郭宏偉 劉迪龑 胡義奎 劉濤生 譚龍君 馮 瓊

(武漢市武昌醫(yī)院/武漢科技大學(xué)附屬武昌醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科二病區(qū)，湖北省武漢市 430063，電子郵箱：1127246605@qq.com)

卒中后認(rèn)知功能障礙是指在卒中這一臨床事件后6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)達(dá)到認(rèn)知障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)的一系列綜合征，其危險(xiǎn)因素包括高齡、受教育程度低、復(fù)發(fā)性卒中等[1]。近年來，血小板內(nèi)皮聚集受體1(platelet endothelial aggregation receptor 1，PEAR1)基因位點(diǎn)rs12041331純合突變被證實(shí)與卒中復(fù)發(fā)以及抗血小板藥物療效下降有關(guān)[2]。為了排除復(fù)發(fā)性卒中對(duì)卒中后神經(jīng)功能缺損和認(rèn)知功能障礙的影響，本研究選取初發(fā)腦梗死患者為研究對(duì)象，分析其卒中后神經(jīng)功能缺損和認(rèn)知功能障礙的發(fā)病與PEAR1基因位點(diǎn)rs12041331單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1月至2020年1月在武漢市武昌醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診或住院治療的150例初發(fā)腦梗死患者為研究對(duì)象。所有患者均符合全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，并在我院經(jīng)顱腦CT或MRI檢查確診為腦梗死，排除短暫性腦缺血發(fā)作或小卒中患者、嚴(yán)重精神障礙和嚴(yán)重器官功能衰竭患者。根據(jù)PEAR1基因位點(diǎn)rs12041331的不同分型，將患者分為野生型組(GG組，68例)、純合突變型組(AA組，48例)、雜合突變型組(GA組，34例)。所有研究對(duì)象均自愿參加本研究并簽署知情同意書。本研究獲得武漢市武昌醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理道德委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 一般臨床資料：收集患者一般信息和既往病例資料。測(cè)量所有患者的身高、體重，計(jì)算體質(zhì)指數(shù)。高血壓定義為收縮壓≥140 mmHg和/或舒張壓≥90 mmHg，或正在接受降壓治療。糖尿病定義為空腹血糖≥7.0 mmol/L，或OGTT后2 h血糖≥11.1 mmol/L，或正在接受降糖治療。吸煙定義為幾乎每日吸煙，平均每日吸煙1支以上，時(shí)間>1年。飲酒定義為幾乎每日飲酒，平均每日飲酒50 g以上，時(shí)間>1年。高齡定義為年齡>75歲。低教育程度定義為中學(xué)以下文化程度或未接受過任何教育。于患者入院后次日，采集清晨空腹靜脈血5 mL，采用日本東芝全自動(dòng)生化檢測(cè)儀測(cè)定血脂四項(xiàng)水平。

1.2.2 神經(jīng)功能缺損程度評(píng)價(jià)：入組時(shí)采用美國國立衛(wèi)生院卒中量表(National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS)評(píng)價(jià)患者神經(jīng)功能缺損程度[4]，評(píng)價(jià)內(nèi)容包括患者意識(shí)水平、面癱、上肢運(yùn)動(dòng)等方面，評(píng)分越高表示患者神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.2.3 認(rèn)知功能評(píng)價(jià)：取入組時(shí)以及卒中后6個(gè)月內(nèi)每月1次的簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查量表(Mini-Mental State Examination，MMSE)評(píng)分[5]，其中最大分值作為統(tǒng)計(jì)值，以此評(píng)價(jià)患者的認(rèn)知功能。目前MMSE是國內(nèi)外應(yīng)用最廣的認(rèn)知篩查量表，評(píng)價(jià)內(nèi)容包括時(shí)間定向力、地點(diǎn)定向力、即刻記憶、注意力及計(jì)算力、延遲記憶、語言、視空間。量表共30項(xiàng)題目，每項(xiàng)回答正確得1分，回答錯(cuò)誤或答不知道計(jì)為0分，量表總分范圍為0～30分，量表總分越高表示認(rèn)知功能越好。

1.2.4 PEAR1基因位點(diǎn)rs12041331 SNP的檢測(cè)：入組后次日清晨抽取所有患者空腹外周靜脈血3 mL，-20℃保存于乙二胺四乙酸管中，按照DNA提取試劑盒(北京原平皓生物技術(shù)有限公司)說明書提取DNA，保存于-20℃。采用PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)及直接測(cè)序法檢測(cè)基因型。PCR體系包括基因組DNA 2 μL、上下游引物各 5 μL、2×Taq Mix 12.5 μL(北京艾德萊生物科技有限公司)，加超純水0.5 μL補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增條件為94℃ 3 min，94℃ 30 s，58.5℃和59.5℃各30 s，72℃ 30 s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后，利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。rs12041331擴(kuò)增引物正向序列為5′-CACTAATCTTATCCCCATTTTCTAGGTG-3′，反向?yàn)?′-GCCCTCTCAGCCTCCGAGC-3′。內(nèi)切酶為Becl，酶切片段AA大小為178 bp、230 bp，酶切片段AG大小為408 bp、178 bp、230 bp，酶切片段GG大小為408 bp。取上述聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物2 μL，內(nèi)切酶1 μL，10×NEB緩沖液2 μL，滅菌離子雙蒸水5 μL，反應(yīng)總體積10 μL。37℃酶切至少1 h終止酶切反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠，GelRed染色，140 V電壓、300 mA電流穩(wěn)壓電泳40 min，凝膠系統(tǒng)成像，觀察結(jié)果并照相。樣本測(cè)序及PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2 結(jié) 果

AA組患者的高齡者比例、吸煙者比例高于GG組，LDL-C水平和NIHSS評(píng)分均高于GG組和GA組(均P<0.05)，而MMSE評(píng)分低于GG組和GA組(均P<0.05)。見表1。

表1 3組患者臨床資料的比較

組別n吸煙[n(%)]飲酒[n(%)]總膽固醇(x±s,mmol/L)三酰甘油(x±s,mmol/L)LDL-C(x±s,mmol/L)HDL-C(x±s,mmol/L)MMSE評(píng)分(x±s,分)GG組6817(25.00)12(17.65)4.29±1.371.81±0.862.41±1.081.51±0.7225.21±3.89AA組4823(47.92)#9(18.75)4.41±1.521.89±0.902.96±1.16#?1.45±0.6720.12±3.12#?GA組349(26.47)7(20.59)4.37±1.411.84±0.882.45±1.121.46±0.7023.87±3.45 F/χ2值7.4860.1300.1050.1173.7950.12029.352P值0.0240.9370.9000.8900.0250.887<0.001

3 討 論

PEAR1是一種參與血小板活化和巨核細(xì)胞生成的Ⅰ型跨膜受體，在血小板和內(nèi)皮細(xì)胞上均有表達(dá)，參與多種血管性疾病和血栓形成[6]。PEAR1基因突變與血小板的激活和心血管不良結(jié)局有關(guān)[7]。研究表明，PEAR1是一種新的血小板受體，其磷酸化可促進(jìn)αⅡbβ3信號(hào)的激活放大，使大量血小板脫顆粒，引起血小板之間不可逆的聚集反應(yīng)[8]。人體PEAR1基因定位于1q23.1，約30 kb，包括23個(gè)外顯子和22個(gè)內(nèi)含子，PEAR1多個(gè)位點(diǎn)的SNP與血小板功能及血管功能密切相關(guān)，PEAR1基因不同位點(diǎn)的變化可對(duì)血小板反應(yīng)性產(chǎn)生一定的影響[9]。

PEARl在血液循環(huán)中的血小板表面呈低水平表達(dá)，在二磷酸腺苷、交聯(lián)膠原蛋白相關(guān)肽CRP-XL及其他因素刺激下，PEAR1的表達(dá)上調(diào)，促使血小板膜糖蛋白Ⅱb與Ⅲa結(jié)合構(gòu)成纖維蛋白原受體，兩者再與纖維蛋白原結(jié)合，進(jìn)而加速血栓形成[10]。研究表明，PEAR1基因能夠發(fā)揮激活血小板、降低巨核祖細(xì)胞的增殖、促進(jìn)血小板的聚集反應(yīng)等作用，并與冠心病、腦卒中等心腦血管疾病密切相關(guān)[11]。國內(nèi)學(xué)者魯燕等[12]的研究表明，冠心病患者發(fā)生阿司匹林抵抗與PEAR1基因多態(tài)性密切相關(guān)，PEAR1基因型GG患者對(duì)阿司匹林的應(yīng)答性最好，而PEAR1基因型AA患者對(duì)阿司匹林存在嚴(yán)重抵抗。陳靜靜等[13]也發(fā)現(xiàn)，PEAR1基因rs12041331位點(diǎn)A等位基因與缺血性腦卒中患者發(fā)生阿司匹林抵抗有關(guān)。

由于PEARl SNP與正常人血小板功能反應(yīng)有關(guān)，目前針對(duì)SNP研究的相關(guān)位點(diǎn)主要有rs12401331、rs9550270、 rs4661012、rs11264579、rs3737224、rs1273215、rs1256688等，其中關(guān)于rs12041331對(duì)血小板聚集功能的影響研究較多。Keramati等[14]發(fā)現(xiàn)，在通過測(cè)序鑒定出的PEAR1基因532個(gè)變體中，內(nèi)含子1變體rs12041331與所有血小板聚集表型顯著相關(guān)，全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定亦顯示攜帶變體rs12041331者的血小板聚集功能最強(qiáng)。Pi等[15]發(fā)現(xiàn)，PEAR1基因多態(tài)性，特別是位點(diǎn)rs12041331和位點(diǎn)rs12566888，與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)病密切相關(guān)，PEAR1基因多態(tài)性并不能表明川崎病發(fā)生的易感性，但rs12041331多態(tài)性與川崎病中冠狀動(dòng)脈瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。Faraday等[16]發(fā)現(xiàn)，PEAR1基因位點(diǎn)rs12041331內(nèi)含子的變異可增加PEAR1蛋白的表達(dá)，后者除增強(qiáng)血小板的聚集性外，還可能存在其他潛在的功能。除此之外，還有研究表明PEAR1基因多態(tài)性可影響血小板聚集率，并與血小板功能和抗血小板藥物藥效學(xué)有關(guān)[9]。Backman等[17]發(fā)現(xiàn)，PEAR1基因位點(diǎn)rs12041331變異通過削弱阿司匹林的抗血小板聚集作用，進(jìn)而增加心血管事件風(fēng)險(xiǎn)。石錦秀等[18]的研究顯示，中國人群中PEAR1基因位點(diǎn)rs12041331的野生G等位基因的分布頻率為0.61，突變A等位基因的頻率為0.39，PEAR1基因突變與血小板高活性具有相關(guān)性，PEAR1基因突變型(AG和AA)人群的血小板聚集率顯著高于野生型(GG)人群，突變基因型(AG和AA)患者使用阿司匹林(或聯(lián)合氯吡格雷)時(shí)的心肌梗死發(fā)生率和死亡率增高，隨著PEAR1的突變基因位點(diǎn)數(shù)量增加，血小板聚集率也逐漸增加。李建設(shè)等[19]在114例初發(fā)腦梗死患者中檢出3種PEAR1(位點(diǎn)rs12041331)基因型，分別是野生型GG(50.9%)、雜合突變型GA(42.1%)、純合突變型 AA(7.0%)，并進(jìn)一步觀察到PEAR1基因突變與長(zhǎng)期服用阿司匹林腦梗死患者的卒中復(fù)發(fā)有關(guān)，考慮PEAR1基因純合突變可增加卒中復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

腦梗死具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率及高死亡率的特點(diǎn)，是造成全世界人口死亡和殘疾的重要原因之一[20]。以往臨床醫(yī)師都重視腦梗死患者肢體功能的恢復(fù)，而忽視了腦梗死后認(rèn)知功能障礙的恢復(fù)，從而錯(cuò)過了腦梗死后認(rèn)知功能恢復(fù)的最佳時(shí)機(jī)，其造成的嚴(yán)重后果并不亞于肢體殘疾，也給整個(gè)家庭和社會(huì)都帶來沉重的負(fù)擔(dān)[21]。認(rèn)知功能減退是急性腦梗死患者最常見的表現(xiàn)之一，卒中后認(rèn)知功能障礙包括了從卒中后認(rèn)知障礙非癡呆至卒中后癡呆的不同程度的認(rèn)知障礙。其發(fā)生機(jī)制目前仍不明確，導(dǎo)致早期診斷及治療較為困難[22]。經(jīng)過積極治療和干預(yù)，可以延緩部分早期的卒中后認(rèn)知障礙非癡呆患者的疾病進(jìn)程。一旦發(fā)展到了卒中后癡呆階段，多表現(xiàn)為階梯式加重、波動(dòng)病程的認(rèn)知功能障礙，治療難度明顯加大[23]。卒中后認(rèn)知功能障礙主要危險(xiǎn)因素包括高齡、低受教育程度、復(fù)發(fā)性卒中等[24]，故需引起重視，做到早期評(píng)估、早期預(yù)防。

本研究結(jié)果顯示，AA組患者的高齡者比例、吸煙者比例高于GG組，LDL-C水平和NIHSS評(píng)分均高于GG組和GA組(均P<0.05)，提示PEAR1基因位點(diǎn)rs12041331的純合突變者有更多的卒中危險(xiǎn)因子，且一旦發(fā)病，神經(jīng)功能受損更為嚴(yán)重。此外，AA組的MMSE評(píng)分低于GG組和GA組(P<0.05)，盡管GA組MMSE評(píng)分也低于GG組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這也初步提示PEAR1基因位點(diǎn)rs12041331的SNP可能與初發(fā)腦梗死患者卒中后認(rèn)知功障礙的發(fā)生有關(guān)。

綜上所述，PEAR1基因位點(diǎn)rs12041331的純合突變可能增加初發(fā)腦梗死患者卒中后神經(jīng)功能缺損程度，以及認(rèn)知功障礙的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。評(píng)估PEAR1基因多態(tài)性對(duì)評(píng)估初發(fā)腦梗死患者卒中后認(rèn)知功障礙有一定的價(jià)值，這對(duì)于合理應(yīng)用相關(guān)藥物，加強(qiáng)患者的綜合管理，改善患者預(yù)后，提高生活質(zhì)量具有重要的意義。然而,由于PEAR1基因突變可以發(fā)生在多個(gè)基因位點(diǎn)上，而且存在種族差異[25]，本研究可能存在著一定的局限性。今后的研究應(yīng)該涉及多類人群，擴(kuò)大樣本量，從更多的基因位點(diǎn)上著手研究其與腦梗死患者卒中后認(rèn)知功障礙的相關(guān)因素。