鄭自彬，呂文濤，章嘯君，任 瑩，項 云，楊 華，肖英平*

（1.省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室，浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，浙江杭州 310021；2.武漢輕工大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室，湖北武漢 430023；3.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江金華 321017）

血管生成素樣蛋白4（Angiopoietin-like 4，ANGPTL4）又稱禁食誘導(dǎo)脂肪因子（FIAF）或過氧化物酶體增殖物激活受體-γ血管生成素相關(guān)蛋白（PGAR），可調(diào)控機體脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，并參與介導(dǎo)腸道微生物區(qū)系對脂肪沉積的調(diào)節(jié)，在脂肪和能量代謝中起著重要作用[1-3]。Lichstein 等[4]提出ANGPTL4 可由脂肪組織、肝臟、骨骼肌、心臟和腸道等多種組織分泌，隨后被切割成N-末端和C-末端片段，其中ANGPTL4 的N-末端作為脂蛋白脂酶（LPL）抑制劑發(fā)揮作用。LPL 最初被認為由有限數(shù)量的心肌細胞和脂肪細胞產(chǎn)生，由GPIHBP1 蛋白運輸?shù)矫氀軆?nèi)皮細胞的管腔一側(cè)，催化甘油三酯（TG）水解成脂肪酸，使血液循環(huán)中的脂質(zhì)吸收到骨骼肌、心臟和脂肪組織中[5-7]。丹麥哥本哈根心臟研究中心研究表明，人ANGPTL4缺失變異時，血清TG 濃度會相對降低，其中在南亞和歐洲人群中，ANGPTL4缺失者血清TG 降低35%[8]。此外，ANGPTL4 還是腸道脂肪消化酶的內(nèi)源性抑制劑，通過抑制腸道中的胰脂酶防止餐后脂肪的過度攝取，以及腸道細胞脂質(zhì)過載[9-10]。在食物攝入量、能量消耗或運動活動方面無差異的情況下，給小鼠飼喂高脂日糧，缺乏ANGPTL4的小鼠體重增加，糞便中脂質(zhì)含量減少，腸道細胞中TG 積累量增加，這與其腸腔脂肪酶活性升高相一致[9]。

雖然ANGPTL4 在機體能量平衡和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要作用，然而目前對于ANGPTL4 在豬方面的研究較少。豐勝求等[11]研究表明ANGPTL4在豬的各組織中存在廣譜性表達，其在脂肪組織、腸道、肝臟和腎中表達較為豐富，在心臟、脾、胃和肺等組織中有少量表達；且脂肪型的通城豬脂肪和肝臟中ANGPTL4mRNA表達量顯著高于瘦肉型的長白豬。張麗萍[12]研究表明ANGPTL4在豬的肝臟、心臟、脂肪組織和胃腸道中均有表達，且在脂肪組織中表達量最高，同時通過細胞培養(yǎng)等方法證明了多形擬桿菌可抑制豬回腸ANGPTL4的表達。然而，作為腸道微生物參與介導(dǎo)豬脂質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)因子，ANGPTL4 在腸道中的表達分布情況目前并不清楚。金華豬作為我國重要的地方優(yōu)良品種，具有體脂率高、肉質(zhì)好等特點，也是主要的肥胖表型和脂肪沉積研究模型動物[13-14]。本研究分析了金華豬腸道不同部位ANGPTL4 免疫陽性細胞的分布情況和形態(tài)特征，并進一步研究了金華豬腸道不同部位ANGPTL4的表達水平及其不同日齡階段的發(fā)育性變化，為ANGPTL4 在豬的消化生理和脂肪代謝調(diào)控研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與樣品采集 在金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗?zāi)翀鲞x擇同批次的60 頭金華豬進行飼養(yǎng)，在飼養(yǎng)期間自由采食和飲水，按照常規(guī)方法進行預(yù)防免疫和飼養(yǎng)管理。分別在45、90、150 日齡和270 日齡各選擇4 頭金華豬進行屠宰，去除腸道內(nèi)容物后，取十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸等組織用液氮速凍后置于干冰中轉(zhuǎn)運至實驗室，-80℃保存用于熒光定量PCR 分析；并取270 日齡金華豬不同腸段組織，固定于4%多聚甲醛中，用于免疫組化分析。

1.2 切片免疫組化實驗 取金華豬十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、盲腸等組織樣品固定于4%多聚甲醛24 h以上并保存于脫水盒中，將脫水盒放入脫水機中經(jīng)梯度酒精脫水，浸蠟包埋后制成石蠟切片，將石蠟切片脫蠟至水，然后置于盛滿檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)。用3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉后用配備好的一抗4℃濕盒孵育過夜。隨后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗（HRP 標記）覆蓋組織，室溫孵育50 min，DAB 顯色液進行顯色，陽性為棕黃色。最后用光學(xué)顯微鏡鏡檢，并采集圖像分析。石蠟切片免疫組化結(jié)果判讀：蘇木素染細胞核為藍色，DAB 顯出的陽性表達為棕黃色。

1.3 總RNA 提取和cDNA 的制備 采用TRIzol?Plus RNA Purification Kit（Invitrogen）和RNase-Free DNase Set（Qiagen）試劑盒提取RNA，采用Nanodrop-2000檢測RNA 濃度及其質(zhì)量，同時使用試劑盒SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR（Invitrogen）將所提取RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4 熒光定量PCR 采用Primer Premier 6.0 和Beacon designer 7.8 軟件進行定量PCR 引物設(shè)計（表1），然后由生工生物工程（上海）股份有限公司負責(zé)合成，引物序列見表1。

RT-PCR 采用20 μL 擴增體系：滅菌水SDW 8 μL，熒光染料Power SYBR? Green Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，模板cDNA 1 μL。在CFX384 多重實時熒光定量PCR 儀（Bio-Rad，美國）中進行實時熒光定量PCR。PCR 反應(yīng)程序為95℃ 1 min；40 個循環(huán)（95℃ 15 s，63℃ 25 s，收集熒光），55～95℃制作熔點曲線。

1.5 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0 軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA）并使用LSD 進行多重比較，ANGPTL4基因的相對表達水平以2（Ct 內(nèi)參基因－Ct 目的基因）進行統(tǒng)計分析。用Graphpad 軟件作圖展示ANGPTL4在不同腸段和不同生長階段的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色 免疫組織化學(xué)顯示ANGPTL4陽性細胞沿著十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸等5 個主要腸段分布（圖1），圖中箭頭指向細胞即為免疫陽性細胞（細胞核為藍色，免疫反應(yīng)產(chǎn)物主要分布在胞質(zhì)中呈棕黃色），在小腸段中空腸的染色效果較強，回腸次之，十二指腸較弱，同時在盲腸和結(jié)腸中也大量分布但并無差異。與絨毛區(qū)域相比，隱窩區(qū)域內(nèi)ANGPTL4 染色陽性的上皮細胞更為豐富。

圖1 金華豬腸道ANGPTL4 免疫陽性染色細胞分布情況和形態(tài)特征

2.2 不同腸段ANGPTL4的相對表達量 通過進一步對金華豬不同腸段中ANGPTL4的表達分析發(fā)現(xiàn)，ANGPTL4在金華豬各腸段中均有表達（圖2），其中空腸ANGPTL4相對表達量最高，回腸次之，而十二指腸、結(jié)腸和盲腸ANGPTL4的相對豐度較小，其中空腸ANGPTL4相對表達量顯著高于十二指腸和結(jié)腸，回腸、十二指腸、結(jié)腸和盲腸間無顯著差異。

圖2 不同腸段ANGPTL4 相對表達量

2.3 不同日齡金華豬各腸道ANGPTL4相對表達量 通過對不同日齡金華豬各腸段ANGPTL4基因相對表達量分析發(fā)現(xiàn)，隨著日齡的增長，各腸段ANGPTL4表達量均有下降的趨勢（圖3）。金華豬空腸ANGPTL4相對表達量與45 日齡相比，270 日齡下降了80.38%（P＜0.05）；同時，盲腸ANGPTL4相對表達量在90 日齡達到最高，與270 日齡相比，高出了66.5%（P＜0.05）；且結(jié)腸ANGPTL4表達量與45 日齡相比，在270 日齡下降了65.42%（P＜0.05）。雖然金華豬十二指腸和回腸ANGPTL4相對表達量在不同日齡間并無顯著差異，但這2 個腸段均在90 日齡時ANGPTL4相對表達量達到最高，隨后逐漸降低。

圖3 不同日齡金華豬各腸段ANGPTL4 相對表達量

3 討 論

大量研究表明，ANGPTL4 可由脂肪組織、胃腸道、肌肉、心臟等多種組織分泌產(chǎn)生，也受多種物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生，如腸道微生物、短鏈脂肪酸和高脂飼糧等[15-22]。在人類中，ANGPTL4的表達普遍存在于許多組織中，尤其在脂肪組織和小腸中高表達[15]。在小鼠中，白色和棕色脂肪組織中ANGPTL4mRNA 水平最高，同時在腸道中也有較高的表達量[16-17]。在豬體中，ANGPTL4在白色脂肪組織、腸道、肌肉、心臟、胃、肝、肺、脾和腎臟等組織中普遍存在，但在腸道和白色脂肪組織中有較高的表達量[11,18]。ANGPTL4 的表達受多種物質(zhì)影響，Alex 等[19]提出ANGPTL4 是腸道微生物區(qū)系和脂肪儲存之間的循環(huán)介質(zhì)，其中腸道微生物產(chǎn)生的短鏈脂肪酸（SCFA）能有效地刺激結(jié)腸腺癌細胞ANGPTL4 的合成；且SCFA 可激活過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARγ）誘導(dǎo)ANGPTL4 的產(chǎn)生。此外，Aronsson[20]通過對飼喂高脂飼料并添加益生菌副乳桿菌（Lactobacillus paracasei ssp paracasei F19）的小鼠進行了飲食干預(yù)研究，發(fā)現(xiàn)給予F19 的小鼠體脂顯著減少，且F19 的潛在分泌因子可誘導(dǎo)ANGPTL4基因表達，并部分作用于PPARα和PPARγ，表明通過操縱腸道菌群可改變ANGPTL4表達量。Mamedova 等[21]提出雖然肝臟和脂肪組織是牛ANGPTL4 的主要來源，且顯著高于腸道組織的表達量，但該蛋白在瘤胃上皮中的表達量高度豐富，表明共生微生物影響了反芻動物胃腸道中ANGPTL4 的合成和分泌。Nielsen[22]等發(fā)現(xiàn)飼喂豬全脂牛奶可增加腸道ANGPTL4mRNA 含量，并使排泄物中脂肪酸含量升高，證明乳脂中廣泛的飽和脂肪酸誘導(dǎo)了豬腸道ANGPTL4 的產(chǎn)生。

本實驗通過免疫組織化學(xué)分析，從高倍鏡染色圖像中可以看出ANGPTL4 染色陽性的上皮細胞在金華豬十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸中均有分布，且在空腸和回腸中分布較為豐富，在十二指腸、結(jié)腸和盲腸中則較為稀少。Alex[3]等通過免疫組織化學(xué)分析，在免疫熒光中發(fā)現(xiàn)ANGPTL4 與腸內(nèi)分泌細胞（EEC）標志物嗜鉻粒蛋白A（ChgA）在人腸道中有特異性的共定位，證明了ANGPTL4 由EEC 在人體腸道中產(chǎn)生。此外，本實驗通過RT-PCR 分析得出在金華豬十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸和盲腸組織中，均有ANGPTL4基因表達，且空腸表達量最高，這與免疫組化得到的結(jié)果相一致。

在90 日齡后，隨日齡增長金華豬腸道ANGPTL4表達量呈下降趨勢。同時，隨著ANGPTL4表達量的下降，腸道胰脂酶活性會相對升高，則腸道細胞脂質(zhì)吸收量上升[9]。Miao[23]等比較長白豬與金華豬2 個品種在35～125 日齡的胴體組成發(fā)育規(guī)律，發(fā)現(xiàn)金華豬胴體脂肪含量顯著高于長白豬，且胴體瘦肉率顯著低于長白豬，同時，其胴體脂肪含量也隨著日齡的增加而增加。此外，Xiao[14]等研究表明，與長白豬相比，金華豬有很高的脂肪沉積傾向，這均與本實驗結(jié)果相一致。綜上所述，ANGPTL4在豬腸道中的表達調(diào)控在豬脂質(zhì)代謝中起著一定的作用，而ANGPTL4 作為腸道微生物區(qū)系和脂肪儲存之間的循環(huán)介質(zhì)[19]，是否可以通過調(diào)控腸道微生物來調(diào)節(jié)ANGPTL4 的表達以干預(yù)豬脂質(zhì)代謝等有待于進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究通過免疫組織化學(xué)和RT-PCR 分析，均得出在金華豬十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、盲腸等組織上皮細胞均有ANGPTL4基因表達，且在空腸中的相對表達量較高。同時在90 日齡后，隨著日齡增加金華豬各腸段ANGPTL4表達量呈下降趨勢。