姜 濤, 歐陽文獻, 譚艷芳, 唐 蓮, 張 慧, 李雙杰
湖南省兒童醫(yī)院 肝病中心, 長沙 410007
先天性膽汁酸合成障礙2型(congenital bile acid synthesis disorder type 2,CBAS2)是醛酮還原酶家族1D1(Aldo-ketoreductase family1 member D1,AKR1D1)基因突變引起△4-3-氧固醇-5β-還原酶缺乏所致的膽汁酸合成障礙性疾病,其主要臨床表現(xiàn)為新生兒膽汁淤積癥和暴發(fā)型肝衰竭[1]。自1988年Setchell等[2]根據(jù)血尿FAB-MS分析首次診斷2例△4-3-氧固醇-5β-還原酶缺陷患兒后,有關(guān)CBAS2的病例報道僅數(shù)十例[3-4]?,F(xiàn)對收治的CBAS2患兒臨床特征、轉(zhuǎn)歸以及AKR1D1基因變異進行了分析,報道如下。
1.1 研究對象 收集2017年1月—2020年11月本院肝病中心診治的4例CBAS2患兒病例資料,其中男2例,女2例。
1.2 基因檢測及分析 在父母簽署知情同意書后,抽取患兒和父母外周靜脈血2 ml,提取合格的人類基因組DNA進行文庫制備。文庫制備是將基因組DNA打斷成主帶<500 bp,峰值在350 bp的小片段DNA,將打斷后的DNA片段進行末端補平,在3′端加“A”堿基,使得DNA片段能與5′端帶有“T”堿基的特殊接頭連接,經(jīng)Pre-Capture LM-PCR對帶有接頭的文庫進行擴增。等量混合文庫后,加入人類外顯子文庫進行雜交,捕獲Exon capture區(qū)域,再通過PCR擴增富集捕獲后產(chǎn)物。瓊脂糖凝膠電泳測定文庫的片段大小,Qubit3.0及熒光定量PCR測定文庫的濃度。將質(zhì)檢合格的文庫稀釋至上機濃度,使用IlluminaHiseq測序平臺進行測序分析,測序結(jié)果通過生物信息學(xué)方法進行數(shù)據(jù)分析,后由遺傳咨詢師進行報告解讀。
檢索內(nèi)部數(shù)據(jù)庫、dbSNP、ESP6500、ExAC等人群數(shù)據(jù)庫,標(biāo)注單核苷酸多態(tài)性和低頻良性變異。對患兒父母及主要親屬相應(yīng)突變外顯子進行PCR測序,以明確突變來源。應(yīng)用預(yù)測軟件對變異的保守性/致病性/危害性進行預(yù)測。檢索HGMD、PubMed、Clinvar、OMIM等數(shù)據(jù)庫中的變異相關(guān)文獻,分析文獻內(nèi)容,參考美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會變異分類指南,對變異進行分類。
1.3 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由湖南省兒童醫(yī)院倫理委員會審批,批號:KY2020-06。
2.1 臨床特點和預(yù)后 4例CBAS2患兒均以皮膚黃染為首發(fā)表現(xiàn),確診年齡為3~5月齡,病例2父母為近親結(jié)婚。所有患兒均有肝大、淺黃色大便表現(xiàn),病例1伴有生長發(fā)育遲緩和脾大,實驗室檢查提示:膽汁淤積,轉(zhuǎn)氨酶升高,凝血全套、Alb和TBA正常(表1),2例患兒伴有脂溶性維生素(A、D、E)缺乏,腹部彩超提示肝大、小膽囊和肝實質(zhì)彌漫性病變。
表1 4例CBAS2患兒入院后初次肝功能指標(biāo)檢查結(jié)果
患兒入院后予以護肝、熊去氧膽酸(10~15 mg·kg-1·d-1)利膽等治療后,膽紅素仍反復(fù)升高,甚至進行性加重。病例3于8月齡時因肝硬化失代償而死亡。病例1、2和4予以熊去氧膽酸治療數(shù)月后,改為鵝去氧膽酸(5~10 mg·kg-1·d-1)治療,電話隨訪病例1(3歲8月齡)和病例4(2歲)患兒肝功能一直正常(黃疸消退時間不詳),病例2(6月齡)患兒在使用鵝去氧膽酸治療1個月后膽紅素恢復(fù)正常,轉(zhuǎn)氨酶仍有輕度升高。3例患兒的生長發(fā)育均達標(biāo),但其遠期預(yù)后需定期隨訪。
2.2 家系基因分析結(jié)果 基因分析結(jié)果顯示,3例復(fù)合雜合突變,1例純合突變,共5種變異(表2),其中c.797G>A和c.580-13T>A已在多個病例中報道[3,5],而c.70G>C、c.93+2T>C和c.579+2_579+4delinsA這3種新變異在PubMed、OMIM、HGMD、Clinvar等數(shù)據(jù)庫及文獻中未見報道,且在正常人數(shù)據(jù)庫(dbSNP、ESP6500和ExAC等)中未見收錄,表明不是人群多態(tài)性位點,結(jié)合臨床表現(xiàn),軟件預(yù)測提示為致病或可能致病。
表2 4例CBAS2患兒基因變異情況
膽固醇在肝細胞內(nèi)經(jīng)過一系列的酶促反應(yīng)后形成膽汁酸,其合成過程中至少有16種酶參與,任何一種酶的缺乏均可導(dǎo)致正常膽汁酸生成障礙,從而引起先天性膽汁酸合成障礙,該類疾病均為常染色體隱性遺傳病?;純阂蚋渭毎麅?nèi)不正常的毒性膽汁酸堆積、正常膽汁酸生成減少等而致膽汁淤積、肝衰竭和肝硬化[1,6],同時可出現(xiàn)脂肪和脂溶性維生素吸收障礙等,占兒童膽汁淤積性肝病的1%~2%[7],最常見的為CBAS1和CBAS2[7],早期初級膽汁酸的治療可明顯改善患兒臨床癥狀,減少肝移植[8]。
CBAS2是由于膽汁酸合成過程中的△4-3-氧固醇-5β-還原酶缺乏,導(dǎo)致其底物轉(zhuǎn)化為7α-羥3-氧-4-膽烷酸、7α、12α-雙羥-3-氧-4-膽烷酸、異鵝去氧膽酸和異膽酸,經(jīng)結(jié)合形成含3-氧-△4結(jié)構(gòu)的不典型膽汁酸,進入血液后通過腎臟排出體外[2]。CBAS2患兒最常見的臨床表現(xiàn)為新生兒膽汁淤積,其他表現(xiàn)為:黑尿、白陶土樣便、脂肪瀉、脂溶性維生素缺乏、肝大、生長發(fā)育遲緩等,無明顯瘙癢癥狀[9]。生化檢查可見高結(jié)合膽紅素血癥,轉(zhuǎn)氨酶增高,GGT輕度升高或正常,TBA正常,凝血功能異常等。肝臟病理檢查可見膽管排列紊亂,肝巨細胞樣變及肝細胞內(nèi)膽汁淤積、纖維化、假小葉形成,伴或不伴髓外造血[10-11]。本研究中患兒以膽汁淤積和肝大為主要表現(xiàn),部分患兒伴生長發(fā)育遲緩、脾大和脂溶性維生素缺乏。生化指標(biāo)提示膽汁淤積,AST水平升高幅度大于ALT,TBA正常,與文獻[3]報道一致。病例2為純合突變患兒,但其臨床癥狀并不比復(fù)合雜合突變患兒重,與Drury等[12]報道不一致。值得注意的是,4例患兒在予以熊去氧膽酸治療后,TBA和GGT可出現(xiàn)一過性升高,TBA最高可達346.7 μmol/L,GGT可達337 U/L。因此,對于曾使用熊去氧膽酸治療的患兒,TBA和GGT的一過性升高可能導(dǎo)致臨床上的誤診或漏診,需反復(fù)多次監(jiān)測GGT和TBA的變化。同時需與低GGT型膽汁淤積性肝病如進行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥[13]、關(guān)節(jié)畸形-腎小管功能不全-膽汁淤積綜合征和良性復(fù)發(fā)性肝內(nèi)膽汁淤積癥等遺傳性疾病鑒別,若患兒GGT和TBA均正常,則需考慮先天性膽汁酸合成障礙。
臨床上高度懷疑CBAS2的患兒,可進行尿液膽汁酸譜分析,注意避免在肝衰竭或嚴(yán)重肝損害時進行,需結(jié)合AKR1D1基因檢測[10-11]明確。AKR1D1基因定位于7號染色體q32~33區(qū),含有9個外顯子,全長42 kb,在肝臟中高度表達,其編碼含有326個氨基酸的△4-3-氧固醇-5β-還原酶,除了參與膽汁酸合成,還參與調(diào)控多種CYP家族酶類表達[12],在類固醇激素的降解代謝中起一定作用。目前報道的基因突變?yōu)椋篶.797G>A、 c.919C>T、 c.158A>G、c.396C>A、c.722A>T、c.622C>T、 c.385C>T、 c.467C>G、 c.850C>T、 c.737G>A、c.217C>T、c.853C>T、c.580-13T>A、c.64G>A、c.580-13T>A、c.579+2T>-、c.919C>T、c.587delG、c.579+2delT、c.579+4delC、c.933delG和c.511delT等。以錯義突變?yōu)橹?,此外還有無義、缺失和剪切位點突變[14-15]。本研究中基因檢測發(fā)現(xiàn),患兒均有AKR1D1基因突變,3例復(fù)合雜合突變,1例純合突變,共5種突變,c.797G>A和c.580-13T>A為已知致病突變[3,5],60%(c.70G>C、c.93+2T>C和c.579+2_579+4delinsA8)的新突變主要為錯義突變(2/5)和剪切位點突變(3/5)。錯義突變c.70G>C,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測可能有害;經(jīng)典剪切位點突變c.93+2T>C,生物危害性較高;c.579+2_579+4delinsA該變異位于mRNA剪接區(qū)域,核苷酸序列高度保守,并且多種計算輔助算法均預(yù)測此變化可能會影響蛋白功能。結(jié)合患兒的臨床表現(xiàn)和家系分析,可診斷為CBAS2。
鵝去氧膽酸為人體必需的初級膽汁酸,可通過負(fù)反饋機制抑制CYP7A1表達,下調(diào)異常膽汁酸的合成,減少其對肝細胞的毒害作用。大量文獻報道,熊去氧膽酸對CBAS2患兒治療效果欠佳,而鵝去氧膽酸可有效緩解臨床癥狀,避免進展性肝損害。臨床上對于口服藥物治療效果欠佳或者肝衰竭、肝硬化者,可考慮肝移植。本研究中4例CBAS2患兒初期予以熊去氧膽酸治療,效果欠佳,其中1例患兒8月齡時死亡,3例患兒在使用鵝去氧膽酸治療后膽紅素恢復(fù)正常,與文獻[16]報道一致。對于合并脂溶性維生素缺乏的患兒可予以補充脂溶性維生素,同時應(yīng)警惕糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用,因其可下調(diào)AKR1D1的表達和活性。此外,AKR1D1的下調(diào)改變了多個核激素受體的激活,以驅(qū)動葡萄糖生成和糖原合成基因表達譜的變化,這可能加劇外源性糖皮質(zhì)激素的不良影響[17]。
總之,臨床上對于高度懷疑CABS2的患兒應(yīng)進行基因檢測或者尿液質(zhì)譜分析,早期診斷并盡早應(yīng)用鵝去氧膽酸可明顯改善臨床癥狀,減少肝移植發(fā)生率;同時本研究中3種AKR1D1基因新變異的識別豐富了AKR1D1基因譜。
利益沖突聲明:本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。
作者貢獻聲明:姜濤負(fù)責(zé)課題設(shè)計,資料分析,撰寫論文;譚艷芳、唐蓮、張慧參與收集數(shù)據(jù),修改論文;李雙杰、歐陽文獻負(fù)責(zé)擬定寫作思路,指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。