段 禮，陳 勇，盧奮堅，肖新民，王 勝，田二坡，鐘 影，溫子娜△

1.四川省成都西囡婦科醫(yī)院男科中心，四川成都 610011;2.四川省成都市錦江區(qū)婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心男科中心，四川成都 610011

近年，輔助生殖技術(shù)治療不育不孕癥有了長足的進步，其中精子質(zhì)量是關(guān)鍵因素之一。關(guān)于如何保護和提高精子的活力和功能以及如何克服冷凍對精子的不良影響的研究引人關(guān)注。目前胰激肽原酶(PK)被廣泛應(yīng)用于男科疾病的治療，有研究報道其對精液液化及精子質(zhì)量具有改善作用[1-3]。本研究初步探討PK對精子質(zhì)量的影響，為改進精子體外保存條件提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年6-9月來成都西囡婦科醫(yī)院行輔助生殖治療體檢的男性患者20例，年齡25～35歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：精液常規(guī)檢查各項參數(shù)正常，無傳染病及遺傳病史，近期無吸毒、吸煙、酗酒等不良生活習(xí)慣，近期無生殖道感染病史。?？撇轶w：排除精索靜脈曲張，排除前列腺腫大。本研究通過成都西囡婦科醫(yī)院倫理委員會及生殖樣本庫批準(zhǔn)，所有提供精液標(biāo)本的患者均知情同意。

1.2方法

1.2.1精液檢查 患者禁欲2～7 d，手淫取精置清潔的一次性取精杯內(nèi)，放入37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育。精液液化后，將同一份精液均等地分成3份，編為A、B、C組，嚴(yán)格按照《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第5版)[4]的技術(shù)規(guī)范進行操作。采用重力分析法測量精液體積，采用HAMILTON THORNE IVOS Ⅱ全自動精液分析儀檢測精子活力。精液參數(shù)正常值參考《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第5版)標(biāo)準(zhǔn)。采用BD FACSCalibur流式細胞儀檢測精子染色質(zhì)(DNA)的完整性，精子核完整性染色試劑盒采用浙江星博生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.2.2精子冷凍及復(fù)蘇 將冷凍保護劑SAGE Quinn′s AdvantageTMSperm Freezing Medium提前置于室溫中復(fù)溫并混勻。A、B、C組均按1份體積冷凍保護劑加入1份體積精液的比例添加保護劑，B、C組中分別再加入40、80 U注射用PK(常州千紅生化制藥股份有限公司)，逐滴加入并旋轉(zhuǎn)凍存管，將混合液在30～35 ℃孵育5 min，檢測3組標(biāo)本冷凍前的精子常規(guī)參數(shù)及DNA碎片指數(shù)(DFI)。將上述混合液吸入冷凍保存管，再逐步移入液氮中。所有標(biāo)本冷凍30 d后放入37 ℃的HH-S2恒溫水浴鍋中復(fù)蘇，然后利用精液分析儀及流式細胞儀分別檢測復(fù)蘇后的精子常規(guī)參數(shù)及DFI。

2 結(jié) 果

冷凍前A、B、C 3組的前向運動精子百分比呈遞增趨勢，B、C組與A組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，復(fù)蘇后3組的前向運動精子百分比呈逐漸上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。冷凍前A、B、C 3組的精子活動率呈遞增趨勢，B、C組與A組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；復(fù)蘇后B、C組的精子活動率高于A組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。冷凍前A、B、C 3組的精子DFI呈逐漸下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，復(fù)蘇后A組的DFI高于B、C組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 冷凍前后各組標(biāo)本的精子參數(shù)比較

3 討 論

目前，隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，人類配子、睪丸組織、卵巢組織等冷凍技術(shù)也不斷提高。精子冷凍技術(shù)為供精助孕、男性不育癥治療提供了條件，但其本身也會對精子質(zhì)量及功能造成不良影響[5-6]。隨著冷凍過程中溫度的急劇變化，精子細胞內(nèi)外的冰晶形成，水分子跨膜移動和滲透壓變化，很容易引起精子細胞膜和線粒體的變化，導(dǎo)致細胞死亡或細胞核的損傷[7]，體現(xiàn)在復(fù)蘇后的精子質(zhì)膜破裂、DNA損傷等方面，最終導(dǎo)致復(fù)蘇后精子活力下降，存活率降低，受精能力變差。部分研究表明隨著冷凍時間的延長，這種影響會不斷加大[8]。

影響人類精子冷凍后質(zhì)量的主要因素有冷凍方法、冷凍保護劑的成分及凍存時間等。近年來，精子的體外冷凍保存技術(shù)層出不窮，各種新型冷凍保護劑的問世、冷凍技術(shù)的改進，使成功冷凍精子變得更加容易，而怎樣減少冷凍對精子的損傷、盡可能保護精子的功能，是目前精子冷凍技術(shù)研究的新方向。鄭九嘉等[9]研究顯示，在精子冷凍保護劑中添加適當(dāng)濃度的維生素E可以緩解凍融過程對精子造成的傷害，在一定程度上提高凍融后精子的活動力、存活率及精子DNA完整性。本研究在精子冷凍保護劑中添加PK，結(jié)果顯示冷凍精子復(fù)蘇后的前向運動精子百分比、精子活動率均有增高趨勢，而DFI呈下降趨勢，表明PK可能具有一定的保護精子作用。

生殖系統(tǒng)微循環(huán)障礙影響精子質(zhì)量，而改善微循環(huán)已經(jīng)被作為男性不育的基礎(chǔ)性治療方法寫入中華醫(yī)學(xué)會男科學(xué)分會制訂的《中國男科疾病診斷與治療指南(2016版)》[10-11]。PK又稱胰激肽釋放酶、血管舒緩素，屬蛋白水解酶類，有擴張血管、改善微循環(huán)、調(diào)整血壓等作用[1,11-12]。從20世紀(jì)80年代開始，PK就被應(yīng)用于男性不育的治療，盡管臨床觀察結(jié)果存在一定的爭議，但一些研究結(jié)果表明，PK治療可以改善精子質(zhì)量[1]。文獻[13]報道，體外實驗中將PK加入到精液中，可以增強精子的活動力和穿透宮頸黏液的能力，以及提高精子運動速度，而且對冷凍復(fù)蘇后的精子存活率和運動能力都有積極的作用，這與本研究得出的結(jié)果一致。50%以上的患者在接受3個月的PK治療后，其精子活力得到改善，同時其正常形態(tài)精子的百分率也相應(yīng)提高，因此在人工授精前常可采用PK對精液進行預(yù)處理[13]，該結(jié)論在本研究中也得到證實，本研究向新鮮精液加入PK恒溫孵育5 min后，前向運動精子百分比和精子活動率都有明顯提高。

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，獲得優(yōu)良精子是提高成功率的關(guān)鍵，精子的冷凍保存更是治療男性不育癥中必備的技術(shù)，特別是微量精子的冷凍成功，為嚴(yán)重少精子、睪丸顯微取精獲得精子提供了生育親生后代的可能。本研究證實了PK有助于提高精子體外保存時的活力，不足之處在于，由于要進行冷凍保存，恒溫孵育時間僅為5 min，接下來筆者團隊將延長孵育時間來進一步驗證這一結(jié)論。另外，在常規(guī)冷凍保護劑中添加PK，冷凍復(fù)蘇后的精子質(zhì)量有一定改善，但差異不顯著，這一結(jié)論有待擴大樣本量來進一步驗證。