運 行，魏 鈺，魏 民

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心 骨科，北京 100853

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA) 作為常見的退行性疾病，以軟骨退變?yōu)樘卣鞅憩F(xiàn)[1]。當關(guān)節(jié)軟骨中的唯一細胞群——軟骨細胞受損時，其分泌的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM) 代謝 紊亂，導致關(guān)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，最終發(fā)展為OA。線粒體自噬可清除去極化或受損的線粒體，保護細胞，是維持細胞穩(wěn)態(tài)的主要機制[2]。當線粒體自噬受損時，損傷線粒體堆積在胞質(zhì)內(nèi)，促進胞內(nèi)炎性反應，進一步導致軟骨細胞死亡，ECM 降解，造成OA。瘦素是由脂肪、軟骨等組織產(chǎn)生、ob基因表達的肽類激素[3]。既往研究表明，瘦素主要通過促進軟骨細胞的分解代謝起到推動OA 發(fā)展的作用。但瘦素是否通過干預軟骨細胞線粒體自噬過程促進細胞分解代謝目前未見報道。因此，本研究使用瘦素干預OA 軟骨細胞，分別從mRNA及蛋白水平檢測自噬相關(guān)因子的表達變化規(guī)律，從而探索瘦素在線粒體自噬調(diào)節(jié)中的作用及其與軟骨細胞退變的關(guān)系。

材料和方法

1標本來源 軟骨組織標本均來源于解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心骨科因重度OA 行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者的廢棄軟骨組織。納入標準：1)符合骨關(guān)節(jié)炎臨床表現(xiàn)、影像學診斷標準；2)否認其他疾患。排除標準：1)既往關(guān)節(jié)感染病史；2)類風濕關(guān)節(jié)炎病史；3)術(shù)前傳染病篩查乙肝、梅毒等陽性。取材位置分別位于脛骨平臺內(nèi)外側(cè)，共14 例，其中男性4 例，女性10 例，年齡(60.6±4.26)歲。原發(fā)性O(shè)A 的診斷標準參照美國風濕病學會膝OA 診斷標準[4]。本研究獲得解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心醫(yī)學倫理委員會批準，并征得患者術(shù)前知情同意。

2主要試劑和抗體 α-MEM 培養(yǎng)基、Ⅱ型膠原酶、HBSS 緩沖液、胎牛血清(Gibco)、GAPDH 單克隆抗體、Parkin 單克隆抗體、LC3A 單克隆抗體、LC3B 單克隆抗體、MMP-13 單克隆抗體(Abcam)、PBS 緩沖液(Corning)；重組人瘦素(菲恩生物科技公司)；總RNA 提取試劑盒、通用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(翊圣生物公司)；Realtime PCR 熒光定量試劑盒、膜封閉液、SDS-PAGE 試劑盒(索萊寶公司)等。

3OA 原代軟骨細胞的分離培養(yǎng)與干預 于全膝置換術(shù)中取下廢棄的人脛骨平臺軟骨，無菌低溫保存。在超凈工作臺內(nèi)，采用無菌眼科剪將軟骨片剪碎成1 mm3的小軟骨塊，加入8 倍體積的0.2%Ⅱ型膠原酶、2 倍體積的HSBB 液(含Ca2+)，37℃消化2 h，離心5 min，棄上清。底部沉淀使用含20% FBS 軟骨細胞培養(yǎng)基混勻，接種至75 mL 培養(yǎng)瓶中，置于37℃恒溫、5% CO2體積分數(shù)及飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)10 d，定期更換培養(yǎng)液。取生長狀態(tài)良好的OA 原代細胞懸液以5×105/mL 的細胞密度接種于大號培養(yǎng)皿中，37℃、5% CO2孵育箱培養(yǎng)，每2 d 換液1 次，待細胞鋪滿70% 皿底后，更換為無血清的α-MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細胞周期相對同步化。將軟骨細胞隨機分為瘦素低濃度組(10 ng/mL)、瘦素高濃度組(100 ng/mL)以及空白對照組，瘦素原液稀釋為工作液后采用移液槍分別加入細胞培養(yǎng)基中，輕晃搖勻。

4Parkin、LC3A、LC3B 和MMP13 基因表達檢測 6 孔板培養(yǎng)軟骨細胞，待細胞融合率達30%～40%時，采用Total RNA Extraction Kit 試劑盒提取細胞RNA，核酸蛋白分析儀檢測RNA 含量與純度，1%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA 片段的完整性。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照PCR 試劑盒說明書進行Parkin、LC3 和MMP13 mRNA 的檢測。采 用ACTB(β-Actin) 為內(nèi)參基因。利用2-ΔΔCT法分析相應基因表達，實驗重復3 次，取均值。

5Parkin、LC3A、LC3B 和MMP13 蛋白表達檢測 于瘦素干預24 h 后，檢測線粒體自噬蛋白表達量。步驟如下：將培養(yǎng)液吸出，4℃預冷PBS 漂洗兩遍，加入200 μL RIPA 蛋白抽提試劑(50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.1% SDS)和蛋白酶抑制劑Protease inhibitor cocktail(Roche)，冰上孵育20 min 后，離心機1 200 r/min(4℃)離心20 min，取上清。95℃變性5 min。每組蛋白上樣量為15 μg/孔，15% SDS-PAGE 電泳分離。之后采用恒定電流將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，轉(zhuǎn)膜時間約90 min。將PVDF 膜完全浸沒于5% BSA-TBST 中，水平搖床輕搖1 h。1%BSA/5% milk 稀釋一抗，4℃水平搖床孵育過夜。次日，使用TBST 洗膜3 次，每次5 min 30 s。Milk Blocking Buffer 稀釋二抗，山羊抗兔，山羊抗鼠IgG(H+L) HRP 1∶5 000，室溫孵育50 min。TBST洗膜4 次，每次5 min。ECL 滴加到膜的蛋白面，反應3 min 30 s；膠片曝光10 s～5 min(曝光時間隨不同光強度而調(diào)整)，顯影2 min，定影。應用Image J 軟件掃描測定灰度值。

6JC-1 染色測定OA 軟骨細胞線粒體膜電位 JC-1是一種廣泛使用的小分子線粒體膜電位探針，當細胞內(nèi)線粒體膜電位處于高水平狀態(tài)時，JC-1 探針大多聚集在線粒體的基質(zhì)中以聚合物形式存在，此時主要產(chǎn)生紅色熒光；當線粒體膜電位下降偏低時，JC-1 主要為單體狀態(tài)而產(chǎn)生綠色熒光，紅/綠熒光強度比值降低。在共聚焦小皿中接種OA 細胞后，在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。取適量JC-1 DMSO 儲存液轉(zhuǎn)移至微型管中后，加入適量的培養(yǎng)基立即吹打10 次混勻后配置成工作液加入培養(yǎng)皿中。在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30～60 min。除去上清液，用HBSS 洗滌細胞2 次。加入Imaging Buffer Solution 后在共聚焦顯微鏡下觀察細胞線粒體紅綠熒光強弱變化，應用Image J 軟件定量分析紅綠熒光比例。

7統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1Parkin、LC3A、LC3B 和MMP13 基因表達結(jié)果 瘦素干預OA 軟骨細胞后24 h，實驗組軟骨細胞內(nèi)自噬相關(guān)基因Parkin、LC3A 及LC3B 表達量低于對照組，其中Parkin 與LC3A 基因表達量較對照組呈下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義；LC3B表達明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；MMP13表達高于空白對照組(P＜0.01)(圖1)。

圖1 不同濃度瘦素組干預人OA 軟骨細胞24 h 后不同基因表達量(aP＜0.01，vs control group)Fig.1 Expression of genes in human OA chondrocytes treated with different concentrations of leptin for 24 hours (aP＜0.01,vs control group)

2Parkin、LC3A、LC3B 和MMP13 蛋白表達結(jié)果 瘦素干預正常軟骨細胞24 h 后，低濃度組與高濃度組軟骨細胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白Parkin 和LC3B表達量低于空白對照組(P＜0.05)；LC3A 表達量低于空白對照組，但差異無統(tǒng)計學意義；隨著瘦素濃度的增加，兩個濃度組MMP13 表達量均逐漸增加，兩組差異有統(tǒng)計學意義(圖2，圖3)。

圖2 不同濃度瘦素組干預24 h 后OA 軟骨細胞線粒體自噬相關(guān)蛋白表達條帶Fig.2 Expression of mitophagy related proteins in OA chondrocytes after 24 hours of intervention with different concentrations of leptin

圖3 不同濃度瘦素組干預OA 軟骨細胞后線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(aP＜0.01 vs control group,bP＜0.05 vs control group)Fig.3 Expression of mitophagy-related proteins in OA chondrocytes treated with different concentrations of leptin (aP＜0.01 vs control group,bP＜0.05 vs control group)

3OA 軟骨細胞JC-1 探針觀察及熒光強度測定 本研究中，OA 軟骨細胞紅綠熒光比值為1.36，瘦素干預后高、低濃度瘦素組紅綠熒光比值均明顯下降(P＜0.05)(圖4、圖5)。

圖4 共聚焦顯微鏡觀察瘦素干預后線粒體膜電位的變化Fig.4 Changes of mitochondrial membrane potential after leptin intervention observed by confocal microscope

圖5 不同濃度瘦素組干預OA 軟骨細胞后熒光變化定量分析(aP＜0.01 vs control group)Fig.5 Quantitative analysis of fluorescence changes after intervention in OA chondrocytes (aP＜0.01 vs control group)

討論

OA 是最常見的關(guān)節(jié)退行性疾病，通常表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹以及活動受限等，影響了世界約2.5 億人口[5]。OA 的病理過程非常復雜，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨退變，同時伴有軟骨下骨硬化等諸多病理學改變[1]。成熟軟骨由軟骨細胞及其自身合成的ECM 共同構(gòu)成。軟骨細胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細胞成分，其受損可導致ECM 合成及分解代謝失衡，關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境紊亂并進展為OA[6-7]。因此，尋找新的靶向信號通路和有效治療途徑，以提高軟骨細胞活性，維持關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，是當前OA 研究的重要任務。

線粒體自噬可保護軟骨細胞并為細胞提供能量，是維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要機制，對軟骨細胞的正常運行具有重要意義[8-9]。Parkin 是一種泛素化連接酶，通過與上游分子聯(lián)合對線粒體膜電位丟失做出應答，可啟動受損線粒體清除過程。近年來發(fā)現(xiàn)OA 軟骨細胞中線粒體自噬受損，Parkin 表達調(diào)控在其中起到重要作用[10]。當線粒體膜去極化時，膜外電位降低導致線粒體外膜內(nèi)外失去電位梯度，Parkin 上游分子PINK1 無法進入內(nèi)膜在線粒體膜外聚集。大量PINK1 聚集在線粒體表面可召集Parkin 及其他因子，啟動線粒體自噬，將受損線粒體從線粒體網(wǎng)中分離出來，通過Parkin招募泛素結(jié)合因子p62，后者與LC3A 結(jié)合促進孤立膜對線粒體的包裹。通常LC3A 位于細胞質(zhì)中，當游離的LC3A 轉(zhuǎn)化為磷脂酰乙醇胺共軛的LC3B 黏附在自噬體外膜上，標志著自噬小體的形成，隨后與溶酶體結(jié)合對其進行降解[11-13]。受損線粒體清除后可有效減少軟骨細胞內(nèi)的活性氧，降低氧化應激對細胞的損害，提高軟骨細胞存活率。

瘦素是由ob 基因編碼、167 個氨基酸組成的肽類激素，除脂肪組織外，包括各種關(guān)節(jié)組織在內(nèi)的許多其他組織和細胞也產(chǎn)生瘦素[3]。研究證明關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)存在瘦素受體表達，且瘦素對OA 的發(fā)展具有兩面性。一方面，外源性瘦素應用后關(guān)節(jié)軟骨的胰島素樣生長因子等蛋白表達增加，提示瘦素可能延緩軟骨退化；另一方面，瘦素可介導和調(diào)節(jié)軟骨和其他關(guān)節(jié)組織的許多炎癥和破壞性反應[3,14-15]。瘦素在OA 關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮促進分解代謝的作用[16-17]。前期研究發(fā)現(xiàn)瘦素干預人軟骨細胞后，MMP1、MMP3 及MMP13 和其他炎性因子表達均增加[18]。體外實驗證明敲低瘦素后MMP13 表達下降，軟骨分解代謝減慢[19]。

為探究瘦素調(diào)控線粒體自噬對軟骨細胞的影響，本課題組選取了Parkin、LC3A、LC3B 及MMP13 作為研究指標。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，瘦素干預OA軟骨細胞24 h 后，紅綠熒光比值下降，提示軟骨細胞線粒體膜電位進一步降低；Parkin 和LC3B 蛋白表達下降，且100 ng/mL 濃度干預較10 ng/mL濃度干預下降更多，提示線粒體自噬受損；MMP13 表達升高，100 ng/mL 濃度干預較10 ng/mL濃度干預升高更多(P＜0.01)，與既往研究一致[18]。此外，當MMP13 表達升高時，細胞代謝失衡，內(nèi)環(huán)境紊亂，促進軟骨退化[20]。而LC3A在瘦素干預后無明顯變化，這可能是因為LC3A位于細胞質(zhì)中，當線粒體自噬受抑制時，LC3A 未能轉(zhuǎn)化為磷脂酰乙醇胺共軛LC3B，完成自噬小體對受損線粒體的包裹，這也從側(cè)面解釋了LC3B 表達下降的原因。瘦素作為促分解代謝的脂肪因子，不僅促進了MMP13 的表達，同時抑制了線粒體自噬Parkin、LC3B 蛋白的胞內(nèi)表達。因此，可以推測瘦素可能通過降低線粒體膜電位使線粒體功能受損，同時抑制軟骨細胞線粒體自噬，促進細胞分解代謝，打破關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)，導致軟骨退變。

本研究通過不同濃度的瘦素干預OA 軟骨細胞，初步證明了瘦素對線粒體去極化的促進作用，以及瘦素在線粒體自噬調(diào)控中的抑制作用，這一作用可能是通過介導Parkin 信號通路來完成的。本研究從分子機制上部分驗證了瘦素對OA 發(fā)展的促進作用，并論證了瘦素對線粒體自噬的抑制機制，可為OA 治療提供新的靶點。

綜上所述，瘦素可通過抑制Parkin 及LC3B等自噬蛋白表達，同時促進MMP-13 表達，一定程度上抑制軟骨細胞線粒體自噬。然而，瘦素在線粒體自噬相關(guān)信號通路中的作用機制以及瘦素對軟骨下骨中成骨細胞、破骨細胞等細胞中線粒體自噬的作用有待下一步研究。