宋 蕊，張鑫悅，周紅輝，謝瀟瀟，盧彥平

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心，北京 100853

拉森綜合征(Larsen syndrome OMIM 150250)為一種罕見的先天性骨骼畸形病，主要特點為雙側肘關節(jié)脫位、髖部脫位、膝關節(jié)脫位、外翻足以及鏟狀指(尤以大拇指為重)，典型的面部表現為面中部發(fā)育不全、鼻梁凹陷、眼距過遠、前額突出[1-3]。拉森綜合征的病因為FLNB 基因雜合突變，并呈常染色體顯性遺傳[4]。該基因的雜合錯義突變最早于2004 年在4 種骨骼畸形疾病中被報道，其中包括一個常染色體顯性遺傳的拉森綜合征家系[5-6]。本文報道1 例于孕25+2周引產胎兒，娩后見雙側肘關節(jié)、膝關節(jié)攣縮固定，馬蹄足畸形，鼻梁凹陷、面中部扁平等表型。經Next-generation sequencing panel 家系 測序 確定引產兒為FLNB c.565T＞C(p.189,W＞R)雜合突變，經一代測序驗證雙親及第二胎基因型為野生型，無明顯臨床表型。

資料與方法

1病例資料 本研究經解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心倫理委員會批準，并獲得胎兒父母的知情同意，倫理批號為2018TM-11。2015 年6 月解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心招募了1 例宮內超聲及引產后關節(jié)攣縮表現胎兒的家庭。獲取了胎兒肌肉組織、父母雙方外周血DNA 和詳細臨床資料。隨訪該家庭第二胎情況。

2基于二代測序的目標外顯子檢測 引產后取胎兒組織1 g 進行冷凍切片，夫妻雙方外周血4 mL存于EDTA 管。應用試劑盒(天根) 提取基因組DNA。采用IDT 公司xGen? ExomeResearch Panel v1.0 捕獲芯片獲取目標基因，Illumina Hiseq Xten平臺測序。應用分析軟件BclToFastq 得到原始數據(raw data)，使用BWA 與NCBI 人參考基因組(hg19)進行比對。使用Samtools 與Pindel 檢測及注釋單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和序列的插入或缺失(InDels)，根據ACMG 發(fā)布的方案評估變異的致病性[7]。對目標序列進行PCR 后，經ABI3730 測序儀進行Sanger 測序驗證，并經序列分析軟件得到驗證結果。xGen? ExomeResearch Panel v1.0 芯片是基于羅氏芯片，參考Omim 數據庫，使用91867 個探針于3372 個基因外顯子區(qū)域捕獲共7465978 bp，該外顯子區(qū)域與4213 個已知的符合孟德爾遺傳規(guī)律的疾病相關。

結果

1孕婦及胎兒情況孕 婦28 歲，孕2 產2，2015 年第一胎系自然妊娠；無危險因素暴露史；夫婦身體健康，無血緣關系；無家族遺傳病史。胎兒于孕24+1周行超聲提示：股骨長3.75 cm，接近同孕周標準股骨長度-2SD[8]。肱骨偏短(2.56 cm)，于孕25+2周引產。娩出后體表尸檢可見多發(fā)畸形，包括額部寬闊，額中部突出，鼻梁凹陷、面中部扁平、小下頜，雙側肘關節(jié)、膝關節(jié)攣縮固定，雙拇指呈鏟狀指，雙手指末端關節(jié)固定攣縮，雙側踝關節(jié)扭曲固定，腳背部過伸、馬蹄足畸形，雙側大腳趾末端明顯膨大。行X 線檢查可見雙側輕度彎曲的股骨，兩側干骺端膨大，頸1 椎體與頸2 椎體間隙增寬，腰4、腰5 椎體見縱向裂縫(圖1)。2018 年第二胎系自然受孕，孕期超聲未提示異常，足月順娩一活男嬰，現體健，無異常表型。

圖1 引產兒超聲、X 線及體表檢查表型A：X 線片正面觀可見雙側輕度彎曲的股骨，兩側干骺端膨大；B：X 線片側面觀可見頸1 椎體與頸2 椎體間隙增寬(橙色箭頭)，腰4、腰5 椎體見縱向裂縫(綠色箭頭)；C：引產兒超聲圖可見小下頜；D：引產兒超聲圖股骨長3.75 cm；E：引產兒超聲圖雙足底與小腿長軸可在同一水平面顯示，右足底足尖朝內，左足底足尖朝外；F：引產兒超聲圖，肱骨短，長約2.56 cm；G：引產兒全身觀，額部寬闊，額中部突出，鼻梁凹陷，面中部扁平，小下頜，雙側肘關節(jié)、膝關節(jié)攣縮固定，雙側踝關節(jié)扭曲固定，腳背部過伸、馬蹄足畸形；H：引產兒半身觀，可見額部寬闊，額中部突出，鼻梁凹陷、面中部扁平、小下頜，雙拇指呈鏟狀指，雙手指末端關節(jié)固定攣縮；I：引產兒右足，踝關節(jié)扭曲固定，腳背部過伸、馬蹄足畸形，雙側大腳趾末端明顯膨大；J：引產兒左足；K：引產兒左手，拇指呈鏟狀指，手指末端關節(jié)固定攣縮Fig.1 Ultrasound,X-ray and body examination results of the fetus A:Front X-ray view showing bilateral slightly curved femurs with both metaphysis distended;B:Lateral X-ray view showing widening of the space between C1 and C2 centrum (orange arrow),coronal clefts in L4 and L5 centrum (green arrow);C:Ultrasonography of the fetus showing micrognathia;D:Ultrasonography of the fetus shows the femur length is 3.75 cm;E:Ultrasonography of the fetus shows the long axis of both plantar and leg can be displayed on the same horizontal plane,with the right plantar apex facing inward and the left plantar apex facing outward;F:Ultrasonography of the fetus shows the length of humerus is 2.56 cm;G:Appearance of the proband:broad forehead,prominent middle forehead,depressed nasal bridge,flatten middle face,micrognathia,contracture and fixation of bilateral elbow and knee joints,spatulate thumbs,contracture of bilateral distal interphalangeal joint,bilateral wrist joints extension contracture and talipes;H:Appearance of the fetus(half length):broad forehead,prominent middle forehead,depressed nasal bridge,flatten middle face,small lower jaw,contracture of bilateral distal interphalangeal joint,spatulate thumbs;I:Appearance of the right foot of the fetus:bilateral wrist joints extension contracture and talipes,and obviously enlargement of the bilateral big toes;J:Appearance of the right foot of the fetus;K:Appearance of the left hand of the fetus:contracture of bilateral distal interphalangeal joint,spatulate thumbs

2畸形胎兒基于二代測序的目標外顯子檢測 通過4000 種人類孟德爾遺傳病NGS panel 檢測，在引產兒肌肉組織中檢測出FLNB c.565T＞C(p.189，W＞R)雜合突變。生物信息學分析表明，這種錯義突變具有致病性。c.565(E3)T ＞C 可引起第189 位的色氨酸變?yōu)榫彼幔@可能導致蛋白產物氨基酸序列第1～239 位肌動蛋白結合結構域(ABD)及第139～239 位中的鈣蛋白同源結構域(CH2)功能丟失。該突變位于內外顯子交界，可能引起剪切位點的改變，從而導致蛋白結構的嚴重改變。該蛋白從人類至熱帶爪蟾高度保守。此突變在1000 genome Project、ExAC 等數據庫中未見報道，在其他文獻中有致病性報道。

3家系一代測序位點驗證 經一代測序確定，其父母為野生型，后期隨訪中第二胎的羊水經一代測序驗證同位點為野生型，符合常染色體顯性遺傳特征。從而提示引產兒可能患有拉森綜合征(Larsen syndrome OMIM 150250)[2,9]。見圖2。

圖2 FLNB 基因突變分析A：FLNB 的基因組結構。突變位于外顯子3 內，圖中省略了第5～39 號外顯子；B：部分FLNB 編碼蛋白結構，黑色標記為突變位置，p.189,W＞R；C：一代測序圖證實引產兒存在c.565（E3）T＞C 突變，其父母為野生型；D：蛋白保守性分析提示在人類、黑猩猩、恒河猴、家鼠、紅色原雞、河豚和非洲爪蟾中均有保守性Fig.2 Mutation analysis of FLNB A:Genomic structure of FLNB:the mutations was identified in exon 3;B:Part of the FLNB-encoded protein structure is shown,with the mutation site marked by blue arrow (p.189,W＞R);C:Sequence chromatogram confirmed that the fetus had the heterozygosis mutation,while the parents had wild type gene;D:The conserved protein analysis indicated that it was conserved in human,Ptroglodytes,Mmulatta,Mmusculus,Ggallus,Trubripes and Xtropicalis

討論

FLNB 基因(OMIM 603381)位于3 號染色體p14.3，最早于1998 年被Takafuta 等[10]發(fā)現。編碼包含2602 個氨基酸的絲蛋白B(Filamin B)，一種多域單體蛋白[11]。包括由兩個鈣蛋白同源結構域(CH1 和CH2) 構成的肌動蛋白結合結構域(ABD)，以及一個由24 個同源重復序列組成的桿狀結構域，其中分別有兩個重復序列15 和16 以及重復序列23 和24 鏈接成的鉸鏈結構(hinge-1和hinge-2)[12]。該蛋白在骨骺生長板軟骨細胞中表達，作為一種多功能信號支架與多種受體、通道、細胞內信號分子和轉錄因子相互作用，如肌動蛋白、絲狀蛋白結合蛋白-1(FBLP-1)、早老蛋白和糖蛋白Ibα(GPIbα)，對正常細胞生長、分裂(增殖)，軟骨細胞成熟(分化)骨化有重要意義[13-14]。

FLNB 的突變與一組骨骼發(fā)育不良疾病(SCT，LS-AO-BD)相關[15-16]。該組疾病一般分為兩種，一種為純合突變或復合雜合突變導致的常染色體隱 性遺傳疾病Spondylocarpotarsal synostosis 綜合征 (spondylocarpotarsal syndrome，SCT ；OMIM 272460)；另一種為常染色體顯性遺傳的骨發(fā)育不全征Ⅰ型和Ⅲ型(atelosteogenesis ⅠAOⅠ；OMIM 108720；atelosteogenesis Ⅲ，AOⅢ；OMIM 108721)，回飛鏢樣骨發(fā)育不全癥(boomerang dysplasia，BD；OMIM 112310)及拉森綜合征(Larsen syndrome；OMIM 150250)，統(tǒng)稱LS-AO-BD 疾病[12,17-19]，其中AOⅢ的少數個體可存活，AOⅠ和BD 胎兒均死亡[20]。目前認為常染色體隱性遺傳的SCT 與常染色體顯性遺傳的LS-AO-BD 疾病在發(fā)生機制上存在差異。前者主要表型為身材矮小、脊柱側凸前凸、腕/跗骨關節(jié)融合、肋骨缺失畸形，往往是因蛋白質截短，導致蛋白表達缺失，后者常因CH2 區(qū)和第一桿狀結構域的氨基酸改變引發(fā)；而且SCT 雜合突變攜帶者往往無明顯癥狀或輕微表型，這提示LS-AO-BD 疾病可能與雜合突變造成的基因功能不全無關[10,21-22]。有學者篩選出FLNB中致病性相對較高的位點(W148R，F161C 和L171R)進行蛋白結構對比與分析，提示這些致病變異可能會改變蛋白的結構與性質，從而使肌動蛋白-絲蛋白間的相互作用失調[10]。但LS-AO-BD疾病具體的發(fā)病機制仍待進一步研究。

本文中通過panel 家系檢測在引產兒中發(fā)現FLNB c.565(E3)T＞C(p.189,W＞R) 雜合突變，該錯義突變引發(fā)的氨基酸改變位于鈣蛋白同源結構域(CH2)內，可導致肌動蛋白結合結構域及鈣蛋白同源結構域(CH2)的功能丟失，形成的異常蛋白可干擾軟骨細胞正常增殖或分化，影響骨化并導致拉森綜合征表型出現[23]。引產兒表型中包含明顯的小下頜、雙側肘關節(jié)和膝關節(jié)攣縮固定、雙拇指呈鏟狀指、雙手指末端關節(jié)固定攣縮、馬蹄足畸形。雙側大腳趾末端明顯膨大等拉森綜合征(Larsen syndrome OMIM 150250)的表現[2]。其父母及第二胎為野生型，無臨床表型，符合常染色體顯性遺傳特征。有文章報道FLNB c.565T＞C 突變與骨發(fā)育不良Ⅰ型(atelosteogenesis，typeⅠAOⅠ；MIM 108720)有關[24]。但該胎兒表型及X 線片特征并未出現典型骨發(fā)育不良Ⅰ型表型(窄胸廓、肱骨、股骨遠端發(fā)育不良、胸椎發(fā)育不良等[15])。同時也有文獻報道c.502G＞T(G168C) 突變與LS、AOⅠ和AOⅢ三種疾病有關[2,13,17]。這種的交叉性的具體成因尚不清楚，可能仍需要對變體蛋白進行結構與功能的研究，以建立表型與基因型之間的關系[12]。

此外，通過panel 我們還發(fā)現了引產兒FLNB c.6773(E41)C＞G(p.2258,S＞C)雜合突變，與父親基因型相同，母親野生型，不符合家系共分離。COL2A1 c.2999(E43)C＞T(p.1000，P ＞L)，c.1913(E29)C＞T(p.638，T＞I) 復合雜合突變，與母親基因型相同，父親為野生型。COL2A1 突變可導致骨發(fā)育不全Ⅱ型(osteogenesis imperfecta typeⅡ OⅢMIM 166210)，為常染色體顯性遺傳。主要表型為短肋、嚴重的四肢短小，常在胎兒期死亡[25-27]，與引產兒表型不符，且不符合家系共分離表現。故不考慮骨發(fā)育不全Ⅱ型診斷。