蟲正常的生長發(fā)育，從而對許多生理過程如生殖等帶來負面影響(Krebs and Feder, 1997)。

本研究在對HcHSP70重組表達與純化的基礎上進行分子伴侶功能分析，發(fā)現(xiàn)HcHSP70在25, 30, 35和40℃下具有高且穩(wěn)定的ATPase活性(圖6)。對松墨天牛的MaltHSP70-2研究中也得到相似結果(Lietal., 2020)。高溫脅迫下穩(wěn)定的結構和構象是HSP70發(fā)揮分子伴侶功能的基礎，推測HcHSP70蛋白在美國白蛾應對熱脅迫中發(fā)揮著重要作用(趙超越, 2016)。但是本研究僅限于體外表達重組蛋白來驗證HcHSP70具有穩(wěn)定的ATPase活性，還需要通過RNA干擾或者基因編輯技術進一步探究HcHSP70蛋白在美國白蛾抵御高溫脅迫中的作用。

本研究克隆獲得2條美國白蛾HSP70基因HcHSP70和HcHSC70，序列分析表明2條基因的編碼蛋白均符合熱激蛋白70家族的結構特征，并且亞細胞定位預測位于不同的細胞結構中；檢測了其在高溫處理下mRNA的相對表達量，表明HcHSP70和HcHSC70參與了美國白蛾抵御高溫脅迫的過程。此外，通過原核表達及純化獲得美國白蛾HSP70蛋白，并通過體外實驗證明重組蛋白HcHSP70在高溫處理下具有穩(wěn)定的ATPase活性，進一步暗示HcHSP70是影響美國白蛾耐熱性的重要基因，可以為揭示美國白蛾的擴散機制以及預測潛在分布區(qū)提供參考。