趙彥龍，謝澤偉，趙守和，馬森

（深圳市坪山區(qū)人民醫(yī)院 普外科，廣東 深圳 518118）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，位居死因第二位，其發(fā)病率與死亡率一直居高不下［1］。我國(guó)目前主要采用B 超檢查和血清甲胎蛋白（AFP）進(jìn)行肝癌篩查和診斷，然而有報(bào)道［2］顯示該方法的敏感度存在差異且具有局限性，很多早期肝癌未能及時(shí)發(fā)現(xiàn)。circRNA 是一種非編碼RNA，具有閉環(huán)結(jié)構(gòu)，目前已有研究［3］表明多種circRNA 可作為肝癌診斷的標(biāo)志物。外泌體是一種可來(lái)源于多種細(xì)胞的膜性囊泡，通過(guò)傳遞細(xì)胞間物質(zhì)信息，調(diào)節(jié)腫瘤的微環(huán)境，進(jìn)而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［4］。本研究探討外泌體circRNA 在肝癌中的作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織樣本本研究收集2019 年1 月至2020 年8 月在我市某院經(jīng)病理檢查確診的20 例原發(fā)性肝癌患者的手術(shù)切除的廢棄標(biāo)本，包括肝癌患者腫瘤組織以及腫瘤邊緣5 cm 處的癌旁組織。排除具有嚴(yán)重心血管疾病、肝腎功能不全、腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病的患者的組織，納入患者均已知曉手術(shù)標(biāo)本用途并簽訂知情同意書(shū)。

1.2 外泌體提取與鑒定將所得腫瘤組織及癌旁組織存放于無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，以2 000 ×g 離心30 min 并去除雜質(zhì)，在4 ℃條件下孵育0.5 h，繼續(xù)以10 000 ×g 離心10 min，沉淀用PBS 重懸，即可獲得外泌體懸液，并在電鏡下觀察外泌體形態(tài)。

1.3 QGY－7703 和SMMC－7721 細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)染QGY－7703 和SMMC－7721 肝癌細(xì)胞采用DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)90%時(shí)，根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)將circ－CDYL 或siRNA 轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、circ－CDYL 低表達(dá)及高表達(dá)組，采用CCK－8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖。QGY－7703 和SMMC－7721 細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后加入CCK－8 試劑，隨后培養(yǎng)2 h采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。

1.5 細(xì)胞侵襲能力將Transwell 小室用Matrigel 基質(zhì)膠進(jìn)行包被，用以檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、circ－CDYL 低表達(dá)及高表達(dá)組。將無(wú)血清細(xì)胞懸液加至Transwell 室上部，將含10%血清的培養(yǎng)基加入下部，培養(yǎng)24 h 后用甲醇固定30 min，并用結(jié)晶紫染色鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織中差異表達(dá)最顯著的circRNA 為circ－CDYL本研究采用環(huán)狀RNA 芯片，對(duì)比分析20 例肝癌患者的腫瘤組織及癌旁組織中circRNA 的表達(dá)譜，結(jié)果顯示，癌旁組織與腫瘤組織中差異表達(dá)的circRNA 有161 種，其中circ－CDYL 差異表達(dá)最為顯著。

2.2 轉(zhuǎn)染后QGY－7703 和SMMC－7721 細(xì)胞外泌體中circ－CDYL 的表達(dá)水平在QGY－7703 轉(zhuǎn)染后，穩(wěn)定過(guò)表達(dá)circ－CDYL 的細(xì)胞外泌體中的circ－CDYL 含量較穩(wěn)定干擾的更多；同樣的結(jié)果在SMMC－7721 細(xì)胞中也可觀察到，穩(wěn)定過(guò)表達(dá)circ－CDYL 的細(xì)胞外泌體中circ－CDYL 的含量均顯著較高，穩(wěn)定干擾的表達(dá)則較低。見(jiàn)表1。

表1 轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)及干擾載體的QGY－7703 和SMMC－7721 細(xì)胞外泌體中circ－CDYL 的表達(dá)水平（）

表1 轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)及干擾載體的QGY－7703 和SMMC－7721 細(xì)胞外泌體中circ－CDYL 的表達(dá)水平（）

2.3 circ－CDYL 對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響在QGY－7703 和SMMC－7721 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，與circ－CDYL 高表達(dá)的細(xì)胞外泌體相比，circ－CDYL 低表達(dá)的細(xì)胞外泌體與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，細(xì)胞增殖和侵襲受到抑制。見(jiàn)表2。

表2 QGY－7703 和SMMC－7721 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后侵襲數(shù)量與CCK－8 結(jié)果（）

表2 QGY－7703 和SMMC－7721 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后侵襲數(shù)量與CCK－8 結(jié)果（）

3 討論

外泌體（exosomes）是一種膜性囊泡，直徑為40～100 nm，它可由B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、血小板以及肥大細(xì)胞等不同細(xì)胞分泌。研究［5］表明，外泌體可傳遞細(xì)胞間的物質(zhì)信息，調(diào)控腫瘤內(nèi)部的微環(huán)境，這在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注到環(huán)狀RNA（circRNA），有研究［6］發(fā)現(xiàn)circRNA 在細(xì)胞的各項(xiàng)生命活動(dòng)中均發(fā)揮重要作用，且circRNA 表達(dá)譜在腫瘤患者的腫瘤細(xì)胞與癌旁組織來(lái)源細(xì)胞間具有顯著差異，這可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前已發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)的circRNA 較多，circPVT1在胃癌組織中的表達(dá)量高于癌旁組織，可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖；circ0000096 在抑制胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮著重要的作用［7］。CiRS－7 在肝癌組織中含量較高，可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。另有研究［8］表明，circRNA＿0007874 和circRNA＿104135 在肝癌組織中顯著下調(diào)，可抑制肝癌進(jìn)展。目前已有研究［9］表明，外泌體在肝癌的發(fā)生發(fā)展中承擔(dān)著不可或缺的重要角色。外泌體的深入研究對(duì)于肝癌的篩查、診斷、分期、預(yù)后判斷及治療均有重要意義。

本研究探討外泌體circRNA 在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。首先通過(guò)基因芯片鑒定腫瘤組織與癌旁組織中circRNA 的表達(dá)差異，結(jié)果顯示circ－CDYL 是差異最為顯著的circRNA。CDYL基因位于Y 染色體上，該基因編碼表達(dá)的蛋白質(zhì)主要功能是調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育及抑制基因轉(zhuǎn)錄等［10］。據(jù)此，本研究以circ－CDYL 為靶點(diǎn)，進(jìn)一步探討其在肝癌中的作用，構(gòu)建circ－CDYL 過(guò)表達(dá)載體及干擾載體，在QGY－7703 和SMMC－7721兩種肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染，隨后提取外泌體并檢測(cè)其中circ－CDYL的表達(dá)水平，結(jié)果顯示穩(wěn)定過(guò)表達(dá)circ－CDYL 的細(xì)胞外泌體中circ－CDYL 的含量顯著較高。采用Transwell 小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲力，circ－CDYL 高表達(dá)組的細(xì)胞侵襲力更高。CCK－8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明circ－CDYL 能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖活性。

綜上，外泌體circ－CDYL 可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞增殖及侵襲的活性，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及發(fā)展，關(guān)于其具體的作用機(jī)制需要開(kāi)展進(jìn)一步的研究。