范秋麗，李茂澤，趙鑫銘，李 龍，葉金玲，茍鐘勇，王一冰，林廈菁，蔣守群*

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，畜禽育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642）

2020 年7 月1 日起，國內(nèi)已全面禁止使用促生長(zhǎng)類的抗生素藥物，因此，在肉雞生產(chǎn)中尋找安全有效的抗生素類替代物已是必然趨勢(shì)。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌（G-菌）細(xì)胞壁成分，作為一種內(nèi)毒素，肉雞生長(zhǎng)的環(huán)境和飲水中均存在LPS，LPS 可引起雞氧化應(yīng)激和免疫應(yīng)激，導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降、腸道黏膜屏障受損、免疫功能和抗氧化功能降低[1-3]，研究中常使用肌肉注射或者皮下注射建立LPS 應(yīng)激模型。維吉尼亞霉素（Virginiamycin）因效價(jià)穩(wěn)定常被添加于肉雞飼料中以達(dá)到抗菌和提高生長(zhǎng)性能的目的。葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，GOD）是一種主要由霉菌生產(chǎn)的飼用酶制劑[4]，具有促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)、提高免疫力、維持菌群生態(tài)平衡、緩解氧化應(yīng)激、保護(hù)腸上皮細(xì)胞完整性等作用[5]。溶菌酶（Lysozyme，LZ）是一種專一性地作用于微生物細(xì)胞壁的天然無毒性堿性球蛋白，主要來源于雞蛋清中[6]，具有抑菌、抗炎、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[7]。腐殖酸鈉（Sodium Humate，NaHA）是用化學(xué)方法從褐煤、風(fēng)化煤和泥炭中提取的一種多功能的高分子化合物，含有豐富的維生素、生物堿和生物活性物質(zhì)[8]，具有促生長(zhǎng)、抑菌、止痢、止瀉、消炎和提高機(jī)體抗氧化功能等作用[9]。目前，NaHA 在肉雞上單獨(dú)使用的研究報(bào)道相對(duì)GOD 和LZ較少，且三者在肉雞處于氧化應(yīng)激和免疫應(yīng)激條件下的研究報(bào)道更少。因此，本試驗(yàn)旨在研究在基礎(chǔ)日糧中添加GOD、LZ 和NaHA 對(duì)LPS 處理1～21 日齡黃羽肉雞生長(zhǎng)性能、抗氧化和免疫功能的影響，比較三者與維吉尼亞霉素的作用效果，為其在黃羽肉雞的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 LPS 為大腸桿菌血清型O55:B5，購買于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；維吉尼亞霉素純度98%，購買于華北生物科技有限公司；GOD 購買于北京挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司，酶活2 000 U/g；LZ為飼用蛋源溶菌酶（酶活45 000 U/mg），購買于浙江艾杰斯生物科技有限公司；NaHA 購買于龍蟒大地農(nóng)業(yè)有限公司，水溶性腐殖酸干物質(zhì)含量＞70%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及日糧 試驗(yàn)在廣東省農(nóng)科院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所基地進(jìn)行。選用1 440 只1 日齡（41.83±0.00）g 快大型嶺南黃羽肉公雞作為試驗(yàn)雞，采用單因素隨機(jī)分組設(shè)計(jì)，逐只稱重，根據(jù)體重一致原則隨機(jī)分為8 個(gè)組，每組6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30 只雞。分別在基礎(chǔ)日糧添加0、20 mg/kg 維吉尼亞霉素、100 mg/kg GOD、200 mg/kg GOD、400 mg/kg LZ、800 mg/kg LZ、0.3%NaHA、0.6% NaHA。試驗(yàn)期21 d，在17 和19 日齡時(shí)所有雞腹腔注射500 μg/kg 體重的LPS 誘導(dǎo)應(yīng)激。因本課題組前期研究已表明，與注射同等劑量的生理鹽水組相比，注射500 μg/kg 體重的LPS 可誘導(dǎo)免疫應(yīng)激，降低4～24 日齡肉雞生長(zhǎng)性能和免疫功能[10]，因此本試驗(yàn)中沒有設(shè)置注射生理鹽水的空白對(duì)照組?；A(chǔ)日糧為玉米豆粕型，根據(jù)《中國飼料成分及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值表》（2019 年第30 版），并參考《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 33-2004）中的營(yíng)養(yǎng)水平進(jìn)行配制（表1），不同處理組之間營(yíng)養(yǎng)水平保持一致，抗生素、GOD 和LZ 按照不同添加水平等重量替代預(yù)混料中的統(tǒng)糠。

表1 1～21 日齡肉雞基礎(chǔ)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)成分

1.3 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)雞采用地面平養(yǎng)，地面鋪放木屑，自然通風(fēng)。各處理組飼養(yǎng)管理?xiàng)l件和環(huán)境條件一致，試雞自由采食顆粒料、自由飲水，按照常規(guī)飼養(yǎng)操作規(guī)程和免疫程序進(jìn)行飼養(yǎng)和免疫。試驗(yàn)期間每天觀察記錄雞群行為、健康狀況及雞舍中每天08:00 和14:30 的溫度、濕度。記錄死亡數(shù)，及時(shí)淘汰殘次和死亡試驗(yàn)雞并對(duì)其所在欄上的剩料進(jìn)行稱重。

1.4 生長(zhǎng)性能測(cè)定 試驗(yàn)結(jié)束前一天晚19:00 斷料供水，次日08:00 以重復(fù)為單位稱體重、結(jié)料重，準(zhǔn)確記錄給料量和剩料量，統(tǒng)計(jì)平均日采食量、平均日增重、耗料增重比和死亡率。死亡率=（死亡數(shù)量/總數(shù)量）×100%。

1.5 血漿細(xì)胞因子和抗氧化指標(biāo)測(cè)定 試驗(yàn)結(jié)束，每個(gè)重復(fù)選取接近平均重的2 只雞翅靜脈采血5 mL 于抗凝管中，3 500 r/min 離心10 min 分離血漿，測(cè)定免疫球蛋白A、G、M（IgA、IgG、IgM）、γ干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素2（IL-2）、丙二醛（MDA）含量及總抗氧化能力（T-AOC）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）活性。以上試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，測(cè)定方法按照說明書操作，讀數(shù)在多功能酶標(biāo)儀（SYNERGY H1，BioTek 公司，美國）上進(jìn)行。

1.6 免疫器官指數(shù)測(cè)定 試雞采血后屠宰，分離胸腺、脾臟、法氏囊并稱重，計(jì)算以活體重為基礎(chǔ)的免疫器官指數(shù)。免疫器官指數(shù)=（疫器官重量/體重）×100%。

1.7 空腸黏膜細(xì)胞因子和抗氧化指標(biāo)測(cè)定 每只試雞空腸中部取5 cm，剪開之后用生理鹽水將內(nèi)容物沖洗干凈，載玻片刮取黏膜于1.5 mL 無菌離心管中，標(biāo)記好之后立即放入液氮凍存。取凍存的空腸黏膜樣品約0.1 g于2 mL 無菌離心管中，每管加入2 顆鎬珠，再加入9倍體積的生理鹽水，放入研磨儀（JXFSTPRP-CL，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，上海）中勻漿（50 HZ，120 s，4℃），勻漿液離心（4 000 r/min，10 min，4℃）之后取上清，即為10% 組織勻漿液?？漳c黏膜勻漿液進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定，測(cè)定指標(biāo)和方法同血漿，空腸黏膜蛋白濃度測(cè)定試劑盒為賽默飛世爾科技（中國）有限公司的Pierce Rapid Gold BCA 快速蛋白定量試劑盒。

1.8 空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)測(cè)定 每只雞取空腸中部1 cm 放于4%的多聚甲醛溶液固定，待樣品固定狀態(tài)良好后進(jìn)行修剪、脫水、包埋、切片、染色以及封片。染色的樣品使用CaseViewer2.2 掃描軟件選取目的區(qū)域進(jìn)行成像，成像時(shí)盡量讓組織充滿整個(gè)視野，保證每張照片的背景光一致，成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0 分析軟件，統(tǒng)一以μm 作為標(biāo)準(zhǔn)單位。HE 染色樣品選取50 倍成像，每張切片選取5 根完整腸絨毛測(cè)量絨毛高度、隱窩深度和黏膜厚度。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用 SPSS 19.0 軟件中的One-Way ANOVA 程序進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)處理效應(yīng)差異顯著時(shí)，用Duncan's 進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值與均值標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）表示，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 GOD、LZ 和NaHA 對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響 由表2 可知，與對(duì)照組、20 mg/kg 維吉尼亞霉素組相比，GOD、LZ 和NaHA 組體重、平均日增重、平均日采食量、耗料增重比比和死亡率均無顯著影響。

表2 GOD、LZ 和NaHA 對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

2.2 GOD、LZ 和NaHA 對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)的影響由表3 可知，與對(duì)照組相比，800 mg/kg LZ 組法氏囊指數(shù)顯著升高，且顯著高于20 mg/kg 維吉尼亞霉素組。

表3 GOD、LZ 和NaHA 對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)的影響

2.3 GOD、LZ 和NaHA 對(duì)肉雞血漿細(xì)胞因子濃度和抗氧化功能的影響 由表4 可知，與對(duì)照組相比，800 mg/kg LZ 組、0.6% NaHA 組 的IgA 含量顯著升高，且800 mg/kg LZ 組高于20 mg/kg 維吉尼亞霉素組（P＜0.05）。與對(duì)照組和20 mg/kg 維吉尼亞霉素組相比，800 mg/kg LZ 組、0.6% NaHA 組IgM 含量升高（P＜0.05），100 mg/kg GOD 組IFN-γ含量升高（P＜0.05），100 mg/kg GOD 組、800 mg/kg LZ 組、0.6% NaHA 組IL-2 含量升高（P＜0.05），800 mg/kg LZ 組T-AOC 活力升高（P＜0.05）。

表4 GOD、LZ 和NaHA 對(duì)肉雞血漿細(xì)胞因子濃度和抗氧化功能的影響

2.4 GOD、LZ 和NaHA 對(duì)肉雞空腸黏膜細(xì)胞因子濃度和抗氧化功能的影響 由表5 可知，與對(duì)照組和20 mg/kg維吉尼亞霉素組相比，800 mg/kgLZ 組分泌性免疫球蛋白（SIgA）含量升高（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，100 mg/kg GOD 組、800 mg/kg LZ 組、0.6% NaHA 組 的TNF-α含量降低（P＜0.05），且800 mg/kg LZ 組、0.6% NaHA 組低于20 mg/kg 維吉尼亞霉素組（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，各組IL-2 含量升高（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，100 mg/kg GOD 組、800 mg/kg LZ 組、0.6% NaHA 組的T-AOC 活力升高（P＜0.05），且高于20 mg/kg 維吉尼亞霉素組（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，100 mg/kg GOD組T-SOD 酶活性升高（P＜0.05），且高于20 mg/kg 維吉尼亞霉素組（P＜0.05）。

表5 GOD、LZ 和NaHA 對(duì)肉雞空腸黏膜細(xì)胞因子濃度和抗氧化功能的影響

2.5 GOD、LZ 和NaHA 對(duì)肉雞空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響由表6 可知，與對(duì)照組和20 mg/kg 維吉尼亞霉素組相比，GOD 組、LZ 組和NaHA 組空腸絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度值以及黏膜厚度均無顯著差異。

表6 GOD、LZ 和NaHA 對(duì)肉雞空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

3 討 論

3.1 GOD、LZ 和NaHA 對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響 GOD可通過降低胃腸道pH 激活胃蛋白酶原，提高消化酶活性以及促進(jìn)胃腸道蠕動(dòng)、抑制有害菌的生長(zhǎng)來改善生長(zhǎng)性能[11]。LZ 可通過提高機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和維持腸道菌群平衡提高生長(zhǎng)性能[12]。NaHA 可通過刺激胃腸道蠕動(dòng)、補(bǔ)充機(jī)體內(nèi)缺失的養(yǎng)分和促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收提高生長(zhǎng)性能[13]。本研究結(jié)果表明，GOD、LZ 和NaHA 對(duì)LPS 處理1～21 日齡黃羽肉雞的末體重、平均日增重、平均日采食量、耗料增重比和死亡率無顯著影響，此結(jié)果與湯海鷗等[14]應(yīng)用200 g/t 和400 g/t GOD（酶活＞1 000 U/g）在1～42 日 齡AA 肉雞上的研究結(jié)果和Fan 等[10]應(yīng)用500 mg/kg LZ 在4～24 日齡免疫應(yīng)激狀態(tài)下黃羽肉雞上的研究結(jié)果一致。但也有研究發(fā)現(xiàn)，1 000～4 000 U/g GOD 可增加1～21 日齡肉仔雞平均日增重、降低平均日采食量和料重比[15]；13 mg/kg 蛋源LZ（酶活45 000 U/mg）可提高1～50 日齡黃羽肉雞全期采食量和日增重[16]；0.3% NaHA（腐殖酸含量＞70%）可提高1～21 日齡AA 肉雞平均日增重，導(dǎo)致差異的原因可能與試驗(yàn)雞在生長(zhǎng)前期各項(xiàng)生理功能發(fā)育不完全和試驗(yàn)雞所處試驗(yàn)環(huán)境（應(yīng)激和非應(yīng)激）對(duì)添加物發(fā)揮作用的大小有關(guān)，說明GOD、LZ 和NaHA 在肉雞上的應(yīng)用添加應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性質(zhì)和雞的狀態(tài)調(diào)整添加劑量。

3.2 GOD、LZ 和NaHA 對(duì)肉雞免疫功能的影響 禽類免疫器官的發(fā)育、特異性和非特異性免疫均能反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱[18]。一般情況下免疫器官指數(shù)升高，免疫功能增強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，GOD 和NaHA 對(duì)LPS 處理1～21 日齡肉雞胸腺、脾臟和法氏囊指數(shù)無顯著影響。但宋海濱等[19]研究報(bào)道，添加0.15%～0.5%GOD（酶活15 U/g）可提高羅斯308 肉雞飼養(yǎng)全期胸腺、脾臟和法氏囊指數(shù)；程郁昕等[20]研究表明，添加1.0～2.5 g/kg NaHA 可提高AA 肉雞飼養(yǎng)前期胸腺、脾臟和法氏囊等免疫器官指數(shù)。結(jié)果不同的原因可能與LPS 應(yīng)激對(duì)肉雞免疫器官的發(fā)育抑制過大，造成試驗(yàn)添加的GOD 和NaHA 不足以達(dá)到促進(jìn)其生長(zhǎng)的目的。本試驗(yàn)中，添加800 mg/kg LZ 可提高LPS 處理肉雞法氏囊指數(shù)，此結(jié)果與劉偉等[16]應(yīng)用10 mg/kgLZ 在黃羽肉雞飼養(yǎng)全期的結(jié)果相似，說明800 mg/kg LZ 可通過促進(jìn)LPS 處理肉雞法氏囊的生長(zhǎng)達(dá)到提高免疫功能的目的。IgA、IgG 和IgM 是機(jī)體體液免疫反應(yīng)過程中產(chǎn)生的3 種重要免疫球蛋白，含量越高，免疫功能越強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，添加800 mg/k gLZ 可提高LPS 處理肉雞血漿IgA 和IgM 含量，提高空腸黏膜中SIgA 含量，此結(jié)果與鞠婷婷[21]在黃羽肉雞飼養(yǎng)前期的研究報(bào)道相似。0.6%NaHA 可提高LPS-處理肉雞血漿IgA 和IgM 含量，這與陳志敏等[17]應(yīng)用0.3% 和0.5% NaHA在肉雞飼養(yǎng)全期的報(bào)道相似。說明800 mg/kg LZ 和0.6%的NaHA 可通過增強(qiáng)LPS 應(yīng)激肉雞的體液免疫達(dá)到提高免疫功能的目的。IFN-γ是由有絲分裂原刺激T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有廣泛免疫調(diào)節(jié)作用的淋巴因子[22]，TNF-α作為促炎因子之一在炎癥反應(yīng)中起著重要作用[23]，IL-2 是主要由活化T 細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，對(duì)機(jī)體的免疫應(yīng)答和抗病毒感染起著重要作用[24]。本研究結(jié)果表明，100 mg/kg GOD 可提高LPS 處理肉雞血漿中IFN-γ和IL-2 含量，提高空腸黏膜中IL-2 含量，降低空腸黏膜中TNF-α含量，200 mg/kg GOD 可提高空腸黏膜中IL-2 含量。此結(jié)果與穆淑琴等[25]應(yīng)用400 g/t GOD（酶活250 U/g）在仔豬上的研究結(jié)果相似，說明GOD 可通過降低促炎因子水平和升高抗炎細(xì)胞因子水平提高LPS 處理肉雞免疫功能。而血漿和空腸黏膜中相同細(xì)胞因子呈不同變化，原因可能與相同細(xì)胞因子在機(jī)體不同部位發(fā)揮作用的方式和時(shí)間順序不同有關(guān)。本研究結(jié)果表明，添加800 mg/kg LZ 可提高LPS 處理的肉雞血漿中IL-2 含量、降低TNF-α含量，2 種濃度的LZ 均可提高空腸黏膜中IL-2 含量。此結(jié)果與李鑫等[26]應(yīng)用500 g/t LZ（酶活≥500 U/mL）降低斷奶仔豬血液炎癥指數(shù)結(jié)果相似。0.3% NaHA 可提高空腸黏膜IL-2水平，0.6%NaHA 可提高血漿和空腸黏膜IL-2 水平、降低TNF-α水平，說明LZ 和NaHA 可通過降低炎癥反應(yīng)提高LPS-處理肉雞免疫功能。

3.3 GOD、LZ 和NaHA 對(duì)肉雞抗氧化功能的影響GOD 可與過氧化氫酶組成氧化還原酶系統(tǒng)，并通過過氧化氫酶清除體內(nèi)的過氧化氫自由基，達(dá)到抗氧化的目的[4]。LZ 中含有13%帶正電荷和43.4%的疏水性堿性氨基酸殘基，這些物質(zhì)已被證實(shí)能提高清除氧化性物質(zhì)[6]。NaHA 分子中含有的醌、酚等官能團(tuán)在電子傳遞和清除自由基中起著重要作用[8]。本研究結(jié)果表明，添加100 mg/kg GOD 可提高LPS 處理肉雞空腸黏膜的T-AOC 和T-SOD 活力；添加800 mg/kg LZ 可提高血漿和空腸黏膜中T-AOC 酶活力；0.6% NaHA 可提高空腸黏膜T-AOC 活力，此結(jié)果與崔亞利等[27]應(yīng)用0.3%和0.5% GOD（15 U/g）在小鼠上的研究報(bào)道相似，與李佳等[28]應(yīng)用LZ 在奶牛上的研究結(jié)果相似，與陳志敏等[17]應(yīng)用0.3%和0.5%的NaHA 在肉雞上的研究報(bào)道一致。說明100 mg/kg GOD、800 mg/kg LZ 和0.6%NaHA 可通過提高抗氧化酶活力來提高LPS 處理肉雞的抗氧化功能。

3.4 GOD、LZ 和NaHA 對(duì)肉雞空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 絨毛高度、隱窩深度和黏膜厚度是衡量小腸消化和吸收的重要指標(biāo)。絨毛高度可直接反映小腸與養(yǎng)分之間的接觸面積，從而影響機(jī)體對(duì)養(yǎng)分的消化吸收；隱窩深度加深則表明腸黏膜形態(tài)失常和功能下降[29]。黏膜厚度決定了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過黏膜吸收至血液或者淋巴中的速率，厚度增加表明吸收速率下降，厚度減少則吸收速率增加[30]。本研究結(jié)果表明，添加GOD、LZ 和NaHA 對(duì)LPS 處理肉雞空腸絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度值、黏膜厚度均無顯著影響，說明三者對(duì)LPS 處理肉雞空腸消化吸收無明顯的促進(jìn)作用，原因可能由于試驗(yàn)成功利用LPS 建立了氧化應(yīng)激和免疫應(yīng)激模型，造成肉雞腸黏膜形態(tài)損傷嚴(yán)重，導(dǎo)致添加GOD、LZ 和NaHA 對(duì)黏膜損傷也無法修復(fù)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在LPS 處理1～21 日齡黃羽肉雞基礎(chǔ)日糧中添加100 mg/kg GOD、800 mg/kg LZ 和0.6%NaHA 可代替抗生素提高免疫功能和抗氧化功能，但對(duì)生長(zhǎng)性能和空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)無顯著影響。