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        航天黃花菜組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)研究*

        2021-08-15 03:02:14帥娜娜穆妮妮張秀麗黃衛(wèi)紅任麗娟頡敏昌
        甘肅科技 2021年12期
        關(guān)鍵詞:根苗煉苗培苗

        帥娜娜,穆妮妮,張秀麗,黃衛(wèi)紅,任麗娟,頡敏昌△

        (1.甘肅省慶陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,甘肅 慶陽 745000;2.慶陽市西峰區(qū)農(nóng)業(yè)行政綜合執(zhí)法大隊,甘肅 慶陽 745000)

        黃花菜(Hemerocallis citrina Baroni)屬百合科(liliaceae)萱草屬,別名萱草、忘憂草、金針菜、健腦草、安神菜等,是一種常見的多年生草本植物[1],在我國已有2000 多年的栽培史,自古以來就是一種美食。黃花菜花蕾呈細(xì)長條狀,黃色,有芳香氣味,具有藥食同源的功能[2],不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類、多種維生素、游離氨基酸、黃酮類物質(zhì)和鈣、磷、鐵、鋅、硒等礦物質(zhì)元素[3],還具有清熱解毒、抗菌消炎、安神補腦、抵抗抑郁、延緩衰老及抗癌抑癌等功效[4]。

        黃花菜在我國栽培歷史悠久,種質(zhì)資源豐富,南北各地均有栽植,多分布于中國秦嶺以南、甘肅、湖南、江蘇、浙江、湖北、江西、四川、陜西、吉林、廣東與內(nèi)蒙古草原等地。慶陽地處黃花菜優(yōu)生區(qū)的核心區(qū),是全球品質(zhì)最好、面積最大、栽培歷史最悠久的黃花菜產(chǎn)區(qū)。慶陽黃花菜不僅菜條肥大,色澤黃亮,而且還具有肉質(zhì)厚嫩,久煮不爛的特點。被列為國家農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志保護產(chǎn)品。

        航天誘變育種是將空間技術(shù)與常規(guī)農(nóng)業(yè)育種相結(jié)合,利用空間的特殊環(huán)境,使種子或其他植物體產(chǎn)生遺傳變異,返回地面種植,獲得有益突變體,選育新品種的植物育種技術(shù)[5]。我國的航天育種走在世界前列,在農(nóng)作物育種方面已取得了重要的成果,至目前已通過國家、省級審定或鑒定的品種有200 多個。黃花菜的航天育種起步較晚,發(fā)展相對落后,現(xiàn)在還未見成熟報道。

        2019 年6 月-2020 年7 月,采用組織培養(yǎng)法擴繁航天黃花菜新品種金蕾二號種苗,試驗對金蕾二號外植體采集、消毒,繼代培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基配方,培養(yǎng)基滅菌,接種,煉苗,移栽大田等環(huán)節(jié)做了研究,現(xiàn)將結(jié)果報告如下:

        1 材料與方法

        1.1 試驗時間、地點

        本試驗于2019 年6 月-2020 年7 月在慶陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院組培室進(jìn)行。

        1.2 試驗材料

        慶陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院自主選育的航天黃花菜新品種金蕾二號。

        1.3 試驗儀器

        生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn),型號:HFsafe-1200LC)、全自動立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司生產(chǎn),100 L)、接種器械滅菌器(濟南格艾特儀器設(shè)備有限公司)、紫外線燈、酒精燈。

        1.4 試驗方法

        1.4.1 外植體消毒

        1)幼蕾花絲:將采集的金蕾二號幼小花蕾(長度6 cm 以下),用流水沖凈晾干,在無菌條件下,用70%乙醇浸10~20 s,超純水沖洗3 次,晾干,再用0.1%氯化汞浸8~10 min,超純水沖洗7 次,用滅菌濾紙吸干水分,撕開花瓣,取出花絲,用無菌剪刀將其剪成長約0.5 cm 的小段。

        2)根狀莖:將新挖的金蕾二號植株置于自來水下,小水沖洗2~3 h,用毛刷輕輕刷洗葉片及根系間的泥土,洗凈后除去根系,剝離外層葉片,保留根狀莖上部3~4 cm,晾干。在無菌條件下,用70%酒精浸30 s,超純水沖洗3 次,再用0.1%升汞加0.02%吐溫溶液浸泡5 min,超純水沖洗7 次,滅菌濾紙吸干水分,手術(shù)刀剝?nèi)ナS嗳~片,切取莖尖0.2~0.5 cm。

        1.4.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)及外植體的選擇

        將黃花菜幼蕾花絲和根狀莖分別接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,經(jīng)過40 d 的培養(yǎng),統(tǒng)計不同外植體誘導(dǎo)分化情況,選擇最佳外植體。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L,pH5.8~6.0,培養(yǎng)條件為溫度25 ℃~28 ℃,光照度2000~2500 lx,光照時間16h。

        1.4.3 繼代培養(yǎng)

        將誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織,分割成0.6~1.5 cm 的小塊,接入繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)基1 為MS 培養(yǎng)基粉(不含糖和瓊脂)4.74 g+瓊脂5.5 g/L+6-BA 4.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+蔗糖3%;繼代培養(yǎng)基2 為MS 培養(yǎng)基粉(不含糖和瓊脂)4.74 g+瓊脂5.5 g/L+6-BA 0.5 mg/L+IBA0.2 mg/L+蔗糖3%。每瓶接種4 個單芽,重復(fù)3 次。培養(yǎng)溫度25 ℃~28 ℃,光照度2000~2500 lx,光照時間16 h。經(jīng)過30 d 的培養(yǎng),隨機選出30 瓶統(tǒng)計愈傷組織、芽叢、無根苗(高3cm、6 片葉以上)增殖情況。

        1.4.4 生根培養(yǎng)

        金蕾二號繼代培養(yǎng)生成的無根苗高約3 cm,葉6 片以上時,接入不同激素的1/2MS 生根培養(yǎng)基,生根培養(yǎng)基1 為1/2MS 培養(yǎng)基粉(不含糖和瓊脂)2.47 g+瓊脂5.5 g/L+NAA0.2 mg/L+蔗糖3%,生根培養(yǎng)基2 為1/2MS 培養(yǎng)基粉(不含糖和瓊脂)2.47 g+瓊脂5.5 g/L+IBA0.2 mg/L+蔗糖3%。培養(yǎng)溫度25~28℃,光照度2000~2500 lx,光照時間16 h。經(jīng)過30 d的培養(yǎng),觀察生根情況。

        1.4.5 煉苗

        無根苗在生根培養(yǎng)基上生根2 條以上時,使生根苗逐步接受自然光照、與外界交換空氣、適應(yīng)較低濕度的環(huán)境,直至具備在自然環(huán)境中生存的能力,煉苗完成。

        組培苗經(jīng)過30d 煉苗,高度達(dá)到10cm 以上,根狀莖直徑0.6 cm 以上,肉質(zhì)根2 條以上,生長健壯,定植大田。大田等行栽植,行距0.85m,株距0.40 m。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 外植體的選擇

        經(jīng)過40 d 的誘導(dǎo)培養(yǎng),不同外植體誘導(dǎo)頻率統(tǒng)計見表1。據(jù)結(jié)果可以看出,花絲、根狀莖尖兩類外植體接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中均可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織,金蕾二號幼蕾的花絲接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基,7 d 花絲膨大,萌動3 個,15 d 有31 個花絲基部長出黃色愈傷組織,40 d 愈傷組織達(dá)到46 個,逐漸變綠分化增多,進(jìn)入高峰,誘導(dǎo)愈傷率為76.67%;根狀莖尖作為外植體接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基,7 d 根狀莖尖膨大,萌動1個,15d 有19 個根狀莖尖基部長出黃色愈傷組織,40d 愈傷組織變綠分化增多,達(dá)到28 個,同時長出許多新生芽點,誘導(dǎo)愈傷率為46.67%。綜上,可選黃花菜幼蕾花絲為最佳外植體。

        表1 外植體誘導(dǎo)頻率統(tǒng)計表

        2.2 繼代培養(yǎng)

        選取繼代培養(yǎng)的黃花菜無菌苗,接種于含不同濃度6-BA、NAA、IBA 的培養(yǎng)基中,增值情況見表2。結(jié)果表明,20 d 繼代培養(yǎng)基1、繼代培養(yǎng)基2 都能產(chǎn)生大量淡綠色外觀呈不規(guī)則的顆粒狀胚性愈傷組織,繼代培養(yǎng)基1 愈傷組織增殖快,30 d 愈傷組織增殖3.1 倍。繼代培養(yǎng)基2 萌發(fā)芽叢41 個,生成無根苗23 個。繼代培養(yǎng)基1 適合金蕾二號愈傷組織增殖培養(yǎng),繼代培養(yǎng)基2 適合金蕾二號分化胚性愈傷組織,生成芽叢,長出無根苗。試驗中還觀察到,金蕾二號花絲誘導(dǎo)愈傷過程中,初次出現(xiàn)的愈傷組織越緊實,表面有小顆粒狀分布的,則增殖及生成芽叢的能力就越強,而誘導(dǎo)的愈傷組織越松散則再生能力越差。

        表2 繼代培養(yǎng)基愈傷組織增殖統(tǒng)計表

        2.3 生根培養(yǎng)

        采用添加NAA、IBA 兩種不同激素的生根培養(yǎng)基,生根情況見表3。結(jié)果表明,生根培養(yǎng)基1 接種18 d 從無根苗的根狀莖上萌發(fā)出白色乳狀凸起4個,30 d 有113 個苗生根,共生根267 條,無根苗生根率75.33%。生根培養(yǎng)基2 接種18 d 從無根苗的根狀莖上萌發(fā)出白色乳狀凸起1 個,30 d 有99 個苗生根,共生根299 條。兩種生根培養(yǎng)基都能促進(jìn)生根,生根培養(yǎng)基1 培養(yǎng)的植株葉片寬大、苗較健壯,生根快;生根培養(yǎng)基2 生根數(shù)較多、根較粗長、根系發(fā)達(dá)。30 d 后,根數(shù)繼續(xù)增加,根系繼續(xù)擴大。當(dāng)無根苗生根2~3 條以上時,植株葉片增多,根部肥大,植株生長旺盛,開始煉苗。

        表3 生根培養(yǎng)基生根統(tǒng)計表

        2.4 煉苗

        (1)使用80%多菌靈300~500 倍液均勻噴霧處理寧夏中青生物科技有限公司生產(chǎn)的育苗基質(zhì),加水濕透至育苗基質(zhì)手握成團,捏不出水分,裝入直徑10cm 的營養(yǎng)缽,每缽栽入1 株2 條根系以上,植株葉片寬大、生長健壯的組培苗,立即放入小拱棚,保持溫度25~28℃、相對濕度55%~80%,逐步接受陽光照射。栽入155 株帶根組培苗進(jìn)行煉苗,11d 后將組培苗移出小拱棚時,死亡76 株,存活79 株。日光溫室內(nèi)整好練苗用地,開溝,鋪放處理的育苗基質(zhì),栽入苗子,沿苗子兩側(cè)撒入處理過的育苗基質(zhì),壓實,輕澆薄水。7 d 內(nèi)及時補水。10d 后全部死亡。

        (2)日光溫室內(nèi)開溝,鋪放用80%多菌靈300~500 倍液處理的育苗基質(zhì),將130 株2 條根系以上,葉片寬大、生長健壯的組培苗,從培養(yǎng)瓶移出,沖去根部培養(yǎng)基基質(zhì),栽入育苗基質(zhì)之上,沿苗子兩側(cè)撒入處理過的育苗基質(zhì),壓實,輕澆薄水,加蓋遮陽網(wǎng)。移栽7d 內(nèi)及時補水,保持小環(huán)境具有較高的空氣濕度,減少葉面的水分蒸發(fā),當(dāng)外圍老葉枯死,新葉長出后,逐漸降低濕度,減少噴水次數(shù),10d 后僅存活1 株,存活率不足1%。

        (3)將生根2 條以上的生根苗,連同培養(yǎng)瓶置于自然光照環(huán)境,第1 天接受自然光照1h,以后每天增加20 min,逐步適應(yīng)自然光,7d 后解開封口繩,再過2 d,將封口膜上移,使瓶內(nèi)組培苗能與外界進(jìn)行空氣交換,適應(yīng)較低濕度的環(huán)境,7d 后將封口膜去掉,張開瓶口,置于日光下10 d,煉苗完成,移栽大田。大田挖小坑,噴施80%多菌靈300~500 倍液,進(jìn)行土壤消毒,栽入苗子,沿苗子兩側(cè)撒入處理過的育苗基質(zhì),壓實,輕澆薄水,加蓋遮掩網(wǎng)遮光,視土壤墑情及時用噴霧器補水。栽植7d 后去掉遮掩網(wǎng),噴灑0.1%尿素水溶液1 次、噴霧80%多菌靈300~500 倍液1 次,然后每10d 噴1 次。栽植生根苗2216 株,成活1319 株,成活率在59.52%。

        (4)將組培苗生根2 條以上的培養(yǎng)瓶,解開封口繩置于培養(yǎng)室,2d 后將封口膜上移,7 d 后將封口膜去掉,張開瓶口,組培苗能與外界交換空氣,適應(yīng)較低濕度的環(huán)境,10d 后使用80%多菌靈300~500倍液均勻噴霧處理育苗基質(zhì),加水濕透至育苗基質(zhì)手握成團,捏不出水分,裝入6cm×6cm32 孔或4.5cm×4.5cm50 孔育苗盤,在培養(yǎng)室經(jīng)過10d 過渡,期間,死亡13 株,10d 后將育苗盤移入自然光照環(huán)境,第1d 接受自然光照1h,以后每天增加20 min,逐步適應(yīng)自然光照和有菌環(huán)境,7d 后,又死亡27株,煉苗期間共死亡40 株,死亡率48.78%。存活42株移栽大田。大田挖小坑,噴施80%多菌靈300~500倍液,進(jìn)行土壤消毒,栽入苗子,壅土壓實。輕澆薄水,視土壤墑情及時用噴霧器補水。栽植7 d 后噴灑加入0.1%尿素的水溶液1 次、噴霧80%多菌靈300~500 倍液1 次,然后每10 天噴1 次,10d 后,成活19 株。成活率23.17%。

        由表4 可以看出,金蕾二號煉苗成活率低,馴化難度大。采用方法(3)煉苗成活率相對較高,但也只有59.52%。航天黃花菜組培苗與傳統(tǒng)品種黃花菜品種組培苗相比生長勢較弱,更容易死亡。

        表4 煉苗成活率統(tǒng)計表

        2.5 大田區(qū)域試驗示范

        在位于合水縣固城鎮(zhèn)高臺村合水縣鑫慶豐黃花菜農(nóng)民專業(yè)合作社基地栽植金蕾二號組培苗試驗示范田1330 m2。試驗用苗經(jīng)過大田生長50 d 以上,根狀莖直徑0.8 cm 以上,肉質(zhì)根3 條以上,生長健壯。栽植時將地上葉片剪短至3~5 cm,行距0.85m,株距0.40 m。共栽植3900 株,成活3889 株,成活率99.71%。經(jīng)過煉苗存活下來的金蕾二號組培苗,栽植大田后抵抗力提高,與其他黃花菜品種無差異。

        3 討論與結(jié)果

        1)金蕾二號組培苗再生系統(tǒng)的生長周期明顯,花絲接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基經(jīng)過萌動膨大,誘導(dǎo)出黃色愈傷組織,繼代增殖培養(yǎng)形成芽叢,長出無根苗,無根苗在生根培養(yǎng)基中萌發(fā)出根系。不同煉苗方法成活率差異很大,需要進(jìn)一步探索。

        2)本研究結(jié)果表明,金蕾二號通過反復(fù)繼代增殖培養(yǎng),可達(dá)到大量繁殖的目的。黃花菜以花絲為外植體進(jìn)行組培快繁,可采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L、繼代培養(yǎng)基MS 培養(yǎng)基粉(不含糖和瓊脂)4.74g+瓊脂5.5g/L+6-BA 4.0mg/L+NAA0.1mg/L+3%和MS 培養(yǎng)基粉(不含糖和瓊脂)4.74g+瓊脂5.5g/L+6-BA 0.5mg/L+IBA0.2mg/L+3%蔗糖;生根培養(yǎng)基1/2MS 培養(yǎng)基粉(不含糖和瓊脂)2.47g+瓊脂5.5g/L+NAA0.2mg/L 或1/2MS 培養(yǎng)基粉(不含糖和瓊脂)2.47g+瓊脂5.5g/L+IBA0.2mg/L 的組織培養(yǎng)再生系統(tǒng)。

        3)金蕾二號黃花菜組培苗生長勢弱,煉苗難度大,成活率低。金蕾二號煉苗中存活的組培苗,抵抗能力不斷提高,移栽到大田后與其他黃花菜品種無差異。

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