周銀麗，熊 浪，陳永玲，彭夢林，楊 偉，胡先奇

（1.紅河學(xué)院，a.云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.商學(xué)院，云南 蒙自 661100；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201）

間套作種植模式在中國有悠久的歷史，適宜的間套作模式對緩解用地矛盾、增加土地產(chǎn)能、降低病蟲害、維持土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性以及促進(jìn)土地可持續(xù)利用具有重要作用［1］，可提高根際微生物多樣性［2］，并且改善農(nóng)田生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)生態(tài)平衡。高圣超等［3］通過研究不同大豆種植制度對土壤質(zhì)量的影響表明大豆輪作、間套作有助于充分利用耕地資源，改善土壤理化性質(zhì)，提高土壤酶活性更有利于維持土壤地力，提高土壤質(zhì)量；國內(nèi)外大量研究表明，合理間套作能夠顯著改善作物的礦質(zhì)營養(yǎng)，從而促進(jìn)作物生長、提高產(chǎn)量［4］。李章輝［5］通過研究花生連作田中土壤微生物群落得出隨著花生連作年限的增加，土壤中真菌數(shù)量增加，細(xì)菌數(shù)量減少，證明連作使細(xì)菌型土壤向真菌型土壤轉(zhuǎn)化。土壤微生物群落在不同的土壤、溫度及水分條件下都有不同的成分構(gòu)成。土壤微生物參與土壤腐殖質(zhì)形成、有機(jī)質(zhì)分解、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)等過程，對土壤肥力形成及養(yǎng)分供應(yīng)具有明顯的調(diào)節(jié)作用［6］；同時，土壤養(yǎng)分也為土壤微生物提供生長環(huán)境及能量，使得土壤質(zhì)量可通過微生物的變化而體現(xiàn)［7］。石榴是一種重要的經(jīng)濟(jì)果樹，廣泛用于食品、醫(yī)用及有機(jī)合成，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著石榴種植規(guī)模的逐漸擴(kuò)大，石榴病害日益嚴(yán)重，影響了石榴的產(chǎn)量，造成較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，研究表明石榴枯萎病的病原菌是甘薯長喙殼（Ceratocystis fimbriata）［8］。蒙自市發(fā)現(xiàn)石榴枯萎病的時間較早，相關(guān)的防治研究陸續(xù)在開展［9，10］，近年來石榴枯萎病在當(dāng)?shù)氐奈：χ鹉昙又?，是一種危害極為嚴(yán)重的毀滅性土傳病害，很難防治，石榴枯萎病嚴(yán)重威脅著石榴產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。利用高通量測序的方法分析比較枯萎病石榴根際細(xì)菌與健康石榴根際細(xì)菌及間作桃樹石榴園枯萎病土壤細(xì)菌多樣性的差異，解析枯萎病石榴園間作桃樹對改善土壤微生態(tài)平衡及其對多年生石榴果園連作障礙的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 石榴根際土樣的采集

在云南省石榴主要栽培區(qū)的石榴園，分別選取石榴枯萎病根際土（MZD1、MZD2、MZD3）、健康石榴樹根際土（MZ6、MZ7、MZ8）、間作桃樹的石榴枯萎病土壤（MZP17、MZP18、MZP19）3種類型土壤，除去地表面土壤，采集根系周圍1 cm左右的土為根際土，置于無菌自封袋中，將5棵同種果樹根際土樣混合作為一個樣品，每種類型的石榴土壤樣品均設(shè)3個重復(fù)，將土樣置于冷藏箱中，及時帶回實(shí)驗(yàn)室分析處理，首先進(jìn)行去雜和過篩處理，用于土壤基因組DNA提取的土壤樣品，置于1.5 mL的離心管裝好，-80℃冰箱保存。

1.2 土壤基因組DNA提取方法

用土壤基因組DNA提取OMEGA試劑盒，參照步驟進(jìn)行，提取好的DNA放在-20℃冰箱保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種類型樣品根際土壤細(xì)菌的OTU分析及物種注釋

3種樣品MZD、MZ、MZP在界水平上的平均序列數(shù)目分別為33 160、14 742、15 426；MZD、MZ、MZP在門水平上的平均序列數(shù)目分別為33 099、14 729、15 419；MZD、MZ、MZP在綱水平上的平均序列數(shù)目分別為32 779、14 631、15 362；MZD、MZ、MZP在目水平上的平均序列數(shù)目分別為26 781、12 743、13 634；MZD、MZ、MZP在科水平上的平均序列數(shù)目分別為15 953、8 554、9 607；MZD、MZ、MZP在屬水平上的平均序列數(shù)目分別為5 884、3 661、4 497；MZD、MZ、MZP在種水平上的平均序列數(shù)目分別為1 443、970、850，物種序列構(gòu)成柱狀見圖1。

圖1 每個樣品細(xì)菌在各分類水平上的序列構(gòu)成

按所有樣品間序列最小值對OTUs聚類結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，根據(jù)OTUs聚類分析結(jié)果和研究需求，分析不同樣品之間OTUs的共有、特有信息繪制韋恩圖（Venn Graph），結(jié)果見圖2。在圖2中比較了3種不同土壤樣品中OTUs的信息，MZD、MZ、MZP的OTUs數(shù)分別為1 727、1 662、1 510，MZD、MZ、MZP共 有 的OTUs有1 246，MZD特 有OTUs數(shù) 為159，MZ特有OTUs數(shù)為46，MZP特有OTUs數(shù)為54。

圖2 三種類型土壤樣品細(xì)菌多樣性

2.2 3種類型樣品根際土壤細(xì)菌微生物多樣性統(tǒng)計(jì)及物種豐度聚類

2.2.1 門水平上3種類型樣品根際土壤細(xì)菌多樣性 門水平上3種類型樣品根際土壤細(xì)菌多樣性見圖3。MZP18中BRC1、AD3、酸桿菌門（Acidobacteria）相對豐度較高，綠彎菌門（Chloroflexi）、WS3、裝甲菌門（Armatimonadetes）相對豐度較低；MZ7中迷蹤菌門（Elusimicrobia）、OD1、GAL15相對豐度較高，裝甲菌門、綠菌門（Chlorobi）、綠彎菌門相對豐度較低；MZ6中TM6、泉古菌門（Crenarchaeota）、綠彎菌門相對豐度較高，浮霉菌門（Planctomycetes）、酸桿菌門、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）相對豐度較低；MZP19中擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、綠菌門相對豐度較高，AD3、厚壁菌門（Firmicutes）、WS3相對豐度較低；MZD1中裝甲菌門、TM6、纖維桿菌門（Fibrobacteres）相對豐度較高，泉古菌門、AD3、廣古菌門（Euryarchaeota）相對豐度較低；MZ8中浮霉菌門、TM7、Thermi相對豐度較高，TM6、迷蹤菌門、OD1相對豐度較低；MZP17中疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌門（Actinobacteria）、AD3相對豐度較高，浮霉菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）相對豐度較低；MZD3中酸桿菌門、厚壁菌門（Firmicutes）、WS3相對豐度較高，放線菌門、變形菌門（Proteobacteria）、泉古菌門相對豐度較低；MZD2中廣古菌門（Euryarchaeota）、NC10、GNO4相對豐度較高，擬桿菌門、疣微菌門、AD3相對豐度較低。

圖3 門水平上3種類型樣品根際土壤細(xì)菌的物種豐度聚類

2.2.2 屬水平上3種類型樣品根際土壤細(xì)菌多樣性 如表1所示，在屬的分類水平上，3種類型土壤的細(xì)菌在一定程度上存在著數(shù)量上的顯著差異性，枯萎病石榴根際細(xì)菌與栽種桃樹修復(fù)枯萎病石榴土壤根際細(xì)菌存在顯著差異的屬有蓖麻桿菌屬（Kaistobacter）、紅游動菌屬（Rhodoplanes）、假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia）、新鞘脂菌屬（Novosphingobium）、地嗜皮菌屬（Geodermatophilus）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、戴 沃 斯 菌 屬（Devosia）、苯 基 桿 菌 屬（Phenylobacterium）、放線孢菌屬（Actinomycetospora）、豐祐菌屬（Opitutus）、無色桿菌屬（Achromobacter）、腸球菌屬（Enterococcus）、纖維菌屬（Cellulosimicrobium）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、柄桿菌屬（Caulobacter）、諾卡氏菌屬（Nocardia）等。栽種桃樹修復(fù)石榴枯萎病土壤根際與健康石榴根際土壤細(xì)菌存在顯著差異的屬有假諾卡氏菌屬、苯基桿菌屬、放線孢菌屬、無色桿菌屬、鏈球菌屬、柄桿菌屬、糖單孢菌屬、諾卡氏菌屬等。

表1 屬水平上3種類型樣品根際土壤細(xì)菌多樣性的部分統(tǒng)計(jì)分析

2.3 3種類型土壤樣品的根際細(xì)菌多樣性的PCA比較

對3種類型土壤樣品的根際細(xì)菌多樣性進(jìn)行PCA［11］（Principal Component Analysis，PCA）分析，結(jié)果見圖4，第一主成分對樣品差異的貢獻(xiàn)值為33.92%，第二主成分對樣品差異的貢獻(xiàn)值為19.79%。間作桃樹的石榴枯萎病土壤（MZP）的細(xì)菌群落組成較相似，距離較近，基本聚在一起；蒙自石榴園的健康石榴根際土壤樣品（MZ）與間作桃樹的石榴枯萎病土壤（MZP）的細(xì)菌群落組成也較相似，距離相對較近，基本聚在一起；來自蒙自市石榴園的枯萎病石榴根際土壤樣品MZD1與MZD2、MZD3的距離相對較遠(yuǎn)，群落組成差異相對較大，可能與采樣地域跨度較大有關(guān)。間作桃樹的石榴枯萎病根際土壤（MZP）的細(xì)菌群落組成與枯萎病石榴根際土壤樣品（MZD）的細(xì)菌群落組成差異較大。

圖4 3種類型土壤樣品細(xì)菌的PCA分析

3 討論

利用16S rDNA測序法研究土壤根際細(xì)菌多樣性的報(bào)道較多。楊廣容等［12］基于16S rDNA測序法對茶園土壤細(xì)菌群落多樣性的研究，表明古茶園土壤細(xì)菌的豐度和多樣性高于現(xiàn)代茶園及森林，徐麗霞等［13］研究了玉米根際土壤（RS）與非根際土壤（NRS）土壤細(xì)菌多樣性的差異，同時利用細(xì)菌16S rDNA測序法研究健康及病害植物土壤根際細(xì)菌多樣性差異的報(bào)道也較多。鄧曉等［14］研究了3個典型香蕉枯萎病患病樣地的健康植株根區(qū)土壤和患病植株根區(qū)土壤細(xì)菌遺傳基因多樣性，從微生物生態(tài)學(xué)的角度解釋香蕉枯萎病的發(fā)生原因并為其防控提供理論依據(jù)。馬云艷等［15］研究表明辣椒病株根區(qū)土中的微生物數(shù)量較健康植株發(fā)生較大變化，其中真菌數(shù)量增加388.9%，辣椒病株與健康植株根區(qū)土中微生物數(shù)量異常，種類變化是辣椒疫病發(fā)生的重要原因之一。研究表明，間作桃樹的石榴枯萎病土壤與石榴枯萎病石榴根際土壤細(xì)菌多樣性在屬的分類水平上，兩種類型土壤有16屬的細(xì)菌差異顯著，說明通過間作桃樹可以改變枯萎病石榴根際的細(xì)菌多樣性，進(jìn)而改善土壤微生態(tài)平衡，促進(jìn)石榴健康生長。

4 小結(jié)

用高通量測序的方法研究了云南省蒙自市石榴園根際細(xì)菌的多樣性，通過對石榴枯萎病根際土、健康石榴樹根際土、栽種桃樹修復(fù)枯萎病土壤3種類型樣品根際土壤細(xì)菌多樣性進(jìn)行物種注釋，探索間作桃樹對石榴園枯萎病土壤根際細(xì)菌多樣性的影響。結(jié)果表明，MZD、MZ、MZP得到的OTUS數(shù)分別為1 727、1 662、1 510。PCA分析結(jié)果表明，間作桃樹修復(fù)石榴枯萎病根際土壤的細(xì)菌群落組成與枯萎病石榴根際土壤樣品的細(xì)菌群落組成差異較大，間作桃樹能較大程度改變枯萎病石榴根際土壤細(xì)菌的群落組成。在屬的分類水平上，栽種桃樹修復(fù)枯萎病土壤與健康石榴根際土壤細(xì)菌多樣性顯著差異的屬有假諾卡氏菌屬、苯基桿菌屬、放線孢菌屬等8種。栽種桃樹修復(fù)枯萎病土壤與枯萎病石榴根際土壤細(xì)菌存在顯著差異的細(xì)菌屬有鏈球菌屬、纖維菌屬、放線孢菌屬、蓖麻桿菌屬、紅游動菌屬、假諾卡氏菌屬等16種。這些屬在兩種根際土壤中的差異顯著，說明在石榴枯萎病發(fā)生園區(qū)間作桃樹改變了枯萎病石榴根際的細(xì)菌多樣性，改善土壤微生態(tài)平衡，對利用間作桃樹控制石榴枯萎病的發(fā)生及擴(kuò)散提供了一定的參考。