蔡建峰,楊真真,鄒福賢,周曉蘭

(泉州市正骨醫(yī)院藥學(xué)部, 福建 泉州 362000)

苡仁清痹丸來源于泉州市正骨醫(yī)院的臨床驗(yàn)方,主要由黃柏、蒼術(shù)、川牛膝、薏苡仁、黃芩、炒白術(shù)、木瓜、當(dāng)歸、雞血藤、車前子、茯苓、紅花、澤瀉、陳皮和木豆葉等中藥組成,該方以四妙丸為核心,輔以黃芩、車前子等清熱利濕；茯苓、陳皮和澤瀉利水；紅花、當(dāng)歸、白芍和赤芍等通經(jīng)止痛；雞血藤和木瓜舒經(jīng)活絡(luò),全方具有清熱利濕、通絡(luò)止痛的作用,在臨床上療效確切,常用于濕熱蘊(yùn)結(jié)型相關(guān)疾病,如股骨頭壞死、骨性關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)病、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎等的治療[1],以往研究通過中醫(yī)辨證論治將股骨頭缺血性壞死分為濕熱內(nèi)阻型、氣滯血瘀型和肝腎虧虛型三種,并對(duì)其中100多例濕熱內(nèi)阻型患者并采用苡仁清痹丸進(jìn)行治療股骨頭缺血性壞死,總有效率達(dá)94.58%,效果顯著[2]。本方長期運(yùn)用于臨床,安全性好,療效較佳,作用機(jī)制清楚,具有較高的開發(fā)價(jià)值,其中“蒼術(shù)-黃柏-薏苡仁”為治療風(fēng)濕病的核心藥組[3],也為本方的重要組成部分,現(xiàn)代藥理研究表明其能夠通過多種有效成分、多個(gè)靶點(diǎn)以及一氧化氮生物合成和炎癥反應(yīng)等多條通路的協(xié)同機(jī)制進(jìn)行治療痛風(fēng)和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病[4-5]。

泉州市正骨醫(yī)院是一家擁有推拿科、骨科、軟傷科、康復(fù)科和制劑室等30多個(gè)科室的三級(jí)甲等骨傷專科醫(yī)院,其制劑室始創(chuàng)于1962年,為集醫(yī)療、教學(xué)、科研一體的藥學(xué)科室,目前生產(chǎn)的劑型主要有丸、散、膏、搽和酒劑等傳統(tǒng)劑型,設(shè)備設(shè)施完善,是泉州市唯一一家具有中醫(yī)特色中藥制劑室,并擁有《制劑許可證》的醫(yī)療機(jī)構(gòu)。苡仁清痹丸(濃縮丸)目前已完成制劑工藝研發(fā)[1],但缺乏相應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),不利于穩(wěn)定生產(chǎn)和保障產(chǎn)品質(zhì)量。高效液相色譜儀是《中國藥典》中最常用的檢測儀器之一,在質(zhì)量控制方面運(yùn)用非常廣泛,如HPLC用于疏風(fēng)愈痛丸和理氣舒心片等中成藥的質(zhì)量控制[6-7]。根據(jù)2020版《中國藥典》,在苡仁清痹丸(濃縮丸)的藥物組成中含有HPLC含量測定項(xiàng)的共有13味,指標(biāo)性成分含量限定較高(超過1%)的有黃芩、陳皮、紅花、黃柏、赤芍和白芍等[8],其中黃柏為組方中的核心藥物,對(duì)于組方發(fā)揮療效具有重要作用?，F(xiàn)代藥理研究表明小檗堿能緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎癥狀,抑制炎癥反應(yīng),其機(jī)制可能與炎癥因子和NLRP3/TLRs信號(hào)通路有關(guān)[9-10]。而四妙丸在2020版《中國藥典》中,檢測指標(biāo)同樣為鹽酸小檗堿,因此本實(shí)驗(yàn)確定檢測對(duì)象為鹽酸小檗堿,其成分含量較高,易于檢出,也為組方中有效成分之一,具有代表性。

因此本文擬通過高效液相色譜對(duì)苡仁清痹丸(濃縮丸)中的小檗堿成分進(jìn)行含量測定,為苡仁清痹丸(濃縮丸)的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),將有利于保障大批量生產(chǎn)時(shí)的質(zhì)量穩(wěn)定,提高臨床療效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100(Agilent有限公司)；PX225DZH電子天平(Ohuas有限公司)；Millipore超純水儀(Millipore有限公司)。

1.2 試藥

苡仁清痹丸(濃縮丸)(泉州市正骨醫(yī)院藥學(xué)部實(shí)驗(yàn)室制備,批號(hào)：20210601,20210602,20210603)；鹽酸小檗堿(中檢院,批號(hào)110713-201814)；乙腈和甲醇均為色譜純,購自國藥集團(tuán)試劑有限公司；磷酸購自阿拉丁股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法2.1 色譜條件

采用Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)；流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸水(1∶3)；檢測波長345 nm；進(jìn)樣量20μL；流速1.0 mL/min；柱溫30℃；等度洗脫25 min。

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取對(duì)照品5.0 mg置于25 mL容量瓶中,加甲醇超聲溶解后定容,制得濃度為200μg/mL的對(duì)照品溶液。分別精密量吸取對(duì)照品溶液0.5、1、2、5、10 mL,置于10 mL容量瓶中,甲醇定容,搖勻,得濃度為10、20、40、100、200μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取本品1.0 g粉末(過三號(hào)篩),置具塞錐形瓶中,加入70%甲醇50 mL,超聲60min,放冷,用70%甲醇補(bǔ)足減失重,搖勻,0.45μm濾膜濾過,即得供試品溶液。

2.4 陰性供試品制備

按處方比例稱取除黃柏外的其他藥物后按苡仁清痹丸(濃縮丸)制法制成陰性制劑,再按照2.3項(xiàng)下方法制備陰性供試品溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn)

精密吸取上述各溶液20μL,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果表明,苡仁清痹丸(濃縮丸)供試品溶液與對(duì)照品溶液在相同保留時(shí)間處均有較大吸收,與相鄰成分達(dá)到基線分離,陰性溶液中無干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 HPLC色譜圖A:對(duì)照品HPLC，圖譜B:供試品HPLC圖譜，C:陰性溶液HPLC圖譜；1:鹽酸小檗堿

2.6 線性關(guān)系考察

將2.2項(xiàng)下不同濃度對(duì)照品,按照2.1項(xiàng)下的色譜條件測定,以濃度(X)-峰面積(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為：Y=22.258X-9.6167(r=0.9999),表明在10～200g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗(yàn)

取濃度為40μg/mL的對(duì)照品溶液20μL,按照2.1項(xiàng)下色譜條件平行進(jìn)樣6次,測定峰面積,結(jié)果RSD為0.94%(n=6),表明精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次苡仁清痹丸(濃縮丸),按照2.3項(xiàng)下方法,制備6份供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件測定,根據(jù)2.6項(xiàng)下回歸方程計(jì)算含量及其RSD,結(jié)果RSD為1.19%(n=6),表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份2.3項(xiàng)下供試品溶液分別于0、1、2、4、6、8、12、24h按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測定相應(yīng)峰面積,計(jì)算含量,結(jié)果鹽酸小檗堿RSD為0.45%,表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批樣品6份,每份0.5 g,分別精密加入1.1 mg對(duì)照品,按2.3項(xiàng)制備供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,計(jì)算回收率,結(jié)果平均加樣回收率為98.16%,RSD為1.73%(n=6),表明本法具有良好的回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率測定結(jié)果(n=6)

2.11 結(jié)果

取3批苡仁清痹丸(濃縮丸)樣品制備為供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測定,根據(jù)2.6項(xiàng)下回歸方程計(jì)算含量,結(jié)果3批苡仁清痹丸(濃縮丸)中鹽酸小檗堿分別為2.20 mg/g(批號(hào)：20210601)、2.10 mg/g(批號(hào)：20210602)、2.21 mg/g(批號(hào)：20210603)。因此暫定苡仁清痹丸(濃縮丸)每1 g含黃柏以鹽酸小檗堿計(jì),不得少于2.0 mg。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

通過對(duì)鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行紫外掃描,可見345 nm、263 nm和227 nm處均有波峰,吸收均較大,但是結(jié)合樣品,發(fā)現(xiàn)在345 nm處干擾最小。有機(jī)相通過比較乙腈和甲醇,發(fā)現(xiàn)乙腈作為有機(jī)相,洗脫能力更強(qiáng),使得圖譜噪音更低,峰型更為對(duì)稱[11]。關(guān)于水相,考察酸性對(duì)其的影響,發(fā)現(xiàn)加入酸水后,鹽酸小檗堿峰型更為尖銳,減少脫位情況,而其中又以0.1%磷酸水效果最好?？疾炝?0、35、40℃不同柱溫時(shí)對(duì)樣品峰形、保留時(shí)間、分離度的影響,發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)于目標(biāo)峰的影響較小,均能較好的得到測定結(jié)果,出于節(jié)約能源考慮,最終選擇30℃作為柱溫。不同品牌的色譜柱具有細(xì)微的差別,通過比較Diamonsil C18和Ultimate XB-C18色譜柱,發(fā)現(xiàn)兩者在色譜峰型上具體較小的差別,相比較來說Diamonsil C18所得到的峰型更好,更適合本實(shí)驗(yàn)樣品,有利于計(jì)算出樣品的真實(shí)含量。因此本試驗(yàn)選擇了乙腈-0.1%磷酸水作為流動(dòng)相,采用Diamonsil C18色譜柱,柱溫30℃,檢測波長345 nm為本次實(shí)驗(yàn)色譜條件。

3.2 提取方法考察

本文對(duì)提取提取溶劑進(jìn)行考察,發(fā)現(xiàn)甲醇的提取效果優(yōu)于乙醇,提取更完全；考察比較了30%、50%、70%和90%溶劑濃度,發(fā)現(xiàn)70%甲醇提取率最高。對(duì)超聲和回流兩種提取方法比較,發(fā)現(xiàn)超聲提取方便快速。此外對(duì)不同的超聲時(shí)間進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)含量隨著超聲時(shí)間逐漸升高,在60 min之后含量基本趨于一致,說明在60min時(shí)提取完全。對(duì)料液比同樣進(jìn)行考察,分別以1∶10、1∶30、1∶50、1∶70的比例進(jìn)行提取,結(jié)果表明隨著料液比的增加,提取逐漸充分,并在1∶50達(dá)到平臺(tái)期。因此選擇料液比1∶50進(jìn)行提取。綜合各種因素,最終選擇采用50倍量的70%甲醇超聲60 min進(jìn)行鹽酸小檗堿提取。

綜上所述,本試驗(yàn)建立了一種采用高效液相色譜法測定苡仁清痹丸(濃縮丸)中的鹽酸小檗堿的含量的方法；采用50倍量的70%甲醇超聲60 min進(jìn)行提取,以乙腈-0.1%磷酸水作為流動(dòng)相,Diamonsil C18色譜柱,柱溫30℃,檢測波長345 nm為色譜條件,其方法學(xué)驗(yàn)證均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),可用于苡仁清痹丸(濃縮丸)半成品和成品中鹽酸小檗堿的含量測定。該方法簡便、準(zhǔn)確、快速,為準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)苡仁清痹丸(濃縮丸)的質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),有利于苡仁清痹丸(濃縮丸)的穩(wěn)定生產(chǎn),減少質(zhì)量參差不齊的情況,從而更好的為臨床服務(wù),保障臨床療效。