王 璐，劉 峰

（四川省藥品檢驗(yàn)研究院·四川省醫(yī)療器械檢測中心·藥物制劑體內(nèi)外相關(guān)性技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611731）

氯哌斯汀為中樞性鎮(zhèn)咳藥，通過抑制咳嗽中樞而產(chǎn)生鎮(zhèn)咳作用，也有微弱的抗組胺作用，無成癮性及耐受性，臨床用于治療呼吸道感染引起的咳嗽。芬地柞酸左旋氯哌斯汀為左旋氯哌斯汀與芬地柞酸所制成的鹽，活性更高，療效是外消旋氯哌斯汀的數(shù)倍，基本無副作用［1］，市場需求量較大。但其生產(chǎn)過程中可能產(chǎn)生或被污染亞硝胺類雜質(zhì) N－亞硝基二甲胺（NDMA）和 N－亞硝基二乙胺（NDEA）。2018 年7 月在纈沙坦原料藥中檢出了各類亞硝胺雜質(zhì)，且在非沙坦類藥物中檢出了亞硝胺類雜質(zhì)。亞硝胺類雜質(zhì)屬人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）M7（R1）《評估和控制藥物中 DNA 反應(yīng)性（致突變）雜質(zhì)以限制潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)》提及的“關(guān)注隊(duì)列”物質(zhì)［2］。根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的致癌物清單［3］，NDMA和NDEA 屬2A 類致癌物質(zhì)，故有必要測定芬地柞酸左旋氯哌斯汀中NDMA 和NDEA 的含量。目前，關(guān)于亞硝胺類雜質(zhì)的檢測方法多針對沙坦類或二甲雙胍類藥物［4－8］，本研究中建立了同時(shí)測定芬地柞酸左旋氯哌斯汀中NDMA和NDEA 含量的氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（GC－MS／MS）法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

7890B ＋7000D 型氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀（美國安捷倫公司），配有7693 型自動(dòng)液體進(jìn)樣器，電子轟擊離子源（EI）及 MasshunterB.07.06 工作站；Sartorius CPA255D型準(zhǔn)微量天平（德國賽多利斯公司，精度為0.01 mg）。

1.2 試藥

芬地柞酸左旋氯哌斯?。ㄋ拇柹镏扑幱邢薰?，批號分別為 200501，200601，190801）；NDMA 對照品（東京化成工業(yè)株式會(huì)社，含量為99.0%，批號為TFRMG）；NDEA 對照品（美國 J＆ K 公司，含量為99.0%，批號為LKB0S44）；水為超純水（德國賽多利斯公司）；二氯甲烷（色譜純，美國Fisher 公司）

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫DB－WAX 毛細(xì)管柱（30m×0.25mm，0.5μm，固定液為聚乙二醇）；程序升溫：起始溫度為40℃，維持 0.5 min，以 20 ℃ ／min 的速率升溫至 180 ℃ ，再以50 ℃ ／min 的速率升溫至 240 ℃，保持 8 min，恒流模式；流速：1.0 mL ／min；載氣：氦氣；進(jìn)樣口溫度：250 ℃，脈沖不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣壓力：15 psi；持續(xù)時(shí)間：1.5 min；進(jìn)樣量：2 μL；采用安捷倫5190－2293 超惰性不分流襯管。

2.1.2 質(zhì)譜條件

檢測器：三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測器，電離源為EI，電離能量為70 eV，離子源溫度為280 ℃，四極桿溫度為150 ℃；質(zhì)譜傳輸接口溫度：250 ℃；增益因子：10；溶劑延遲時(shí)間：5.5 min，運(yùn)行時(shí)間：7.5 min；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；NDMA 的掃描：開始時(shí)間為5.5 min，定量離子對質(zhì)荷比為（m ／ z）74→44，碰撞能量為2 eV，定性離子對為74→42，碰撞能量為6 eV；NDEA的掃描：開始時(shí)間為 6.6 min，定量離子對 m ／ z 為102→85，碰撞能量為2 eV，定性離子對 m／ z 為102→56，碰撞能量為6 eV。

2.2 溶液配制

分別取NDMA 和NDEA 對照品100 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加二氯甲烷溶解，并稀釋至刻度，搖勻，得 NDMA 和 NDEA 質(zhì)量濃度均為 10 mg ／mL 的對照品貯備液；分別精密量取NDMA 和NDEA 對照品貯備液適量，加二氯甲烷逐級稀釋，得NDMA 和NDEA 的質(zhì)量濃度分別為900 ng／mL 和250 ng／mL 的混合對照品貯備液；精密量取混合對照品貯備液1 mL，置100 mL容量瓶中，加二氯甲烷定容至刻度，搖勻，即得NDMA和 NDEA 的質(zhì)量濃度分別為 9 ng ／mL 和 2.5 ng ／mL 的混合對照品溶液；取芬地柞酸左旋氯哌斯汀0.1 g，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，加適量二氯甲烷超聲使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：精密量取空白溶劑（二氯甲烷）、混合對照品溶液、供試品溶液各2 μL，分別按2.1 項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定6 次，并記錄色譜圖。結(jié)果空白溶劑不干擾測定，供試品溶液色譜中無其他雜質(zhì)峰干擾。詳見圖1。

圖1 氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜圖1. NDMA 2. NDEAA. Blank solvent B.Test solution C.Mixed reference solutionFig.1 GC －MS ／MS spectrograms

線性關(guān)系考察：精密量取2.2 項(xiàng)下混合對照品貯備液 10，25，50，100，250，500 μL，分別置 10 mL 容量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，作為線性關(guān)系考察系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1 項(xiàng)下條件測定，記錄色譜圖。分別以質(zhì)量濃度（X，ng／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，線性方程分別為 YNDMA＝ 4 250.9XNDMA－3 749.8（r ＝ 0.998 3，n ＝ 6），YNDEA＝ 2 901.6 XNDEA－ 406.8（r ＝0.9998，n ＝6）。結(jié)果表明，NDMA 和 NDEA 質(zhì)量濃度分別在 0.922 2 ～46.1093 ng／mL 和 0.235 6 ～11.781 0 ng／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限（LOD）與定量限（LOQ）測定：取 2.2 項(xiàng)下NDMA 和NDEA 對照品貯備液逐級稀釋，以信噪比（S／ N）為3 時(shí)的進(jìn)樣量折算后作為LOD；以 S／ N 為10 時(shí)的進(jìn)樣量折算后作為LOQ。結(jié)果見表1，表明方法靈敏度高，可滿足檢測需要。

表1 NDMA 和NDEA 的檢測限與定量限測定結(jié)果Tab.1 LOD and LOQ of NDMA and NDEA

穩(wěn)定性試驗(yàn)：因芬地柞酸左旋氯哌斯汀中均未檢出NDMA 和NDEA，故取對照品溶液和加標(biāo)供試品溶液分別于 0，3，6，9，13，15 h 時(shí)注入氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果對照品溶液中，NDMA 和NDEA 峰面積的RSD 分別為 5.09%和 6.98% （n ＝ 6），加標(biāo)供試品溶液中 NDMA 和 NDEA 峰面積的 RSD 分別為 5.19% 和7.16%（n ＝ 6），表明供試品溶液在 15 h 內(nèi)穩(wěn)定。

精密度試驗(yàn)：取對照品溶液，注入氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀，按2.1 項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄色譜圖。結(jié)果NDMA 和 NDEA 峰 面 積 的 RSD 分 別 為 1.42% 和1.02%（n ＝ 6）。取 LOQ 測定項(xiàng)下溶液，注入氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀，按2.1 項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄色譜圖。結(jié)果 NDMA 和NDEA 峰面積的 RSD 分別為 1.92%和7.79%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號為 200501）0.1 g，共 6 份，精密稱定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下條件測定。結(jié)果樣品中均未檢出NDMA 和NDEA，故考察加標(biāo)重復(fù)性。取樣品（批號為 200501）0.1 g，精密稱定，共6 份，精密加入混合對照品貯備液0.1 mL，即得加標(biāo)供試品溶液，依法進(jìn)樣測定。結(jié)果NDMA 和NDEA的平均含量分別為 0.95 μg ／g 和 0.22 μg ／g，RSD 分別為 1.92%和 4.81%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號為200501）0.1 g，共9份，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，分別精密加入混合對照品貯備液 0.05，0.10，0.15 mL，各 3 份，按 2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，同時(shí)配制對照品溶液，以重復(fù)性試驗(yàn)測定結(jié)果作為樣品本底值，按2.1 項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。按外標(biāo)法計(jì)算NDMA 和NDEA 的含量和回收率，結(jié)果見表2。

表2 NDMA 和 NDEA 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝ 9）Tab.2 Results of the recovery tests of NDMA and NDEA（n ＝9）

耐用性試驗(yàn)：取供試品溶液（批號為200501）、加標(biāo)（100%濃度）供試品溶液及對照品溶液，分別按下列條件：耐用性1，調(diào)整進(jìn)樣口溫度為230 ℃；耐用性2，調(diào)整進(jìn)樣口溫度為 270 ℃；耐用性 3，調(diào)整流速為 1.1 mL ／min；耐用性4，調(diào)整升溫程序起始溫度為40 ℃，維持0.5 min，以 18 ℃ ／min 的速率升溫至 180 ℃ ，再以 50 ℃ ／min 的速率升溫至240 ℃，保持8 min；耐用性5，調(diào)整升溫程序起始溫度為 40 ℃，維持 0.5 min，以 22 ℃ ／min 的速率升溫至 180 ℃，再以 50 ℃ ／min 的速率升溫至 240 ℃，保持8 min，測定NDMA 和NDEA 的含量。結(jié)果供試品溶液中各條件下均未檢出NDMA 和NDEA，加標(biāo)供試品溶液各條件下 NDMA 和 NDEA 含量測定結(jié)果的 RSD 分別為3.07%和 6.46%（n ＝5），表明色譜條件在一定范圍變化時(shí)，方法耐用性良好。

2.4 樣品中NDMA 和NDEA 含量測定

取 3 批樣品（批號分別為 200501，200601，190801），按 2.1 項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定。結(jié)果 3 批樣品中均未檢出 NDMA 和 NDEA。

3 討論

3.1 控制策略

照EMA／511347／2019 文件要求，需對所有化學(xué)合成藥物中亞硝胺的潛在污染進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估。而遺傳毒性雜質(zhì)的控制策略包括源頭控制，如起始物料、反應(yīng)試劑等的控制；過程控制，如生產(chǎn)環(huán)境的設(shè)備運(yùn)行條件控制、產(chǎn)品工藝控制、工藝參數(shù)控制、中間體控制等；終點(diǎn)控制，如通過原料藥或制劑控制等。本研究中采用終點(diǎn)控制的策略。芬地柞酸左旋氯哌斯汀由左旋4－氯二苯甲醇與 N－（2－氯乙基）－哌啶鹽酸鹽反應(yīng)制得左旋氯哌斯汀堿基，再與芬地柞酸成鹽制得目標(biāo)化合物，在合成過程中叔胺類物質(zhì)可能引入仲胺雜質(zhì)，另合成過程中使用的酰胺類溶劑在適宜條件下（如酸性、高溫等）也可能產(chǎn)生仲胺，其與自然界常見的亞硝酸鹽在酸性環(huán)境中可生成亞硝胺類化合物。推測這可能是本品中引入潛在亞硝胺類雜質(zhì)的原因；此外，生產(chǎn)過程、包裝材料或環(huán)境中也可能由污染引入亞硝胺類雜質(zhì)，經(jīng)過多批次樣品的篩查，本品中均未檢出NDMA 和NDEA，表明嚴(yán)格按當(dāng)前合成工藝生產(chǎn)，本品被亞硝胺類物質(zhì)污染的風(fēng)險(xiǎn)較小。

3.2 分析方法選擇

N－亞硝胺類雜質(zhì)的測定方法主要有GC－MS／MS法 和 液 相 色 譜 － 串 聯(lián) 質(zhì) 譜 （LC － MS ／ MS）法［9－12］。LC － MS ／MS 法中，NDMA 出峰較早，峰形受溶劑強(qiáng)度影響較大，有機(jī)溶劑比例較高時(shí)，NDMA 色譜峰變形，靈敏度降低［13］；而芬地柞酸左旋氯哌斯汀在水中幾乎不溶，LC－MS／MS 法靈敏度難以滿足檢測需求。故本研究中采用GC－MS／MS 法進(jìn)行測定。

建立測定方法時(shí)，根據(jù)樣品的溶解性，分別選用甲醇、乙腈和二氯甲烷為溶劑進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果以二氯甲烷作為溶劑時(shí)，待測化合物響應(yīng)值約為另外兩種溶劑的3 倍，故最終選擇二氯甲烷為溶劑。

進(jìn)樣方式的選擇，考慮到本品為原料藥，成分較單一，直接進(jìn)樣可選擇脈沖不分流模式，提高進(jìn)樣量，較頂空進(jìn)樣方式靈敏度更高［14］。另考慮到 N－亞硝胺類化合物是一系列含有相同官能團(tuán)的化合物，相較單離子掃描方式，MRM 具有更強(qiáng)的專屬性和靈敏度，能最大限度地避免假陽性結(jié)果。故最終選擇直接進(jìn)樣、MRM 進(jìn)行測定。

3.3 限度設(shè)定依據(jù)

根據(jù)美國食品藥物管理局、歐洲藥品管理局建議的限度，NDMA 每人每日攝入量不能超過96 ng，NDEA 每人每日攝入量不能超過26.5 ng，日最大服用劑量為106.2 mg，擬訂本品中含 NDMA 不得超過 0.90 μg ／g，NDEA 不得超過 0.25 μg ／g。