吳少英, 段文波, 李 芬, 楊 磊, 王 顥, 王力奎

(海南大學三亞南繁研究院, 海南三亞 572025)

伴隨著從低等無脊椎動物到高等脊椎動物的進化，昆蟲電壓門控鈉離子通道(voltage-gated sodium channel)也經歷了漫長的演化，其蛋白結構和功能與哺乳動物類似(Littleton and Ganetzky, 2000; Zakon, 2012)。相較于哺乳動物有9個及以上的鈉離子通道基因，在目前已經完成基因組測序的143種昆蟲中，除了蚜蟲有2個鈉離子通道基因(Ameyetal., 2015; Zuoetal., 2016; Jiangetal., 2017; 段文波等, 2020; 王顥等, 2020)外，其他昆蟲均只有1個鈉離子通道基因(Dongetal., 2014; Yinetal., 2016; Wuetal., 2017)。盡管昆蟲鈉離子通道基因數量較少，但其可通過可變剪切和RNA編輯等方式豐富其鈉離子通道的生理功能。比如去除可變剪切外顯子b后，綠盲蝽Apolyguslucorum、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster和德國小蠊Blattellagermanica等昆蟲鈉離子通道在雙電極電壓鉗系統(tǒng)下的電壓信號迅速增強(Songetal., 2004; Zhangetal., 2020)。作為很多動物源和植物源毒素以及擬除蟲菊酯類殺蟲劑等化合物的作用靶標，昆蟲鈉離子通道的突變可導致靶標敏感性顯著下降。研究表明，刪除德國小蠊鈉離子通道基因可變剪切位點G1111后，其對Ⅱ型擬除蟲菊酯——溴氰菊酯的敏感性顯著下降，但是對Ⅰ型擬除蟲菊酯——芐氯菊酯的敏感性并沒有改變(Duetal., 2009a)。黑腹果蠅胚胎中可變剪切f占所有剪切體的比例遠遠高于成蟲，但在胚胎中j的出現率僅為10%，在成蟲中卻高達89%(Songetal., 2004)?？勺兗羟羞€可以調節(jié)神經興奮。例如，黑腹果蠅鈉離子通道可變剪切f可導致電壓依賴性鈉離子通道活化并使其向超極化方向偏移(Linetal., 2009)。由上述可知，昆蟲鈉離子通道可變剪切不僅影響其表達量，還可改變其電壓依賴程度。此外，RNA編輯也會改變鈉離子通道的門控特性。如德國小蠊BgNav1-1基因U至C的RNA編輯(核苷酸變化T3854C，氨基酸變化L1285P)，可導致鈉離子通道的激活和失活并向去極化方向偏移(Liuetal., 2004)。綜上，昆蟲鈉離子通道基因序列或者表達上的微小差別，均能引起其行為反應的巨大差異。

神經毒劑與昆蟲鈉離子通道相互結合位點一直是研究的熱點和難點。Catterall(1992)推測每一種通道只有一個藥劑結合位點。O′Reilly等(2006)以鉀離子通道晶體結構為基礎，通過計算機建模，模擬家蠅Muscadomestica鈉離子通道與擬除蟲菊酯殺蟲劑相互作用的分子模型，認為其只有一個結合區(qū)域，但在這個區(qū)域外卻發(fā)現了更多的突變位點。早在2000年Vais等曾經預測，昆蟲鈉離子通道上存在兩個擬除蟲菊酯殺蟲劑結合位點(Vaisetal., 2000)。2013年董珂課題組關于埃及伊蚊Aedesaegypti鈉離子通道突變體的研究也證實了這一點，發(fā)現跨膜區(qū)位點突變能導致鈉離子通道結構和功能發(fā)生變化(Duetal., 2013)。雖然昆蟲鈉離子通道與不同擬除蟲菊酯藥劑有雙結合位點的共性，但它們對相同擬除蟲菊酯藥劑的選擇性存在差異。Wu等(2017)發(fā)現在蜂-螨防治過程中使用的一種擬除蟲菊酯藥劑——氟胺氰菊酯，它對狄斯瓦螨Varroadestructor等其他昆蟲毒性高，但對蜂毒性卻很低，從而引起蜂對氟胺氰菊酯的敏感性降低，這是由于熊蜂Bombusimpatiens鈉離子通道氨基酸位點的特異性導致。綜上，國內外科研人員在過去幾十年間對鈉離子通道和擬除蟲菊酯殺蟲劑作用于鈉離子通道的分子機理研究方面已經取得了長足進展。

因此，基于昆蟲鈉離子通道多物種適應性進化，進一步探索其結構和功能，對于研發(fā)安全、高效的鈉離子通道靶向型化學藥劑，并以此防治田間害蟲有重要推動作用。

1 昆蟲鈉離子通道基因序列和結構

1.1 昆蟲鈉離子通道基因鑒定、外源表達和結構解析

Loughney等(1989)從黑腹果蠅中首次克隆出昆蟲鈉離子通道基因DmNav，由于該基因位于黑腹果蠅溫度敏感的麻痹區(qū)域(paralysis locus)，因此又將其通稱為para。DmNav與哺乳動物鈉離子通道α亞基序列相似性極高，即高度保守(Loughneyetal., 1989; Soderlund, 2005; Dong, 2007)。隨后科學家們利用非洲爪蟾Xenopuslaevis卵母細胞對DmNav展開功能研究，這奠定了昆蟲鈉離子通道分子、功能和藥理學研究的基礎(Fengetal., 1995; Warmkeetal., 1997)。目前，已經在非洲爪蟾卵母細胞中成功表達的昆蟲鈉離子通道包括黑腹果蠅鈉離子通道DmNav(Loughneyetal., 1989)、家蠅鈉離子通道Vssc1(Smithetal., 1997)、德國小蠊B.germanica鈉離子通道BgNav(Liuetal., 2000; Tanetal., 2002)、狄斯瓦螨鈉離子通道VdNav(Duetal., 2009b)、埃及伊蚊鈉離子通道AaNav(Duetal., 2013)、西方蜜蜂Apismellifera鈉離子通道AmNav1(Badaroudineetal., 2015)、熊蜂鈉離子通道BiNav(Wuetal., 2017)、綠盲蝽鈉離子通道AlNav(Zhangetal., 2020)、褐飛虱Nilaparvatalugens鈉離子通道NlNav(Sunetal., 2020)和斑翅果蠅Drosophilasuzukii鈉離子通道DsNav(未發(fā)表)，這些昆蟲鈉離子通道均表現出復極化、失活、去激活和失活后恢復等主要的門控特性。上述基于雙電極電壓鉗系統(tǒng)的研究驗證了部分昆蟲鈉離子通道可變剪切和RNA編輯的功能，解釋了昆蟲鈉離子通道部分突變位點與擬除蟲菊酯藥劑抗藥性的互作關系。此外，還可以利用CRISPR/Cas9等基因編輯技術對尚未鑒定到的昆蟲鈉離子通道展開功能研究。

冷凍電鏡開辟了離子通道三維結構研究的先河，研究人員最初以鉀離子通道的晶體結構為基礎，通過計算機建模，模擬昆蟲鈉離子通道的空間結構(O′Reillyetal., 2006)。2011年第一個原核生物鈉離子通道結構NavAb的晶體結構被解析，2012年《Science》雜志同一期報道了原核生物鈉離子通道NavRh失活態(tài)(inactivated state)和NavAb另外兩種失活態(tài)的晶體結構(Payandehetal., 2011; Payandehetal., 2012; Zhangetal., 2012)。2017年科學家首次從真核生物美洲大蠊Periplanetaamericana中得到鈉離子通道PaNav的結晶體-EM結構，其包括一個與VSD1區(qū)域比鄰的保守型氨基端結構域和一個與domain Ⅲ-domain Ⅳ-linker鏈接在一起的羧基端結構域(Shenetal., 2017)。這是昆蟲鈉離子通道里程碑式的發(fā)現，并為進一步研究鈉離子通道和與之有關的鈣離子通道功能奠定了重要基礎。Shen等(2018)發(fā)現美洲大蠊PaNav與河豚毒素和蛤蚌毒素結合在選擇性濾器入口處，而與蜘蛛毒素結合在孔道結構域之間的外側部位。隨后，Yan等(2017)采用電鏡法解析了電鰻鈉離子通道EeNav1.4的結構，并首次揭示了其β亞基的結構及其與α亞基的相互作用。上述這些研究表明冷凍電鏡技術不僅有助于解析昆蟲鈉離子通道多個不同狀態(tài)的構象，還有助于闡明昆蟲鈉離子通道結構的動態(tài)變化過程。

1.2 昆蟲鈉離子通道α亞基

昆蟲鈉離子通道由一個分子量為260 kD左右的α亞基和5個輔助小亞基組成，將α亞基單獨注射入爪蟾卵母細胞中，其具有鈉離子通道活性，而另外5個輔助亞基則起到調節(jié)鈉離子通道表達或者調節(jié)鈉離子通道門控的作用(Armstrong and Bezanilla, 1997; Goldin, 2002)。鈉離子通道α亞基是跨膜糖蛋白，由domain Ⅰ, domain Ⅱ, domain Ⅲ和domain Ⅳ 4個同源性極高的跨膜結構域和一個 N端及C端組成(圖1: A)。4個結構域相互圍繞形成中央孔洞，各個跨膜結構域之間由接頭(linker)相互連接，形成一個四聯(lián)體，構成鈉離子通道的結構基礎(Dong, 2007)。每個結構域由6個疏水性跨膜螺旋體(S1-S6)組成，S1-S4構成電壓感受模塊，S5, S6和連接S5及S6段的LOOP(P-LOOP)形成鈉離子通道的孔模塊。每個S4跨膜螺旋體包含帶正電荷的氨基酸殘基的重復基序，其次是兩個疏水殘基，構成鈉離子通道電壓傳感器。為響應膜去極化，S4開始向外移動，且構象發(fā)生變化，通道打開，導致鈉離子通道失活。在通道打開和關閉期間，S4和S5段由短細胞內連接子(L45)連接(Catterall, 2000)。

圖1 非蚜蟲類昆蟲(A)和蚜蟲(B)電壓門控鈉離子通道的跨膜拓撲結構(改自Jiang et al., 2017)

每個同源結構域的S4跨膜區(qū)都含有一個保守元件，其含有帶正電荷的精氨酸或賴氨酸重復基序(repeated motif)，這些氨基酸分別由2個中性氨基酸隔開，形成通道的電壓敏感元件，即電壓感受器。當細胞去極化時，這些正電荷能檢測膜電場，導致鈉離子通道4個結構域的S4跨膜片段向膜外移動，帶動S1, S2和S3移動，引起鈉離子通道構象變化，從而實現跨膜口和通道的開啟。通道開放伴隨著大量鈉離子內流，進而產生門控電流(gating current)，數毫秒后，S4往后移動，帶動S1, S2和S3恢復原位，激活閘門和離子通道關閉。S5和S6兩個跨膜區(qū)參與形成鈉離子通道親水孔道，即4個同源結構域的8個S5和S6跨膜片段共同圍繞形成細胞親水孔道(Dongetal., 2014)。

鈉離子通道結構域P-LOOP環(huán)上分別有D, E, K和A 4個氨基酸殘基，它們決定了鈉離子通道的選擇性，昆蟲鈉離子通道domain Ⅲ和Ⅳ之間還存在一個失活閥門MFM(Met-Phe-Met)，DEKA和MFM是判斷普通昆蟲鈉離子通道α亞基的關鍵氨基酸位點(Dongetal., 2014)。哺乳動物鈉離子通道中失活閥門是IFM，IFM快失活基序可與domain Ⅲ和Ⅳ結構域中6-TM的S4-S5 linker和S6作用，導致鈉離子通道快速失活，推測其可能限制了鈉離子通道的開放構象，從而發(fā)揮作用(Yanetal., 2017; Panetal., 2018)。由上述可知，昆蟲鈉離子通道失活閥門MFM與哺乳動物鈉離子通道IFM起類似作用。

半翅目蚜蟲類鈉離子通道結構較為特殊，其分別由分子量為130 kD和 110 kD左右的兩個α亞基組成(圖1: B)，且選擇性過濾器內圈關鍵氨基酸并非常見的DEKA，而是DENS，其外圈關鍵氨基酸也并非其他生物常見的EEQD，而是EEED。蚜蟲鈉離子通道domain Ⅲ和Ⅳ間存在MFM元件，其在昆蟲中十分保守，是失活門控關鍵氨基酸(Ameyetal., 2015; Zuoetal., 2016; Jiangetal., 2017; 段文波等, 2020; 王顥等, 2020)。電生理數據顯示當黑腹果蠅鈉離子通道的“DEKA”被“DENS”取代后，其對河豚毒素(tetrodotoxin, TTX)的敏感性降低，這與蚜蟲對TTX不敏感的生物測定結果一致，推測與其鈉離子通道選擇性過濾器DENS相關，且可能是進化或遺傳漂變產生的結果(Ameyetal., 2015)。而哺乳動物鈉離子通道可分為TTX敏感型和TTX不敏感型兩大類，其中前一類型分布遠遠廣于后一類型(Ogata and Tatebayashi, 1993)。

1.3 昆蟲鈉離子通道輔助亞基

昆蟲TipE蛋白和TipE同源蛋白(TEH1-4)作為輔助亞基，在調控鈉離子通道表達過程中發(fā)揮重要作用。二者均由兩個跨膜結構域、連接兩個跨膜區(qū)的細胞外連接肽和細胞內N端及C端氨基酸殘基構成。不同昆蟲TipE蛋白和TEH蛋白在調控鈉離子通道門控性質時既有相似之處，也存在差異。研究表明多種昆蟲的TipE和TEH1-2均可以促進鈉離子通道α亞基的表達，進而參與其動力學和電壓門控的調節(jié)(Fengetal., 1995; Warmkeetal., 1997; Leeetal., 2000; Duetal., 2013)。將黑腹果蠅的DmNav9-1, DmNav22和DmNav26分別與TipE和TEH1-4共表達，結果表明TipE, TEH1和TEH2均能促進鈉離子通道的表達，其中TipE可使其向超級化方向移動，而TEH1則使鈉離子通道的激活、快速失活和慢失活都往超級化方向移動；反之，TEH3和TEH4產生的外向電流對鈉離子通道的表達有抑制作用，它們是否也參與其他離子通道的門控調控仍需做進一步探究(Wangetal., 2013, 2015)。有研究指出美洲大蠊TipE與黑腹果蠅鈉離子通道α亞基共表達所產生的電流比黑腹果蠅鈉離子通道α亞基與TipE共表達產生的電流大，但美洲大蠊TipE與α亞基共表達卻沒有電流出現(Bourdinetal., 2015)。TipE和TEH1-4在不同組織中的表達模式也存在差異，其中TEH1只在神經系統(tǒng)中廣泛分布，而TipE和TEH2-4除在神經系統(tǒng)中表達外，還在其他組織，如脂肪體、馬氏小管、腸道、唾液腺、中樞神經系統(tǒng)和體壁肌肉中表達(Derstetal., 2006)。

目前人類鈉離子通道NaV1.4 α亞基與β1亞基的相互作用已經通過結構生物學方法得到解析(圖2)，人類鈉離子通道NaV1.4 α亞基與β1亞基的結合部位位于Domain Ⅲ區(qū)域。NaV1.4 α亞基Domain Ⅲ與Domain Ⅳ區(qū)域的電壓傳感器是完全重疊的，但是Domain Ⅰ或Domain Ⅱ卻沒有表現出此類特性。通過模擬其空間結構，發(fā)現人鈉離子通道NaV1.4 α亞基與細菌NaChBac的Domain Ⅲ結構高度相似(Molinaroloetal., 2018)。因此，哺乳動物晶體結構的解析對昆蟲輔助亞基功能研究有重要借鑒意義。

圖2 鈉離子通道NaV1.4 α/β1亞基互作結構模型(引自Molinarolo et al., 2018)

2 昆蟲鈉離子通道可變剪切和RNA編輯

哺乳動物有9個不同的鈉離子通道α亞基，它們在不同類型細胞、組織和發(fā)育階段表達，且在特定細胞中行使獨特的生理功能(Catterall, 2000; Goldinetal., 2000; Yu and Catterall, 2003)。而絕大部分昆蟲只有1個或者2個鈉離子通道基因，其如何能用數量甚少的鈉離子通道基因行使復雜的生理功能仍是當下的研究熱點與難點。研究表明綠盲蝽和黑腹果蠅等昆蟲的鈉離子通道存在大量的可變剪切和RNA編輯(Loughneyetal., 1989; Thackeray and Ganetzky, 1994, 1995; Hanrahanetal., 2000; Reenanetal., 2000; Olsonetal., 2008; Zhangetal., 2020)，這些可變剪切和RNA編輯有助于鈉離子通道行使門控通道和藥理學功能。

2.1 昆蟲鈉離子通道可變剪切

可變剪切(alternative splicing)是一種基因轉錄后調控機制，可增加mRNA的多樣性。昆蟲不同組織部位和不同發(fā)育階段可以產生多個不同的可變剪切轉錄本，從而增加鈉離子通道基因的多樣性，使其呈現出相似、差異或者互斥的功能，進而導致鈉離子通道門控和藥理學性質等方面的差異(Tanetal., 2002)。

Lee等最先報道了黑腹果蠅鈉離子通道存在11種可變剪切外顯子，其中外顯子a, b, e, f, h, i和j位于細胞內接頭上，4個互斥外顯子c/d和k/l位于跨膜區(qū)，這與其他昆蟲鈉離子通道結構(Leeetal., 2002; Sonodaetal., 2008)類似。但同種昆蟲不同部位和不同發(fā)育階段產生的選擇性剪切類型或出現的頻率不同。如，黑腹果蠅鈉離子通道在胚胎中的剪切體類型是27種，而在成蟲期是29種(Olsonetal., 2008; Linetal., 2009)。外顯子j在黑腹果蠅胚胎和成蟲中出現的頻率分別為10%和89%，而外顯子f在胚胎中的出現頻率則顯著高于成蟲。黑腹果蠅、綠盲蝽和德國小蠊鈉離子通道中外顯子b的出現頻率分別是60%, 55%和20%(Linetal., 2009)。另外，黑腹果蠅存在外顯子c和d，而德國小蠊和西方蜜蜂中只存在外顯子c而沒有外顯子d；反之，綠盲蝽和赤擬谷盜Triboliumcastaneum則只存在外顯子d，而沒有外顯子c(Daviesetal., 2007; Zhangetal., 2020)?？勺兗羟胁粌H參與鈉離子通道的表達調控，還可改變鈉離子通道激活和失活電壓。如，不含外顯子b的黑腹果蠅、綠盲蝽和德國小蠊鈉離子通道在雙電極電壓鉗系統(tǒng)下的表達速率顯著加快(Songetal., 2004; Zhangetal., 2020)。研究表明，除綠盲蝽和赤擬谷盜僅含有互斥子l外，大部分昆蟲，如桃蚜Myzuspersicae等鈉離子通道均含有k/l兩個保守性很高的互斥子(Daviesetal., 2007; Zhangetal., 2020)。黑腹果蠅鈉離子通道中的互斥外顯子k和l與電流的持續(xù)性產生相關(Linetal., 2009)，即含有外顯子l的鈉離子通道神經活動比含有外顯子k的鈉離子通道更加活躍。德國小蠊與黑腹果蠅k/l同源的外顯子分別是G1/G2，除G1和G2外，其還存在一個與哺乳動物類似的含終止密碼子的外顯子G3，或參與生物體興奮傳導(Songetal., 2004)。此外，家蠶Bombyxmori和褐色桔蚜Toxopteracitricid也存在外顯子a, f, h和i，但這些在所有鈉離子通道剪切體中均存在，因此不屬于可變剪切(Shaoetal., 2009; Jiangetal., 2017)。Davies等(2007)曾報道外顯子e僅存在部分雙翅目昆蟲中，后續(xù)褐色桔蚜的研究也表明此物種確實沒有外顯子e(Daviesetal., 2007; Jiangetal., 2017)。綜上，昆蟲鈉離子通道可變剪切可能出現在昆蟲的不同部位及發(fā)育階段，從而行使不同功能，但某個可變剪切的具體功能仍需做進一步探究。

2.2 昆蟲鈉離子通道RNA編輯

RNA編輯是mRNA在轉錄水平上通過堿基插入、缺失或者替換從而引起氨基酸改變，擴大了生物體遺傳信息，有利于其更好地適應外界環(huán)境。昆蟲鈉離子通道存在兩種RNA編輯形式：一種是A至I編輯，另一種是U至C編輯。A至I編輯是腺苷A去氨基轉變?yōu)榇吸S嘌呤I，這種編輯方式在昆蟲中出現頻率很高。RNA編輯最初發(fā)現于錐蟲線粒體中(Benneetal., 1986)，之后在黑腹果蠅、綠盲蝽和德國小蠊等昆蟲中相繼被報道(Palladinoetal., 2000; Songetal., 2004; Zhangetal., 2020)。在黑腹果蠅鈉離子通道基因中已經鑒定了11個A至I編輯位點，其中9個可導致氨基酸突變(Hanrahanetal., 2000; Palladinoetal., 2000; Reenanetal., 2000; Riederetal., 2013)。環(huán)境條件的改變能誘導昆蟲鈉離子通道的RNA編輯，如10～30℃的溫度變化能迅速引起果蠅鈉離子通道A至I編輯(Riederetal., 2015)。在德國小蠊中發(fā)現兩個A至I編輯位點，氨基酸突變分別為K184R和I1660M，其中K184R突變能引起鈉離子通道激活向去極化方向偏移。在綠盲蝽鈉離子通道中也發(fā)現同樣的RNA編輯位點I1660M(Songetal., 2004; Zhangetal., 2020)。此外，昆蟲鈉離子通道還存在U至C編輯，例如F1919S位點編輯同時存在于黑腹果蠅和德國小蠊中，且此類編輯可產生持久電流(Liuetal., 2004)。RNA編輯存在組織特異性，A至I編輯通常發(fā)生于神經節(jié)中，U至C編輯則存在卵巢和腸道中。德國小蠊4類RNA編輯K467R, Y548C, N567D 和K699R在幼蟲、蛹和成蟲不同發(fā)育階段出現的頻率不同，其中K467突變?yōu)?67Q或467R都能提高瞬時內向電流(Ryanetal., 2012)。RNA編輯還能引起昆蟲神經性興奮，并產生巨大的生物物理學反應(Sunetal., 2012)。

盡管昆蟲鈉離子通道基因數量較少，但其可以通過兩種轉錄后修飾(可變剪切和RNA編輯)增加其功能多樣性，某些核苷酸的細微變化就能引起昆蟲鈉離子通道結構與功能的改變，有的可以導致昆蟲生理功能缺陷(Lindsayetal., 2008)，有的能夠幫助昆蟲迅速適應外界環(huán)境的變化(Riederetal., 2015)，還有些則能改變昆蟲鈉離子通道與外源物質的結合能力(Songetal., 2011)。

3 幾種神經毒劑與昆蟲鈉離子通道相互作用

3.1 神經毒素與鈉離子通道的結合位點

鈉離子通道是許多動物源毒素、植物源毒素和化合物等的作用靶標(Stevensetal., 2011)。神經毒素是能夠影響神經系統(tǒng)的天然或者人工化學分子，其作用于鈉離子通道的方式主要有兩種：一種是改變門控力學和電壓依賴性，另一種是侵占孔道并影響離子通透性。神經毒素(包括天然毒素和殺蟲劑)作用于鈉離子通道的位點共有8種類型(圖3)：位點1，河豚毒素(tetrodotoxin, TTX)、石房蛤毒素(saxitoxin, STX)和μ-芋螺毒素(μ-conotoxin)插入孔區(qū)，使鈉離子通道失活(Stephanetal., 1994; Narahashi, 2008; Chauetal., 2011; Shenetal., 2018)；位點2，蟾毒素(batrachotoxin)、藜蘆定(veratridine)和木藜蘆毒素(grayanotoxin)等毒素能抑制鈉離子通道的失活，使其保持持續(xù)激活狀態(tài)(Wang and Wang, 1998, 1999; Duetal., 2001)；位點3，蝎毒素(scorpion α-toxin)、海葵毒素(sea anemone toxin)、蜘蛛毒素(δ-atracotoxin)和黃蜂毒素(β-PMTX)能延緩或抑制鈉離子通道的失活(Rogersetal., 1996; Tejedor and Catterall, 1988; Nicholsonetal., 2004; Schiavonetal., 2010)；位點4，β-蝎毒素(scorpion β-toxin)、β-蜘蛛毒素(spider β-toxin)和μO-芋螺毒素(μO-conotoxin)能激活鈉離子通道，且使鈉離子通道失活(Nicholson, 2007; Billenetal., 2010; Songetal., 2011)；位點5，環(huán)聚醚復合物包括雙鞭甲藻毒素(brevetoxin)和雪卡毒素(ciguatoxin)等能夠抑制并改變鈉離子通道的激活(Gawleyetal., 1995; Badenetal., 2005; Perezetal., 2011)；位點6，δ-芋螺毒素(δ-conotoxin)等位點毒素延緩鈉離子通道的失活(Fainzilberetal., 1994; Shonetal., 1994)；位點7，擬除蟲菊酯(pyrethroid)和DDT(dichloro-diphenyl-tricgloroethane)能夠延緩或抑制通道的失活(Soderlund, 2008; Duetal., 2013; Wuetal., 2017)；位點8，局部麻醉劑(local anesthetic)和抗痙攣藥(anticonvulsant)等藥劑可阻斷鈉離子通道(Zhangetal., 2016)。

圖3 電壓門控鈉離子通道的神經毒素結合位點(改自Stevens et al., 2011)

3.2 擬除蟲菊酯與昆蟲鈉離子通道相互作用

在農業(yè)害蟲控制過程中，由于擬除蟲菊酯類殺蟲劑的不合理使用，抗藥性問題日益突出，其中由鈉離子通道基因突變導致昆蟲鈉離子通道與擬除蟲菊酯類殺蟲劑的結合親和性下降而產生的擊倒抗性(knockdown resistance, kdr)已成為靶標抗性的重要機制之一(Fieldetal., 2017)。

鈉離子通道普遍存在于神經細胞、內分泌細胞等可興奮細胞的細胞膜上，可產生初始動作電位(Armstrong, 1981)。鈉離子通道的開啟和關閉受電刺激控制，在整個過程中依次呈現靜息狀態(tài)，激活狀態(tài)以及失活狀態(tài)。當細胞受到電刺激時，鈉離子通道被激活，閥門打開，鈉離子順著電化學梯度跨膜通過并涌入細胞，但僅僅數毫秒后通道就迅速關閉。鈉離子通道的開放導致膜兩側電位極性改變，并引起電位差，造成細胞膜動作電位上升(Dong, 2007)。鈉離子通道復極化(repolarization)過程包括失活(inactivation)和去激活(deactivation)，其中去激活過程中記錄的電流稱為尾電流(tail current)，鈉離子通道的失活后恢復(recovery from inactivation)指鈉離子通道閥門重新開啟并恢復到靜止狀態(tài)(Dongetal., 2014)。鈉離子通道的主要功能是維持細胞興奮性及傳導，對心肌細胞、神經元、內分泌細胞和骨骼肌細胞等動作電位的傳導有重要作用(Levitan and Kaczmarek, 2002)。擬除蟲菊酯藥劑可抑制昆蟲鈉離子通道的失活和去激活化，并延長昆蟲鈉離子通道開放時間。擬除蟲菊酯殺蟲劑分為Ⅰ型和Ⅱ型，二者作用于昆蟲鈉離子通道的原理存在差異：Ⅰ型擬除蟲菊酯藥劑的作用原理和DDT相似，通過延長鈉離子通道開放時間使動作電位升高，導致神經細胞重復放電；Ⅱ型擬除蟲菊酯藥劑使動作電位低于閾電位，不重復放電，但能擾亂神經突觸功能(Lund and Narahashi, 1981)。雙電極電壓鉗試驗表明，相比于Ⅱ型擬除蟲菊酯，Ⅰ型擬除蟲菊酯誘導鈉離子通道尾電流衰減的速度更快(Narahashietal., 1996)。擬除蟲菊酯Ⅰ型和Ⅱ型藥劑使昆蟲中毒的癥狀存在差異，這或許是兩種藥劑對昆蟲鈉離子通道尾電流動力學響應不同所致。

擬除蟲菊酯殺蟲劑在昆蟲鈉離子通道上有兩個結合位點(圖4)：結合位點Ⅰ，由結構域Ⅱ的S4-S5連接肽、結構域Ⅱ的跨膜螺旋S5和結構域Ⅲ的跨膜螺旋S6組成(O′Reillyetal., 2006)；結合位點Ⅱ，由結構域Ⅰ的S4-S5連接肽、結構域Ⅰ的跨膜螺旋S5和S6以及結構域Ⅱ的跨膜螺旋S6組成(Duetal., 2013)。擬除蟲菊酯結合位點Ⅰ和Ⅱ在空間上是對稱的，但是兩個位點的結合方向卻相反。溴氰菊酯在與昆蟲鈉離子通道結合位點Ⅰ結合時，二苯醚基向細胞內側移動，二溴乙烯基向細胞外側移動，而結合位點Ⅱ正好與結合位點Ⅰ相反(Duetal., 2015)。雖然結合位點I和結合位點Ⅱ在空間上是對稱的，但是二者的功能并不完全相同，例如N3i20A(結合位點Ⅰ：ⅢS6)突變使昆蟲對擬除蟲菊酯藥劑的敏感性顯著降低，但N2i20A(結合位點Ⅱ：ⅡS6)突變卻不產生類似效果(Duetal., 2015)。研究表明，家蠅和綠盲蝽鈉離子通道經典kdr突變F1014L和super-kdr突變M918Ⅰ可賦予其對擬除蟲菊酯的抗性，且利用雙電極電壓鉗技術證實了F1014L/M918Ⅰ雙突變導致擬除蟲菊酯藥劑失去與綠盲蝽鈉離子通道的結合能力(Wangetal., 2020)。此外，埃及伊蚊鈉離子通道L1014位點存在多種形式的突變，如L1014F, L1014C, L1014W, L1014H和L1014S(Scott, 2019)。這些單突變、雙突變和多突變使昆蟲對殺蟲劑所產生的抗性倍數不同，且與地理分布有關。

圖4 計算機構建的埃及伊蚊鈉離子通道的三維結構(引自Du et al., 2013)

相較于大部分昆蟲，哺乳動物對擬除蟲菊酯藥劑均不敏感，這是由于其鈉離子通道僅存在結合位點Ⅰ，不存在結合位點Ⅱ導致(Duetal., 2013)，且結合位點Ⅰ(IIL45)、結合位點Ⅱ(IL45和IS5)部分氨基酸的突變導致其對擬除蟲菊酯藥劑的敏感性降低(Soderlund, 2012; Oliveiraetal., 2013)。

雖然不同昆蟲鈉離子通道與擬除蟲菊酯的作用區(qū)域均位于結合位點Ⅰ和結合位點Ⅱ，但具體結合位點也存在差異。蜂類(以熊蜂為模型)鈉離子通道的研究表明，熊蜂存在V926, F1525和T841等不同于其他昆蟲的氨基酸殘基(圖5)，但這些殘基在12種蜂類中具有保守性，因此，蜂類的鈉離子通道與氟胺氰菊酯(tau-fluvalinate)的結合力沒有黑腹果蠅等昆蟲的強，這決定了熊蜂鈉離子通道對氟胺氰菊酯與其他擬除蟲菊酯的獨特選擇性，揭示了生產中可用氟胺氰菊酯作為蜂類殺螨劑的分子機理(Wuetal., 2017)。

圖5 溴氰菊酯(A)和氟胺氰菊酯(B)在熊蜂鈉離子通道的結合位點側視圖(引自Wu et al., 2017)

3.3 茚蟲威和氰氟蟲腙與昆蟲鈉離子通道相互作用

茚蟲威和氰氟蟲腙為鈉離子通道阻斷型殺蟲劑，可阻斷昆蟲中樞和外周神經系統(tǒng)的神經元動作電位(Caballeroetal., 2019)。茚蟲威是美國杜邦公司開發(fā)的噁二嗪類新型高效殺蟲劑，其對鱗翅目和部分同翅目及鞘翅目害蟲具有較好的殺蟲活性，經口被攝入后可經酯酶或酰胺酶催化并迅速代謝為N-去甲氧羰基代謝物(decarbomethoxylatedmetabolite, DCJW)(Wingetal., 2000)。氰氟蟲腙是德國巴斯夫公司與日本農藥公司聯(lián)合推出的一種新型的縮氨基脲類殺蟲劑(Salgado and Hayashi, 2007)，對鱗翅目昆蟲效果較好。神經生理學實驗結果表明，茚蟲威和氰氟蟲腙能不可逆阻斷昆蟲鈉離子通道的功能，導致靶標昆蟲運動失調、停止取食、麻痹、死亡(Tsurubuchi and Kono, 2003; Salgado and Hayashi, 2007)。

研究人員在對茚蟲威產生抗性的小菜蛾Plutellaxylostella和番茄潛麥蛾Tutaabsoluta種群中檢測到了鈉離子通道F1845Y和V1848I突變(Wangetal., 2016; Roditakisetal., 2017)，在非洲爪蟾卵母細胞中表達兩個位點突變后的鈉離子通道，發(fā)現其與茚蟲威的結合能力顯著降低(Jiangetal., 2015)。Samantsidis等(2019)通過CRISPR/Cas9 技術在黑腹果蠅體內構建了F1845Y或V1848I突變品系，攜帶2個突變位點的黑腹果蠅均對茚蟲威產生抗性。Gao等(2014)曾經報道了對茚蟲威產生抗性的田間品系鈉離子通道出現了L1014P突變，但該研究僅局限于domain Ⅱ，而尚未對domain Ⅳ進行點突變檢測，因此，其對擬除蟲菊酯類藥劑產生的交互抗性可能與L1014P突變有關。

麻醉劑也是一種鈉離子通道阻斷劑。人類鈉離子通道NaV1.4 α亞基可與部分麻醉劑相互結合，并引起多個氨基酸位點發(fā)生突變。在德國小蠊BgNav1-1中找到與人類鈉離子通道NaV1.4相對應的氨基酸位點W377A/S, V1016K, F1463A/L, T1511A, T1760A和L1801A/C，并進行點突變，再通過爪蟾卵母細胞驗證以上突變體的作用，結果表明這些點突變均能影響B(tài)gNav1-1與茚蟲威或者氰氟蟲腙的結合。此研究首次揭示了茚蟲威和氰氟蟲腙的分子選擇性殺蟲機制，并有助于研發(fā)靶向鈉離子通道內孔的神經阻斷劑(Zhangetal., 2016)。

綜上，昆蟲鈉離子通道與其阻斷劑互作機制的研究仍然非常有限，但目前田間農業(yè)昆蟲對茚蟲威和氰氟蟲腙的抗性倍數逐年增加和突變位點的日益增多，今后應當進一步加強該方面的深入研究。

4 小結與展望

自32年前首個昆蟲鈉離子通道基因被克隆以來，人們對昆蟲鈉離子通道的電生理學、藥理學和分子生物學認識取得了重大進展。昆蟲鈉離子通道在爪蟾卵母細胞中的成功表達及其結晶體的獲得對該蛋白的功能研究起著重要的推動作用。盡管昆蟲鈉離子通道數量很少，但其可通過可變剪切和RNA編輯產生很多變異體(variants)，從而豐富了昆蟲鈉離子通道的結構和功能，但可變剪切和RNA編輯在昆蟲神經系統(tǒng)中的調節(jié)作用仍需繼續(xù)探索。

雖然毒理學家已經探明了昆蟲鈉離子通道的基本結構和毒素結合區(qū)域，但是現階段的研究仍然存在諸多問題。例如，近期的研究發(fā)現桃蚜、麥長管蚜Sitobionavenae、豌豆蚜Acyrthosiphonpisum、禾谷縊管蚜Rhopalosiphumpadi、褐色桔蚜等半翅目昆蟲具有兩個獨立且完整的鈉離子通道基因：第1個鈉離子通道基因具有其他昆蟲鈉離子通道domain Ⅰ和domain Ⅱ的基本結構，第2個鈉離子通道基因則具有其他昆蟲鈉離子通道domain Ⅲ和domain Ⅳ的基本結構(Ameyetal., 2015; Zuoetal., 2016; Jiangetal., 2017; 段文波等, 2020; 王顥等, 2020)，且大部分選擇性剪切均發(fā)生在第2個鈉離子通道基因上。但到目前為止，蚜蟲鈉離子通道還未在爪蟾卵母細胞中得以成功表達，其具體功能仍需做進一步探索。昆蟲鈉離子通道輔助亞基的突變是否影響其與神經毒劑的結合或者影響其發(fā)育仍尚未知曉，但目前已經有昆蟲鈉離子通道的晶體結構被解析，且真核生物鈉離子通道結構最高分辨率已經達到0.26 nm(Shenetal., 2018)，這些研究結果都為后續(xù)鈉離子通道的功能研究及作用機理解析提供了有價值的參考。

綜上，近年來神經毒劑與鈉離子通道互作引起了毒理學家的濃厚興趣，這一領域的深入研究將極大地加深對神經毒劑與害蟲耐藥性互作分子機制的認知，有助于進一步解析各種神經毒素和殺蟲劑與昆蟲鈉離子通道互作的分子機制，并推動更高效、安全新型殺蟲劑的研發(fā)。