高健明，汪 靖，劉 晨，肖 良，彭 江，汪愛媛，徐宏光

1皖南醫(yī)學(xué)院 脊柱研究中心，皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院 脊柱外科，安徽蕪湖 241001；2 解放軍總醫(yī)院 全軍骨科戰(zhàn)創(chuàng)傷重點實驗室，骨科再生醫(yī)學(xué)北京市重點實驗室，北京 100853

下腰痛是臨床常見疾病，目前認(rèn)為椎間盤退變是導(dǎo)致下腰痛的主要原因[1]。椎間盤中，軟骨終板由透明軟骨組成，是供應(yīng)成熟椎間盤營養(yǎng)物質(zhì)的主要通道[2]。軟骨終板細(xì)胞(cartilage endplate cell，CEP)功能異常和數(shù)量減少會導(dǎo)致軟骨終板鈣化或硬化進(jìn)而減少椎間盤營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，最終導(dǎo)致椎間盤退變的發(fā)生。有研究表明軟骨終板存在原位干細(xì)胞即軟骨終板干細(xì)胞(cartilage endplate stem cell，CESC)，具有較強(qiáng)的克隆形成能力和多向分化潛能[3-5]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)是一種骨髓來源的干細(xì)胞，在一定條件下能夠分化成為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等，可用于多種組織缺損的修復(fù)[6]。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，BMSC 作為一種具有多種分化潛能的種子細(xì)胞越來越受到人們的關(guān)注。本實驗獲取了大鼠腰椎軟骨終板組織，分離出CEP 和CESC，將CEP 分別與CESC、BMSC 進(jìn)行體外非接觸式共培養(yǎng)，通過檢測各共培養(yǎng)組的增殖與凋亡，及軟骨表型基因ACAN、COLⅡ及Sox9 的表達(dá)，對比探討CESC、BMSC 對CEP 的影響，進(jìn)而探討CESC 作為組織工程種子細(xì)胞的潛在可能。

材料和方法

1實驗動物 SD 清潔級大鼠20 只，體質(zhì)量200～300 g，雌雄不限，由北京市科宇動物養(yǎng)殖中心提供。

2主要試劑 0.25% EDTA-胰酶(Gibco)；0.2%Ⅱ型膠原酶(Sigma)；DMEM/F12 (Gibco)；干細(xì)胞培養(yǎng)用血清(上海雙洳生物科技有限公司)；干細(xì)胞成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(賽業(yè)生物科技有限公司)；干細(xì)胞成軟骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(賽業(yè)生物科技有限公司)；干細(xì)胞成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(賽業(yè)生物科技有限公司)；甲苯胺藍(lán)染色劑(索萊寶生物科技有限公司)；茜素紅染色液(索萊寶生物科技有限公司)；油紅O 染色劑(索萊寶生物科技有限公司)；番紅染色液(索萊寶生物科技有限公司)。

3大鼠腰椎CEP 及CESC 的分離和培養(yǎng) 取5 只清潔級SD 大鼠，麻醉后分離出軟骨終板，剪碎，將軟骨終板置于DMEM/F12 配制0.02%的Ⅱ型膠原酶中，37℃下消化4 h，離心重懸后種植于培養(yǎng)瓶中，在37℃、5% 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 換液1 次，獲得CEP，按時用倒置顯微鏡觀察、拍照。待細(xì)胞融合至90%時，進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色。同時將上述獲得的部分原代細(xì)胞按照100/cm2的密度接種到底面積25 mm3培養(yǎng)瓶中[3,7]，37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 換液1 次，培養(yǎng)10 d，獲得CESC。

4大鼠BMSC 的分離和培養(yǎng) 取5 只清潔級SD大鼠，以3% 戊巴比妥鈉40 mg/kg 腹腔注射麻醉，無菌操作下取其四肢的長骨，用注射器抽取長骨內(nèi)骨髓，加含10%胎牛血清的培養(yǎng)液吹打制成單細(xì)胞懸液，分裝于底面積為25 mm2培養(yǎng)瓶中。在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 換液1 次，待細(xì)胞融合至90%時，用體積分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化、傳代。

5大鼠CESC 及BMSC 的三系誘導(dǎo)分化 分別取P3 代大鼠CESC 及BMSC，接種于6 孔板，待細(xì)胞融合至80%時分別加入成脂細(xì)胞誘導(dǎo)液、成軟骨誘導(dǎo)液及成骨誘導(dǎo)液。培養(yǎng)21 d 后，分別用油紅染液、番紅染液及茜素紅染液染色，倒置顯微鏡下觀察拍照。

6Transwell 細(xì)胞共培養(yǎng) 分別將P3 代大鼠CEP、CESC 和BMSC 用體積分?jǐn)?shù)0.25% 胰蛋白酶消化3 min，加入DMEM/F12 培養(yǎng)基終止消化，細(xì)胞懸液收集至離心管，1 500 r/min 離心5 min。收集細(xì)胞，棄上清后，細(xì)胞用含15%胎牛血清的培養(yǎng)液重懸，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。根據(jù)Transwell 小室上下室加入的不同細(xì)胞，分為CEP 組(上室為CEP，下室為CEP)、CESC 組(上室為CESC，下室為CEP)、BMSC 組(上室為BMSC，下室為CEP)，即分別將CESC、BMSC 及CEP 懸液接種于Transwell 小室的上室，孔中細(xì)胞數(shù)約5 × 104個，加入培養(yǎng)基2 mL。而后分別將CEP 的懸液接種于Transwell小室的下室，孔中細(xì)胞數(shù)約5 × 104個，加入培養(yǎng)基2 mL，共培養(yǎng)1 d、3 d、5 d 和7 d，培養(yǎng)期間每2.5 d 換液1 次(圖1)。

圖1 實驗分組 Transwell 共培養(yǎng)示意圖Fig.1 Transwell co-cultivation diagram of experimental groups

7CCK-8 實驗檢測大鼠CEP 增殖能力 利用Transwell 小室將大鼠CEP 分別與CESC 和BMSC進(jìn)行非接觸式共培養(yǎng)1 d、3 d、5 d 及7 d 后，分別更換培養(yǎng)基，加入CCK-8 液后繼續(xù)培養(yǎng)2 h，吸取上清液于96 孔板，每個孔設(shè)定3 個復(fù)孔，無細(xì)胞處理的CCK-8 試劑作為空白對照，用酶標(biāo)儀測定吸光度值，每天同一時間進(jìn)行檢測，計算數(shù)據(jù)后，繪制共培養(yǎng)前后CEP 的生長曲線。

8流式細(xì)胞術(shù)檢測CEP 凋亡率 待CEP 組、CESC 組及BMSC 組軟骨終板細(xì)胞融合至80%左右時，用體積分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化3 min，加入含10% 胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基終止消化，細(xì)胞懸液收集至離心管，2 000 r/min 離心5 min，PBS 洗滌2 次，收集3 × 105個細(xì)胞，加入500 μL 的Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，再依次加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL Propidium Iodide 混勻，室溫避光條件下反應(yīng)10 min，在流式細(xì)胞儀下檢測細(xì)胞凋亡情況。

9RT-qPCR 檢測三組Transwell 小室CEP 軟骨表型基因ACAN、COLⅡ、Sox9 的表達(dá)情況 分別在共培養(yǎng)1 d、3 d、5 d 和7 d 提取CEP RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。COL2A1 上游引物5’ CCTGAAA CTCTGCCACCCAG 3’，下游引物5’ GTTCTT CCGAGGCACAGTCG 3’，ACAN 上游引物5’ACACCCCTACCCTTGCTTCT 3’，下游引物5’AAAGTGT CCAAGGCATCCAC 3’，Sox9 上游引物5’ CGTCAACGGCTCCAGCA 3’，下游引物5’ TGCGCCCACACCATGA 3’。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，重復(fù)40 個循環(huán)。結(jié)果用-△△Ct表示。

10統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0 軟件分析實驗數(shù)據(jù)，實驗數(shù)據(jù)以表示，各組間差異用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1大鼠CESC、BMSC、CEP 分離及培養(yǎng)結(jié)果 大鼠CEP 接種到培養(yǎng)瓶，在單克隆3 d 后，可見培養(yǎng)皿中有細(xì)胞集簇形成，5 d 后集簇明顯，形態(tài)呈梭形，細(xì)胞排列有序(圖2)；CEP 培養(yǎng)10 d 后細(xì)胞接近融合，在 DMEM/F12 培養(yǎng)基中呈多角形或梭形，貼壁生長，細(xì)胞遮光性良好。通過穿刺抽吸法獲得BMSC，細(xì)胞以分散集落方式增長，多呈紡錘形或短梭形，部分細(xì)胞呈多邊形(圖3)。

圖2 單克隆法培養(yǎng)后獲得大鼠CESC，細(xì)胞集簇生長Fig.2 CESC of rats was obtained after culturing by monoclonal method,and the cells grew in clusters

圖3 大鼠BMSC 提取及培養(yǎng)，細(xì)胞呈現(xiàn)集落生長Fig.3 BMSC of rats was extracted and cultured,and the cells showed colony formation activity

2CEP 的細(xì)胞外基質(zhì)分泌 CEP 通過甲苯胺藍(lán)染色可見CEP 能夠分泌細(xì)胞外基質(zhì)酸性黏多糖及膠原如GAG，具有特征性多角形形態(tài)、呈鋪路石樣分布(圖4)。

圖4 大鼠CEP 培養(yǎng)與甲苯胺藍(lán)染色，CEP 呈多角形或梭形，貼壁生長，細(xì)胞遮光性良好Fig.4 CEP of rats was cultured and stained with toluidine blue.The CEP was polygonal or fusiform,it grew adherently,and the cells had good shading properties

3CESC、BMSC 三系誘導(dǎo)分化鑒定 經(jīng)過擴(kuò)增后的CESC 進(jìn)行成脂誘導(dǎo)20 d、21 d 后分別進(jìn)行油紅O 染色，顯微鏡下均可以觀察到大量的紅染脂滴空泡形成。CESC 經(jīng)過28 d 成軟骨誘導(dǎo)，番紅染色顯示CESC 染色為紅色；經(jīng)過擴(kuò)增以后的CESC 進(jìn)行成骨誘導(dǎo)28 d，經(jīng)過茜素紅染色，顯微鏡下均可以觀察到有大量鈣結(jié)節(jié)形成。BMSC 成脂誘導(dǎo)3 周后脂滴數(shù)量增加并相互融合，細(xì)胞由長梭形變?yōu)閳A形或多邊形，油紅O 染色顯示細(xì)胞含有豐富的脂肪顆粒；BMSC 成軟骨誘導(dǎo)4 周，番紅染色顯示BMSC 染色為紅色；BMSC 經(jīng)成骨誘導(dǎo)28 d 后，局部細(xì)胞呈重疊生長，間充質(zhì)逐漸堆積、間充質(zhì)中礦鹽沉積，形成多個結(jié)節(jié)，并逐漸融合，茜素紅染色可見紅色鈣結(jié)節(jié)(圖5)。

圖5 CESC、BMSC 的三系誘導(dǎo)分化，CESC 成脂誘導(dǎo)后，油紅O 染色可以觀察到大量的紅染脂滴空泡形成，成軟骨誘導(dǎo)番紅染色呈紅色，成骨誘導(dǎo)茜素紅染色觀察到有大量鈣結(jié)節(jié)形成；BMSC 成脂誘導(dǎo)后脂滴數(shù)量增加并相互融合，細(xì)胞由長梭形變?yōu)閳A形或多邊形，油紅O 染色顯示細(xì)胞含有豐富的脂肪顆粒，成軟骨誘導(dǎo)番紅染色顯示BMSC 染色為紅色，成骨誘導(dǎo)茜素紅染色可見紅色鈣結(jié)節(jié)Fig.5 The three lines of CESC and BMSC induced differentiation.After CESC was induced into adipogenesis,a large number of red-stained lipid droplets formation could be observed by oil red O staining,the cartilage-induced safranin staining was red,and osteogenic-induced alizarin red staining showed the formation of a large number of calcium nodules.The number of lipid droplets increased and merged with each other after BMSC adipogenesis.The cells changed from a long spindle shape to a round or polygonal shape.Oil red O staining showed that the cells were rich in fat particles.Cartilage induced safranin staining showed that BMSC was stained red,and osteogenic alizarin red staining showed red calcium nodules

4三組細(xì)胞的增殖能力 CCK-8 實驗結(jié)果顯示，在3 d 時，CESC 組、BMSC 組及CEP 組組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，提示與CESC、BMSC、CEP共培養(yǎng)后促進(jìn)了CEP 的增殖能力，且CESC 組增殖能力強(qiáng)于BMSC 組(圖6)。

圖6 CCK-8 檢測共培養(yǎng)結(jié)果，在3 d 時，CESC 組和BMSC 組增殖能力均強(qiáng)于CEP 組，且CESC 組增殖能力強(qiáng)于BMSC(aP＜0.05,vs CEP;bP＜0.05, vs BMSC)Fig.6 CCK-8 test co-culture results showed that on the 3rd day,the proliferation ability of the CESC group and the BMSC group was stronger than that of the CEP group,and the proliferation ability of the CESC group was stronger than that of the BMSC group (aP＜0.05,vs CEP;bP＜0.05, vs BMSC)

5共培養(yǎng)對CEP 凋亡率的影響 流式結(jié)果提示，共培養(yǎng)7 d 后，三組細(xì)胞的凋亡率無統(tǒng)計學(xué)差異(圖7)。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測，CESC 及BMSC 共培養(yǎng)對CEP 凋亡無影響Fig.7 Flow cytometry showed that the co-culture of CEP and BMSC had no effect on CEP apoptosis

6共培養(yǎng)后各組CEP 相關(guān)特異性基因的表達(dá)RT-qPCR 結(jié)果表明三組CEP 共培養(yǎng)1～7 d，ACAN、COLⅡ和Sox9 三種基因的表達(dá)均呈波峰狀改變，3 d 表達(dá)水平最高。1 d、7 d 三組軟骨表型基因ACAN、COLⅡ和Sox9 表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，3 d、5 d時CESC組ACAN、COLⅡ和Sox9 表達(dá)高于BMSC 組和CEP 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖8)。

圖8 共培養(yǎng)后各組CEP 相關(guān)特異性基因的表達(dá)情況，三組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(aP＜0.05)；1～ 7 d CESC 組三種基因ACAN、ColⅡ和Sox9 表達(dá)均呈波峰狀改變，3 d CESC 組三種基因ACAN、ColⅡ和Sox9 表達(dá)水平最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)Fig.8 After co-cultivation,the expression of CEP-related specific genes in each group was detected,and the difference between the three groups was statistically significant (aP＜0.05);the expressions of the three genes ACAN,ColⅡ and Sox9 in the CESC group from 1 d to 7 d all showed peak-like changes.The expression levels of the three genes ACAN,ColⅡ and Sox9 were the highest in the CESC group at the 3 d,and the difference was statistically significant (P＜0.05)

討論

目前，以組織工程等為代表的治療方法逐漸被人們所認(rèn)知，其利用干細(xì)胞組織工程等技術(shù)手段從根本上延緩軟骨終板退變[8]。既往的組織工程技術(shù)，大部分利用種子細(xì)胞的擴(kuò)增和分化效應(yīng)，或以細(xì)胞本身作為元件以求修復(fù)缺損組織。早在2004 年，Mizuno 等[9]采用髓核源性細(xì)胞作為種子細(xì)胞進(jìn)行組織工程，再附加支架材料，實現(xiàn)了由修復(fù)單元新生組織與原生椎間盤組織結(jié)構(gòu)類似的實驗結(jié)果。在既往的椎間盤組織工程研究中，關(guān)于種子細(xì)胞的選擇一直沒有定論，包括髓核細(xì)胞、纖維環(huán)細(xì)胞和不同組織來源干細(xì)胞都是研究者們的研究目標(biāo)[10-13]。

椎間盤終板軟骨干細(xì)胞的獲取，又提供了一種干細(xì)胞來源，且方法簡單，能夠快速大量得到種子細(xì)胞。在現(xiàn)階段，對于軟骨終板干細(xì)胞的研究還處于初級階段，常獻(xiàn)等[14]同樣分離了人CESC，通過Transwell 的方式與退變的髓核細(xì)胞進(jìn)行非接觸式體外共培養(yǎng)，證實了CESC 向髓核細(xì)胞分化的功能，從一定程度上證明了CESC 作為種子細(xì)胞的潛質(zhì)。早期，Liu 等[15]通過對比CESC 與BMSC 的增殖能力，證實了兩者具備相同的增殖潛力。而最新的研究報道了CESC 對于髓核細(xì)胞存在調(diào)控作用，從一定程度上證明了CESC 作為種子細(xì)胞可對其他椎間盤組織部分產(chǎn)生積極作用[16-17]。但在目前的椎間盤組織工程技術(shù)領(lǐng)域中，應(yīng)用較為廣泛的仍是BMSC[18-20]。雖然BMSC 的獲得方法也較為簡單，但不同來源的干細(xì)胞分化趨向不同。早期的研究報道了CESC 具備與BMSC、髓核源性干細(xì)胞、纖維環(huán)源性干細(xì)胞相似的增殖能力和分化能力[21-22]。但并沒有報道將CESC 作為種子細(xì)胞作用于CEP 的實驗。因為CESC 具備較強(qiáng)的成骨分化能力而不是成軟骨分化能力[23]。所以研究者們在對CESC 成軟骨分化調(diào)控方面做出大量的研究[24]。我們認(rèn)為在探究CESC 作為種子細(xì)胞潛質(zhì)的同時，需同時考慮CESC 對CEP 的影響。為了更好地研究CESC 對CEP 的表型影響，同時對比BMSC 對CEP 的影響效果，本實驗分離鑒定了CESC 和BMSC。

提取CESC 的方法包括差速貼壁法[21]、Fibronectin 差別篩選法[17]、瓊脂糖凝膠法和單克隆法[25-26]。本實驗通過單克隆法的低密度培養(yǎng)，從軟骨終板中分離出CESC，同時按照公認(rèn)的軟骨細(xì)胞提取方法提取出CEP[27-29]。在獲取CESC 過程中，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞接種密度達(dá)100/cm2時，獲取效率最高。骨細(xì)胞分泌的含鈣基質(zhì)能夠被茜素紅染成紅色，脂肪細(xì)胞內(nèi)部形成的脂肪滴能夠特異性地與油紅O 染色液結(jié)合而被染成鮮紅色，軟骨細(xì)胞所分泌的軟骨基質(zhì)能夠被番紅染成紅色。利用以上的染色原理，我們對CESC 及BMSC 的多向分化能力進(jìn)行了初步鑒定與比較，發(fā)現(xiàn)CESC 的成骨及成軟骨方向分化能力要強(qiáng)于BMSC，而BMSC 的成脂肪分化能力要強(qiáng)于CESC，這也證明了CESC 良好的分化能力和應(yīng)用在椎間盤組織工程中的潛力。在進(jìn)行多向分化誘導(dǎo)后，未檢測成骨、成脂肪及成軟骨方向的基因變化情況，是本實驗的不足之處，也是我們未來的研究方向之一。

目前的共培養(yǎng)體系主要包括非接觸共培養(yǎng)及接觸共培養(yǎng)兩種。非接觸式共培養(yǎng)的優(yōu)點在于能更好地了解細(xì)胞共培養(yǎng)時的效應(yīng)，以及能夠排除其他因素的干擾。本實驗采用Tanswell 小室，將不同的干細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，上層培養(yǎng)液中的成分可以影響到下室內(nèi)的細(xì)胞，從而可以研究上層培養(yǎng)液中的成分對細(xì)胞生長、運動等的影響[30]。這種在培養(yǎng)時使目標(biāo)細(xì)胞間不直接接觸的培養(yǎng)模式，可以更加清晰地分辨兩種細(xì)胞之間的互相作用，也有利于探究其機(jī)制。但兩種不同干細(xì)胞分別與軟骨終板細(xì)胞非接觸式共培養(yǎng)后，未進(jìn)一步檢測具體相關(guān)分子機(jī)制和信號通路，是本實驗的不足之處，之后將對此進(jìn)一步深化研究。

本實驗發(fā)現(xiàn)，將CESC、BMSC 與CEP 進(jìn)行非接觸共培養(yǎng)后，CESC 可以促進(jìn)CEP 軟骨表型基因ACAN、COLⅡ、Sox9 表達(dá)，并且強(qiáng)于BMSC對CEP 的影響。這表明經(jīng)過共培養(yǎng)的CESC 可增強(qiáng)CEP 特異性相關(guān)分子的表達(dá)，有延緩甚至逆轉(zhuǎn)軟骨終板退變的潛質(zhì)。細(xì)胞增殖及凋亡實驗發(fā)現(xiàn)，與CESC 及BMSC 共培養(yǎng)的CEP 增殖能力均增強(qiáng)，且CESC 對CEP 的增殖能力強(qiáng)于BMSC，CESC 和BMSC 對CEP 的凋亡沒有影響。CESC作為椎間盤內(nèi)源性干細(xì)胞，對椎間盤內(nèi)環(huán)境具有天然的適應(yīng)力，且CESC 在椎間盤術(shù)中容易獲取，但目前無法滿足自體應(yīng)用的條件。因此，CESC 無法作為組織工程傳統(tǒng)意義上的種子細(xì)胞應(yīng)用于臨床進(jìn)行組織的退變、缺損修復(fù)，而需要與原生組織的CEP 進(jìn)行共同作用[31]。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)CESC 對軟骨終板原生的軟骨細(xì)胞有促增殖和分化作用，在后續(xù)的研究和實驗中，可以采取體內(nèi)募集CESC 或誘導(dǎo)增強(qiáng)CESC 功能的方式進(jìn)行椎間盤組織工程的修復(fù)，來實現(xiàn)我們再生修復(fù)軟骨終板的最終目的，且相關(guān)的支架材料也是我們未來的重要研究方向[32-33]。鑒于此，我們認(rèn)為CESC 滿足作為種子細(xì)胞的必備條件，在組織工程技術(shù)修復(fù)椎間盤退變方面具有相當(dāng)?shù)臐摿Α?/p>