黃 嬌 羅杰偉 韓 麗 楊 莉 魏 瑩

(1 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川省南充市 637000，電子郵箱：jxkcg73@163.com；川北醫(yī)學(xué)院2 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，3 藥學(xué)院，四川省南充市 637800)

非甾體抗炎藥具有廣泛的鎮(zhèn)痛、抗炎和解熱作用，是世界上使用最廣泛的藥物之一[1]。然而，阿司匹林等非甾體抗炎藥可引起各種胃腸道副作用，包括胃腸道潰瘍、出血和穿孔，而這些可能是致命性的[2]。因此，需要探索保護(hù)應(yīng)用非甾體抗炎藥患者胃黏膜完整性的措施。研究表明，阿司匹林誘導(dǎo)人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1損傷的同時，可增加腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6的表達(dá)[3]。核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信號通路參與阿司匹林誘導(dǎo)的胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1損傷過程[3]。而孟魯司特可以抑制炎癥因子IL-1β誘導(dǎo)的黏連蛋白表達(dá)[4]，并可抑制NF-κB信號通路的激活[5]。然而，孟魯司特是否可以減輕阿司匹林誘導(dǎo)的胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1損傷，目前尚未可知。因此，本研究以胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1為對象，利用阿司匹林誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞損傷，觀察孟魯司特預(yù)處理對細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探索其潛在的作用機(jī)制，從而為防治胃黏膜損傷的深入研究提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。阿司匹林(含量≥99%，貨號：A2093)、四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT；貨號：M2128)、NF-κB信號通路激活劑脂多糖(貨號：L2630)購自美國Sigma公司；RNA提取試劑盒(貨號：D203-01)購自中國GenStar BioSolutions公司；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)素Ⅴ(annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate，Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(貨號：KGA108)、細(xì)胞周期檢測試劑盒(貨號：KGA511)購自江蘇凱基生物公司；細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1；貨號：2978)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2；貨號：2546)、B細(xì)胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2，Bcl-2；貨號：4223)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax；貨號：5023)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved-Caspase-3；貨號：9664)、細(xì)胞核因子κB抑制蛋白α(inhibitor of nuclear factor κBα，IκBα；貨號：4812)、磷酸化IκBα(phosphorylated IκBα，p-IκBα；貨號：2859)、p65(貨號：8242)、磷酸化p65(phosphorylated p65，p-p65；貨號：3033)蛋白抗體購自美國Cellular Signaling Technology公司；TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫吸附檢測(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(貨號分別為：E-EL-H0109c、E-EL-H0102c)購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛檢測試劑盒(貨號分別為：C0016、S0109、S0131)購自碧云天生物技術(shù)公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：RR036A)、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(貨號：RR820A)購自日本TaKaRa公司。二甲基亞砜購自上海梵態(tài)生物(貨號：FT20937yy)；RIPA裂解液購自北京索萊寶公司(貨號：R0015)。

1.2 GES-1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將GES-1細(xì)胞加入含10%胎牛血清的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將生長狀態(tài)良好的GES-1細(xì)胞(1×105個/孔)接種于96孔板，每孔100 μL。將藥物用培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。GES-1細(xì)胞分為7組：(1)空白組，為正常培養(yǎng)的GES-1細(xì)胞；(2)阿司匹林組，使用18.5 mmoL/L阿司匹林100 μL處理GES-1細(xì)胞24 h[6]；(3)孟魯司特低濃度組、孟魯司特中濃度組、孟魯司特高濃度組，分別使用10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L孟魯司特[7]預(yù)處理GES-1細(xì)胞2 h后，使用18.5 mmoL/L阿司匹林處理24 h，給藥總量為100 μL；(4)孟魯司特+阿司匹林組，使用40 μmol/L孟魯司特預(yù)處理GES-1細(xì)胞2 h，使用18.5 mmoL/L阿司匹林處理24 h，給藥總量為100 μL；(5)孟魯司特+阿司匹林+脂多糖組，使用40 μmol/L孟魯司特預(yù)處理GES-1細(xì)胞2 h后，然后使用18.5 mmoL/L阿司匹林、2.5μmoL/L 脂多糖同時處理24 h，給藥總量為100 μL。處理后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測GES-1細(xì)胞增殖 按1×105個/mL密度將各組GES-1細(xì)胞接種于96孔板中，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔細(xì)胞加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，37℃培養(yǎng)4 h，加入二甲基亞砜150 μL，37℃搖床振蕩培養(yǎng)10 min，采用美國BioTek公司EXL800酶標(biāo)儀測定GES-1細(xì)胞在490 nm處的吸光度值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測GES-1細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期 用磷酸鹽緩沖溶液重懸細(xì)胞，將各組GES-1細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個/mL，參照細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書的步驟，使用500 μL緩沖液懸浮細(xì)胞，加入Annexin V-FITC 5 μL混勻，加入碘化丙啶5 μL混勻，室溫遮光反應(yīng)15 min，置于美國BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀中檢測GES-1細(xì)胞凋亡率。根據(jù)細(xì)胞周期檢測試劑盒說明書的步驟，將各組GES-1細(xì)胞密度調(diào)整為1×106/mL，取1 mL細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)9次。

1.5 檢測氧化應(yīng)激指標(biāo)LDH、SOD和丙二醛 收集各組GES-1細(xì)胞上清液，分別按照說明書的步驟進(jìn)行LDH、SOD和丙二醛水平檢測。

1.6 ELISA法檢測炎癥因子TNF-α和IL-6水平 收集各組GES-1細(xì)胞上清，按照ELISA試劑盒說明檢測TNF-α和IL-6水平。

1.7 定量PCR檢測CyclinD1 mRNA和CDK2 mRNA表達(dá) 按照RNA提取試劑盒說明書的步驟提取各組細(xì)胞的總RNA。反轉(zhuǎn)錄體系共20 μL，參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將反應(yīng)條件設(shè)置為42℃ 30～50 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))和85℃ 5 s(反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng))，得到模板cDNA。定量PCR反應(yīng)體系共50 μL，包括25 μL SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2×)、2 μL PCR上游引物、2 μL PCR下游引物、1 μL ROX 參比染料(50×)、4 μL cDNA和16 μL雙蒸水。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，40個循環(huán)，60℃退火延伸1 min。ABI 7300熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。以β肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參。采用 2-ΔΔCt法計算CyclinD1 mRNA和CDK2 mRNA的相對表達(dá)量。引物由上海生工公司設(shè)計合成，序列如下：CyclinD1上游引物為 5′-GCATCTACACCGACAACTCCAT-3′，下游引物為5′-GTTTGTTCTCCTCCGCCTCT-3′；CDK2上游引物為5′-AATAGGCTGGGAGACTGAAGACT-3′，下游引物為5′-ATCCTTGGCAACTGAACAACTAA-3′；β-actin 上游引物為5′-TCATGAAGTGTGACGTGGACAT-3′，下游引物為5′-CTCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3′。實(shí)驗(yàn)重復(fù)9次。

1.8 蛋白免疫印跡法檢測CyclinD1、CDK2、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3、p-IκBα、IκBα、p-p65、p65蛋白表達(dá) 使用RIPA裂解液提取各組GES-1細(xì)胞的總蛋白，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入目的蛋白一抗(均為1 ∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，次日用Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液洗膜(10 min/次，共3次)，加入二抗(1 ∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h，TBST洗膜(10 min/次，共3次)，顯色、曝光，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，分析目的蛋白的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)9次。

2 結(jié) 果

2.1 孟魯司特預(yù)處理對阿司匹林誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞增殖抑制及細(xì)胞周期變化的影響 與空白組比較，阿司匹林組的GES-1細(xì)胞增殖抑制率、G0/G1期細(xì)胞比例升高，S期細(xì)胞比例下降，CyclinD1和CDK2的mRNA和蛋白表達(dá)量降低(均P<0.05)。阿司匹林組、孟魯司特低濃度組、孟魯司特中濃度組、孟魯司特高濃度組GES-1細(xì)胞增殖抑制率、G0/G1期細(xì)胞比例依次下降，S期細(xì)胞比例依次升高，CyclinD1和CDK2的mRNA和蛋白表達(dá)量依次升高(均P<0.05)。見表1、表2和圖1。

表1 5組GES-1細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖抑制率的比較 (±s，%)

表2 5組細(xì)胞CyclinD1和CDK2 mRNA和蛋白相對表達(dá)量的比較 (±s)

圖1 5組GES-1細(xì)胞中CyclinD1和CDK2蛋白表達(dá)

2.2 孟魯司特預(yù)處理對阿司匹林誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞凋亡的影響 與空白組比較，阿司匹林組的GES-1細(xì)胞凋亡率以及Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達(dá)量升高，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量降低(均P<0.05)。阿司匹林組、孟魯司特低濃度組、孟魯司特中濃度組、孟魯司特高濃度組的GES-1細(xì)胞凋亡率以及Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達(dá)量依次降低，而Bcl-2蛋白相對表達(dá)量依次升高(均P<0.05)。見表3、圖2。

表3 5組GES-1細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的比較(±s)

圖2 5組GES-1細(xì)胞凋亡情況及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.3 孟魯司特預(yù)處理對阿司匹林誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞中氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎癥因子表達(dá)的影響 與空白組比較，阿司匹林組的GES-1細(xì)胞中LDH、丙二醛、TNF-α、IL-6水平升高，SOD活性降低(均P<0.05)。阿司匹林組、孟魯司特低濃度組、孟魯司特中濃度組、孟魯司特高濃度組GES-1細(xì)胞的LDH、丙二醛、TNF-α、IL-6水平依次降低，SOD活性依次升高(均P<0.05)。見表4。

表4 5組GES-1細(xì)胞中LDH、SOD和MDA水平的比較(±s)

2.4 孟魯司特預(yù)處理對阿司匹林誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞中NF-κB信號通路的影響 與空白組比較，阿司匹林組的GES-1細(xì)胞中p-IκBα、p-p65蛋白相對表達(dá)量均增加(P<0.05)，但I(xiàn)κBα、p65蛋白相對表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。阿司匹林組、孟魯司特低濃度組、孟魯司特中濃度組、孟魯司特高濃度組GES-1細(xì)胞中p-IκBα、p-p65蛋白相對表達(dá)量均依次下降(均P<0.05)，但各組間IκBα、p65蛋白相對表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表5、圖3。

表5 5組細(xì)胞GES-1中p-IκBα、IκBα、p-p65和p65蛋白相對表達(dá)量的比較(±s)

圖3 蛋白免疫印跡法檢測胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中p-IκBα、IκBα、p-p65和p65蛋白表達(dá)

2.5 NF-κB信號通路激活劑逆轉(zhuǎn)孟魯司特對GES-1細(xì)胞的保護(hù)作用 (1)細(xì)胞增殖方面：與孟魯司特+阿司匹林組比較，孟魯司特+阿司匹林+脂多糖組GES-1細(xì)胞增殖抑制率、G0/G1期細(xì)胞比例增高，而S期細(xì)胞比例、CyclinD1、CDK2蛋白相對表達(dá)量降低(均P<0.05)。(2)細(xì)胞凋亡方面：與孟魯司特+阿司匹林組比較，孟魯司特+阿司匹林+脂多糖組細(xì)胞凋亡率、Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達(dá)量增加，而Bcl-2蛋白相對表達(dá)量降低(均P<0.05)。見表6、表7、圖4。

表6 兩組GES-1細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞周期及相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的比較(±s)

表7 兩組GES-1細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的比較(±s)

圖4 兩組GES-1細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.6 脂多糖部分逆轉(zhuǎn)孟魯司特對人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中炎癥反應(yīng)和NF-κB信號通路的作用 與孟魯司特+阿司匹林組比較，孟魯司特+阿司匹林+脂多糖組GES-1細(xì)胞上清液的TNF-α、IL-6水平以及p-IκBα、p-p65蛋白相對表達(dá)量均升高(均P<0.05)，但I(xiàn)κBα、p65蛋白相對表達(dá)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表8、圖5。

表8 兩組GES-1細(xì)胞的炎癥因子水平和NF-κB信號通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的比較 (±s)

圖5 蛋白免疫印跡法檢測胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中p-IκBα、IκBα、p-p65和p65蛋白表達(dá)

3 討 論

非甾體消炎藥具有良好的解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗風(fēng)濕等作用，在凝血、卒中和心肌缺血方面有良好的應(yīng)用前景[8]。隨著疼痛、炎癥和心血管疾病發(fā)生率的增加，阿司匹林的消耗量將會更高[9]。因此，非甾體類藥物被廣泛應(yīng)用于臨床中。然而，此類藥物的不恰當(dāng)使用(如過量、長期或錯誤的配方)是造成胃損傷的主要原因，表現(xiàn)為胃黏膜侵蝕、出血，甚至潰瘍，限制了其臨床應(yīng)用[8]。本研究利用阿司匹林誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1損傷，結(jié)果顯示，與空白組比較，阿司匹林組細(xì)胞增殖抑制率、G0/G1期細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡率、促凋亡因子Bax和Cleaved-Caspase-3的表達(dá)均增高，CyclinD1、CDK2和抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)均降低(均P<0.05)，這提示阿司匹林可抑制細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞于G0/G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。阿司匹林導(dǎo)致的胃黏膜損傷與炎癥、氧化損傷密切相關(guān)[10]。當(dāng)阿司匹林損傷胃黏膜時，TNF-α和IL-6等炎性因子會大量產(chǎn)生[10]。LDH、SOD和丙二醛可作為評估氧化損傷的指標(biāo)。本研究中，與空白組比較，阿司匹林組GES-1細(xì)胞上清液的LDH、丙二醛、TNF-α和IL-6水平均升高，而抗氧化酶SOD的活性降低(均P<0.05)，這提示阿司匹林通過炎癥反應(yīng)和氧化損傷導(dǎo)致GES-1細(xì)胞損傷，與既往研究結(jié)果[10]相符。

孟魯司特是一種半胱氨酸白三烯受體拮抗劑，臨床常用來治療哮喘和過敏性鼻炎，也用于治療運(yùn)動引起的支氣管痙攣或小兒過敏性紫癜[11-13]。既往研究表明，孟魯司特對呼吸道合胞病毒感染引起的人支氣管上皮細(xì)胞16HBEC的炎癥反應(yīng)具有抑制作用，能明顯降低IL-6、TNF-α和IL-1β的水平，并減少活性氧簇含量[7]。在大鼠關(guān)節(jié)炎模型中，孟魯司特可降低大鼠血液和關(guān)節(jié)組織氧化應(yīng)激標(biāo)志物(脂質(zhì)過氧化、蛋白羰基和一氧化氮)水平，并顯著降低細(xì)胞炎性因子IL-1β等的水平[14]。此外，孟魯司特還可有效拮抗阿奇霉素所致的大鼠腎臟丙二醛含量升高和SOD活性降低，減輕其氧化損傷[15]。然而，孟魯司特對阿司匹林誘導(dǎo)的胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1的作用尚不清楚。本研究中使用不同濃度的孟魯司特進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果顯示，其可減輕阿司匹林誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡，下調(diào)促凋亡因子的表達(dá)以及LDH、丙二醛、炎癥因子水平，并上調(diào)細(xì)胞周期蛋白、抗凋亡因子的表達(dá)，提高抗氧化酶SOD的活性，且上述作用具有一定的濃度依賴性，說明孟魯司特對阿司匹林損傷的胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1具有保護(hù)作用，減輕阿司匹林誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化及炎癥反應(yīng)，這為胃黏膜損傷的臨床診治策略提供了新的參考。

NF-κB是介導(dǎo)細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞炎癥、凋亡和免疫應(yīng)答等作用的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子[16]。研究顯示，NF-κB信號通路在胃黏膜損傷中發(fā)揮著重要作用[17-18]。在本研究中，阿司匹林可導(dǎo)致GES-1細(xì)胞中NF-κB信號通路相關(guān)蛋白p-IκBα、p-p65水平升高(P<0.05)，但對IκBα、p65蛋白表達(dá)無明顯影響(P>0.05)。而不同濃度孟魯司特可降低p-IκBα、p-p65蛋白的表達(dá)量(P<0.05)，但不影響IκBα、p65蛋白表達(dá)(P>0.05)，提示孟魯司特可以抑制NF-κB信號通路的激活。另外，我們應(yīng)用NF-κB信號通路激活劑脂多糖進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，與孟魯司特+阿司匹林組比較，孟魯司特+阿司匹林+脂多糖組GES-1細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率及促凋亡相關(guān)因子表達(dá)均升高，出現(xiàn)S期細(xì)胞周期阻滯，炎癥因子及NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)均上調(diào)，即NF-κB信號通路激活劑部分逆轉(zhuǎn)了孟魯司特對阿司匹林所致GES-1細(xì)胞損傷的預(yù)防和保護(hù)作用。這些結(jié)果表明調(diào)控NF-κB信號通路可能是孟魯司特保護(hù)阿司匹林損傷GES-1細(xì)胞的重要途徑之一。

綜上所述，采用孟魯司特預(yù)處理可減輕阿司匹林誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能與減輕氧化損傷和炎癥反應(yīng)、調(diào)控NF-κB信號通路有關(guān)。然而，本研究僅觀察了孟魯司特在體外保護(hù)胃黏膜上皮細(xì)胞損傷的效果，其在體內(nèi)的功能和作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。