李志坤 王希柱 宋巧鳳

(河北省唐山市人民醫(yī)院心電圖室,唐山市 063000，電子郵箱：mia55462@163.com)

心律失常是臨床常見病和高發(fā)病，心肌缺血及缺血后再灌注等多種心臟疾病均可引起心律失常，主要表現(xiàn)為期前收縮、房顫、心動(dòng)過速等[1]。心律失?？稍黾蛹膊≈委熾y度，尤其是發(fā)生惡性心律失常的患者，心源性猝死風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[2-3]。因此，尋找有效藥物對(duì)抗心律失常并探討其調(diào)控機(jī)制，對(duì)心律失常的防治有重要臨床意義。白藜蘆醇(resveratrol，Res)屬于多酚類化合物，廣泛存在于葡萄皮和花生中，具有抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種生物學(xué)作用，臨床常用于防治血脂異常、冠心病等疾病[4-5]。Res在心血管疾病的防治中有潛在應(yīng)用價(jià)值，但關(guān)于其對(duì)心律失常的防治作用鮮有研究報(bào)道。鑒于此，本研究通過建立烏頭堿誘發(fā)的心律失常大鼠模型，觀察Res對(duì)大鼠心律失常及心電圖的影響，并進(jìn)一步探討其影響機(jī)制，為臨床防治心律失常提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：80只無特定病原體級(jí)雄性Wistar大鼠，7周齡，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011。大鼠自由進(jìn)食和飲水，飼養(yǎng)于(25±1)℃、60%相對(duì)濕度、12 h明暗交替環(huán)境。

1.1.2 主要試劑和儀器：烏頭堿、Res(美國(guó)Sigma公司)，沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(silent information regulator 2 related enzyme 1，SIRT1)特異性抑制劑EX-527(英國(guó)Tocris Bioscience公司)，二喹啉甲酸蛋白定量分析試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，兔抗大鼠SIRT1、腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)、磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK,p-AMPK)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α，PGC-1α)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)一抗(美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)ab8277、ab273598、ab32112、ab54481、ab8227)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)SA134)。XD-7100型心電圖儀(上海醫(yī)用電子儀器廠)，CheniDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.2 分組及干預(yù) 按體重大小連續(xù)編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法將80只大鼠分為模型組、模型+Res組、模型+Res+EX-527組、對(duì)照組，每組各20只。干預(yù)方法：(1)模型+Res組，按照100 mg/kg給予Res灌胃(Res溶于5%羧甲基纖維素鈉，Res的最終濃度為10 mg/mL)，1次/d，連續(xù)2周；末次灌胃30 min后，使用烏頭堿誘發(fā)心律失常。(2)模型+Res+EX-527組，按照100 mg/kg給予Res灌胃，30 min后給予EX-527 10 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射給藥，1次/d，連續(xù)2周；末次灌胃30 min后，使用烏頭堿誘發(fā)心律失常。(3)模型組：按照10 mL/kg給予5%羧甲基纖維素鈉灌胃，1次/d，連續(xù)2周；末次灌胃后，使用烏頭堿誘發(fā)心律失常。(4)對(duì)照組：按照10 mL/kg給予5%羧甲基纖維素鈉灌胃，1次/d，連續(xù)2周；末次灌胃后，按1 mL/kg體質(zhì)量舌下靜脈注射生理鹽水。

1.3 烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常模型的建立及鑒定 腹腔注射1%戊巴比妥鈉(6 mL/kg)麻醉大鼠后，取仰臥位固定，連接心電圖儀，將針狀電極插入四肢末端及劍突皮下，麻醉后連續(xù)監(jiān)測(cè)心電圖5 min，模型組、模型+Res組、模型+Res+EX-527組大鼠按1 mL/kg體質(zhì)量舌下靜脈注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.002%的烏頭堿(對(duì)照組舌下注射等量生理鹽水)，4 min內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)檢測(cè)心電圖出現(xiàn)室性心動(dòng)過速、心室顫動(dòng)等波形時(shí)，判定為模型制備成功。60只舌下注射烏頭堿的大鼠中，共死亡14只，予以剔除，最終模型組14只、模型+Res組17只、模型+Res+EX-527組15只進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組20只全部存活，進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 心電圖監(jiān)測(cè)及心律失常評(píng)分 (1)心電圖監(jiān)測(cè)：記錄發(fā)生心律失常的大鼠數(shù)量，心律失常開始時(shí)間(即舌下靜脈注射后至出現(xiàn)心律失常異常波形的時(shí)間)；記錄完成舌下注射烏頭堿后4 min內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)檢測(cè)心電圖中的Q-T間期、P-R間期、QRS波群時(shí)間；記錄麻醉前、造模后即刻(完成舌下注射烏頭堿后)以及造模后15 min、30 min、60 min時(shí)各組大鼠心率。(2)心律失常評(píng)分[6]：根據(jù)舌下注射烏頭堿后4 min內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)檢測(cè)的心電圖情況進(jìn)行評(píng)分。0分為無心律失常；1分為室性心動(dòng)過速或心室顫動(dòng)等心律失常異常波持續(xù)時(shí)間短于10 s；2分為心律失常異常波持續(xù)時(shí)間11～30 s；3分為心律失常異常波持續(xù)時(shí)間31～90 s；4分為心律失常異常波持續(xù)時(shí)間91～180 s和可逆心室顫動(dòng)波持續(xù)時(shí)間短于10 s；5分為心律失常異常波持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)于180 s和可逆心室顫動(dòng)波持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)于10 s；6分為出現(xiàn)不可逆性心室顫動(dòng)波。

1.5 組織取材及保存 造模60 min后，處死各組大鼠，剖開胸腔暴露心臟，各組采用隨機(jī)數(shù)字表法取7只，采用預(yù)冷生理鹽水灌注心臟，灌注液清亮后，用4%多聚甲醛繼續(xù)灌注，結(jié)束后立即取心臟組織，保存于4%多聚甲醛中備用。各組另取7只僅灌注生理鹽水，取心肌組織保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 心肌組織病理學(xué)觀察 取固定于4%多聚甲醛中的心肌組織，經(jīng)脫水、透明后，常規(guī)石蠟包埋，制備厚度為5 μm的連續(xù)切片；切片經(jīng)脫蠟、梯度乙醇水化后，進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，最后中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理學(xué)變化。

1.7 心肌組織中SIRT1、AMPK、p-AMPK、PGC1α蛋白的檢測(cè) 取保存于-80℃的心肌組織75 mg，加入液氮制成凍干粉，加入1 mL蛋白裂解液，4℃靜置孵育20 min，4℃預(yù)冷離心機(jī)12 000 r/min離心15 min(離心半徑12 cm)，取上清液，采用二喹啉甲酸法進(jìn)行蛋白定量。取30 μg蛋白樣品與等量上樣緩沖液混勻，沸水浴變性8～10 min，12 000 r/min離心15 min(離心半徑12 cm)，取上清液，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(10%分離膠、5%濃縮膠)，濕轉(zhuǎn)法將分離蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，TBST洗膜后封閉液封閉2 h；加入稀釋一抗[SIRT1、AMPK、p-AMPK(1 ∶500)，PGC1α、β-actin(1 ∶1 000)]，4℃孵育過夜；TBST洗滌后加入稀釋二抗(1 ∶5 000)，常溫孵育2 h，暗室中曝光顯影。以目的條帶平均光密度值與β-actin光密度值的比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 3個(gè)模型組大鼠心律失常發(fā)生情況及心律失常評(píng)分的比較 與模型組比較，模型+Res組室性心動(dòng)過速、心室顫動(dòng)的發(fā)生率降低，室性心動(dòng)過速、心室顫動(dòng)開始時(shí)間延遲，心律失常評(píng)分降低(均P<0.05)；與模型+Res組比較，模型+Res+EX-527組室性心動(dòng)過速、心室顫動(dòng)開始時(shí)間提前，心律失常評(píng)分升高(均P<0.05)。見表1。

表1 心律失常發(fā)生率、開始時(shí)間及心律失常評(píng)分的比較

2.2 4組大鼠心電圖監(jiān)測(cè)指標(biāo)變化 與對(duì)照組比較，其他3組Q-T間期、P-R間期延長(zhǎng)，QRS波群增寬(P<0.05)；與模型組比較，模型+Res組Q-T間期、P-R間期縮短，QRS波群縮窄(P<0.05)；與模型+Res組比較，模型+Res+EX-527組Q-T間期、P-R間期延長(zhǎng)，QRS波群增寬(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠心電圖監(jiān)測(cè)指標(biāo)的比較(±s，ms)

2.3 4組大鼠干預(yù)期間心率變化 4組間心率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=11.200，P組間<0.001)，其中與對(duì)照組比較，其他3組造模后即刻、造模后15 min、30 min、60 min心率均升高(均P<0.05)；模型+Res組造模后15 min、30 min、60 min心率均低于模型組(均P<0.05)；模型+Res+EX-527組造模15 min、30 min、60 min心率均高于模型+Res組(均P<0.05)。心率有隨時(shí)間變化的趨勢(shì)(F時(shí)間=56.137，P時(shí)間<0.001)，其中模型組、模型+Res組、模型+Res+EX-527組造模各時(shí)間點(diǎn)心率均高于麻醉前的心率(均P<0.05)；隨造模時(shí)間的延長(zhǎng)，模型+Res組心率逐漸降低(P<0.05)，而模型組、模型+Res+EX-527組無明顯變化(P>0.05)。組間與時(shí)間存在交互效應(yīng)(F交互=40.216，P交互<0.001)。見表3。

表3 4組大鼠干預(yù)期間心率變化(±s，次/min)

2.4 4組大鼠心肌組織病理學(xué)改變 HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組心肌結(jié)構(gòu)清晰，橫紋排列整齊，細(xì)胞核完整；模型組可見片狀心肌嗜伊紅染色增強(qiáng)，且呈波浪樣變，偶見間質(zhì)出血；模型+Res組心肌呈波浪樣變，少量點(diǎn)狀心肌嗜伊紅染色增強(qiáng)；模型+Res+EX-527組心肌組織病變較模型+Res組加重。見圖1。

對(duì)照組 模型組 模型+Res組 模型+Res+EX-527組

2.5 4組大鼠心肌組織中SIRT1、AMPK、p-AMPK、PGC1α蛋白表達(dá)量的比較 4組AMPK蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，其他3組SIRT1、p-AMPK、PGC1α蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低(P<0.05)；與模型組比較，模型+Res組SIRT1、p-AMPK、PGC1α蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高(P<0.05)；與模型+Res組比較，模型+Res+EX-527組SIRT1、p-AMPK、PGC1α蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低(均P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 4組大鼠心肌組織各蛋白的表達(dá)情況

表4 4組大鼠SIRT1、AMPK、p-AMPK、PGC1α蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(±s)

3 討 論

心律失常發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，多源于心臟自律異?；蚣?dòng)傳導(dǎo)障礙，可單獨(dú)發(fā)病也可伴發(fā)其他心血管疾病，該病患者心肌受損嚴(yán)重，且心源性猝死發(fā)生率明顯增高，生命健康受到嚴(yán)重影響[7]。目前，臨床尚缺乏有效的抗心律失常西藥，且西藥副作用多，臨床應(yīng)用的局限性強(qiáng)[8]。研究顯示，室性心律失常發(fā)病機(jī)制與多種離子通道功能障礙有關(guān)，烏頭堿中毒引發(fā)的心律失?？纱龠M(jìn)心肌細(xì)胞鈉離子內(nèi)流及膜去極化，同時(shí)可誘發(fā)多源性異位節(jié)律點(diǎn)，從而誘發(fā)心律失常的發(fā)生[9]。有關(guān)抗心律失常的研究表明，中藥具有改善多離子通道功能異常的作用[10]，故尋找有效中藥對(duì)抗心律失常有重要意義。

心電圖是臨床診斷心律失常的主要方法，本研究應(yīng)用舌下注射烏頭堿法誘發(fā)大鼠心律失常，心電圖顯示模型組室性心動(dòng)過速發(fā)生率為100%，心室顫動(dòng)發(fā)生率高于90%，造模后心率明顯升高，Q-T間期、P-R間期延長(zhǎng)，QRS波群增寬，造模60 min后HE染色提示片狀心肌嗜伊紅染色增強(qiáng)，且呈波浪樣變，偶見間質(zhì)出血，說明成功建立心律失常大鼠模型。Res是從自然界植物中提取的天然活性成分，在自然界中分布廣泛，具有潛在藥用價(jià)值。近年有研究顯示，Res與心臟疾病、炎癥、糖脂代謝異常及腫瘤等多種疾病的防治均有密切聯(lián)系[11]。姜曉曉等[12]在研究Res對(duì)心肌梗死大鼠心臟神經(jīng)重塑過程中發(fā)現(xiàn)，Res可有效預(yù)防室性心律失常及心源性猝死，與王光宇等[13]針對(duì)Res對(duì)心肌梗死后心律失常影響的研究結(jié)果相似。本研究應(yīng)用Res干預(yù)后再采用烏頭堿誘發(fā)心律失常，結(jié)果顯示，與模型組比較，模型+Res組室性心動(dòng)過速、心室顫動(dòng)發(fā)生率降低，室性心動(dòng)過速、心室顫動(dòng)開始時(shí)間延遲，心律失常評(píng)分降低，造模15 min及以后心率降低，Q-T間期、P-R間期縮短，QRS波群縮窄，HE染色提示心肌組織病變減輕，這提示Res具有對(duì)抗烏頭堿誘發(fā)心律失常的作用。

SIRT1是在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的脫乙?；?，與細(xì)胞能量代謝、細(xì)胞衰老、基因轉(zhuǎn)錄等多種生物學(xué)過程關(guān)系緊密[14]。AMPK是細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵因子，可通過調(diào)控細(xì)胞凋亡、蛋白降解等過程維持細(xì)胞能量供需平衡。在能量限制或運(yùn)動(dòng)等應(yīng)激狀態(tài)下，AMPK激活SIRT1，延長(zhǎng)細(xì)胞衰老過程[15]。PGC1α是SIRT1去乙酰化底物，應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞的能量代謝異?？墒筍IRT1去乙?；礁淖?，從而導(dǎo)致PGC1α轉(zhuǎn)錄活性相應(yīng)地發(fā)生改變[16]。Kim等[17]的研究顯示，斑馬魚SIRT1基因敲除后，由于缺乏完整能量代謝系統(tǒng)導(dǎo)致斑馬魚對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力降低，壽命縮短。Ma等[18]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1基因敲除的小鼠可表現(xiàn)出糖尿病性心肌病癥狀，機(jī)體線粒體能量代謝功能異常，應(yīng)用Res可激活SIRT1-AMPK-PGC1α信號(hào)通路，改善心肌損傷。上述研究均說明SIRT1-AMPK-PGC1α信號(hào)通路在心肌組織能量代謝途徑中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，但目前尚無研究證實(shí)Res是否通過該信號(hào)通路發(fā)揮心律失常保護(hù)作用。本研究應(yīng)用Res預(yù)防性干預(yù)后，SIRT1、p-AMPK、PGC1α蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，提示Res可激活SIRT1-AMPK-PGC1α信號(hào)通路；進(jìn)一步應(yīng)用SIRT1特異性抑制劑干預(yù)后，SIRT1-AMPK-PGC1α信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)，且大鼠心率、心電圖監(jiān)測(cè)指標(biāo)及心肌組織病變均較模型+Res組變差，說明Res可能通過激活SIRT1-AMPK-PGC1α信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)抗烏頭堿誘發(fā)的大鼠心律失常的作用。

綜上所述，Res可明顯對(duì)抗烏頭堿誘發(fā)的大鼠心律失常，其機(jī)制可能與激活SIRT1-AMPK-PGC1α信號(hào)通路有關(guān)。本研究的結(jié)果或可為Res相關(guān)藥物的研發(fā)和應(yīng)用提供參考，同時(shí)為心律失常的臨床防治提供新的治療靶點(diǎn)。在下一步的研究中應(yīng)深入探討Res對(duì)SIRT1-AMPK-PGC1α信號(hào)通路的直接調(diào)控機(jī)制及下游作用靶點(diǎn)，以提供更充分的證據(jù)支持本研究結(jié)論。