熊 見，魏宇燕△，李 亮，段 松

重慶大學附屬三峽醫(yī)院：1.醫(yī)學檢驗科；2.消化內科；3.病理科，重慶 404000

目前，胃癌是世界上常見的惡性腫瘤，全世界每年有超過120萬新發(fā)胃癌病例，我國約占40%，病死率居第2位[1]。胃癌的發(fā)生是由多因素參與的復雜過程，在正常情況下，胃黏膜上皮細胞的增殖和凋亡之間保持動態(tài)平衡,細胞調控機制的紊亂與胃癌的發(fā)生關系密切[2-4]。B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和凋亡細胞相關抗體(Apo2.7)是細胞凋亡基因中的重要成員，在細胞凋亡機制網絡中居中心地位[5-6]，目前對其研究多采用免疫組化的方法，以定性和半定量為主，而流式定量檢測較為少見。由于免疫組化染色方法的局限性，其陰性結果對疾病進程的診斷不及定量方法明確。本研究選取不同類型的凋亡調控相關基因，采用流式細胞術檢測其在胃癌變過程中的表達情況，結合對照免疫組化染色陽性表達情況，研究其與胃癌進程的相關性，探討其在胃癌早期診斷中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年10月至2020年6月在重慶大學附屬三峽醫(yī)院進行胃鏡檢查的364例受檢者的364例標本，其中男204例，年齡35～84歲，中位年齡51歲；女160例，年齡29～81歲，中位年齡59歲；經病理診斷[7]為正常胃黏膜(NOR)73例，慢性淺表性胃炎(CSG)80例，慢性萎縮性胃炎(CAG)67例，腸上皮化生 (IM)35例，黏膜上皮異型增生(GIN) 48例，胃癌 61例。

1.2儀器與試劑 免疫組化染色兔抗人Bcl-2、Caspase-3及Apo2.7單克隆抗體均采用美國Santa Cruz公司產品；流式細胞抗體PE Caspase-3(美國BD，克隆:19/Caspase-3/CPP32，分類號:610322)；PE Bcl-2(美國BD，克隆:N46-467，分類號:562532)；PE Apo2.7(法國Immunotech S.A.S)；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit Ⅰ(美國BD,分類號:556421)；組織勻漿儀(美國BD-GINimachine-90 250)；流式細胞儀(美國BD FACSCanto Ⅱ)。

1.3方法

1.3.1單細胞懸液制備 消化內窺鏡下取新鮮或冷凍組織(1～2 mm)，用磷酸鹽緩沖液(PBS)浸濕。將組織和1 mL PBS放入已預洗過的勻漿盤中，將勻漿盤插入組織勻漿儀中進行組織粉碎1 min。用7 μm孔徑濾器過濾并用PBS沖洗濾器獲得細胞懸液，洗下的細胞放于試管內，250×g離心細胞懸液5 min。棄上清液用PBS重懸細胞沉淀，調節(jié)細胞水平至5×105～1×106/mL。

1.3.2流式標本制備 (1)100 μL單細胞懸液冷破膜后分別加入20 μL Bcl-2、Caspase-3抗體及同型對照，2～8 ℃孵育15～30 min，加2 mL PBS(2～8 ℃)后250×g離心5 min，棄上清液，0.5 mL PBS重懸細胞沉淀備檢。(2)Apo2.7檢測：取100 μL細胞懸液各加在2支試管中，然后加100 μg/mL的Digitonin冰浴透膜20 min，2 mL PBS 250×g離心5 min棄上清液，各加20 μL Apo2.7-PE單抗及同型對照，室溫暗處孵育30 min后PBS洗滌，加入含2.5%小牛血清的PBS 0.5 mL重懸置冰浴中備檢。(3)細胞凋亡檢測管加入5 μL的FITC-Annexin V和5 μL的PI工作液及100 μL單細胞懸液，室溫暗處孵育15 min，0.4 mL PBS重懸備檢。

1.3.3免疫組化染色 運用免疫組化染色SP法檢測所有標本Bcl-2、Caspase-3及Apo2.7的表達。主要步驟：(1)將4 μm切片脫蠟，梯度乙醇脫水；(2)將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)，微波熱修復10 min；(3)3%H2O2去離子水室溫孵育10 min，消除內源性過氧化物酶活性，PBS沖洗3次，每次3 min；(4)除去PBS，滴加非免疫性血清，室溫下孵育10 min，濾紙吸干；(5)滴加50 μL第一抗體，4 ℃過夜，PBS沖洗3次，每次3 min；(6)依次加第二、第三抗體，室溫下各孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；(7)每張切片加入100 μL二氨基聯(lián)苯胺顯色液；(8)自來水沖洗，蘇木素復染；(9)自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明；(10)干燥封片。

1.3.4免疫組化結果判定 細胞質內出現(xiàn)棕黃色顆粒顯像判為陽性反應。根據(jù)陽性細胞的百分率分成4 個等級：陰性(-)，無陽性細胞；+，陽性細胞百分率<30%；++，陽性細胞百分率為30%～70%；+++，陽性細胞百分率>70%。

2 結 果

2.1流式細胞術檢測結果比較 在由CSG向胃癌演變的過程中，細胞凋亡率及Caspase-3、Apo2.7表達率逐漸降低，而Bcl-2則在這一演變的過程中表達率逐漸增加，至胃癌期到達高峰。除GIN組的細胞凋亡率及Apo2.7表達率與胃癌組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)外，其余各組與胃癌組間細胞凋亡率及Apo2.7表達率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CAG、IM、GIN、胃癌組與NOR組比較，細胞凋亡率及Caspase-3、Apo2.7表達率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組Bcl-2、Caspase-3和Apo2.7表達率及細胞凋亡率見表1，變化趨勢見圖1。

表1 流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況及Bcl-2、Caspase-3、Apo2.7表達情況

圖1 Bcl-2、Caspase-3和Apo2.7表達率及細胞凋亡率在各組病變中的變化趨勢

2.2Bcl-2、Caspase-3及Apo2.7的表達率與細胞凋亡率的相關性分析 Bcl-2表達率與細胞凋亡率呈負相關(r=-1.198,P<0.05),Caspase-3、Apo2.7的表達率與細胞凋亡率呈正相關(r=0.852、0.867,P<0.05)。

2.3免疫組化結果比較 不同組間Bcl-2、Caspase-3和Apo2.7的免疫組化陽性率見表2。各基因型表達陽性程度和免疫組化陽性率同流式細胞表達率趨勢較一致。除GIN組的Apo2.7免疫組化陽性率與胃癌組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)外，其余各組與胃癌組Apo2.7免疫組化陽性率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，CAG、IM、GIN、胃癌組與NOR組比較，Bcl-2、Caspase-3和Apo2.7的免疫組化陽性率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 各組Bcl-2、Caspase-3、Apo2.7免疫組化結果比較

3 討 論

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其中腺癌在胃的惡性腫瘤中占95%。胃癌早期癥狀和體征不典型，出現(xiàn)明顯癥狀和體征時已屬中晚期，我國每年胃癌新發(fā)病例約為67.9萬，同期死亡人數(shù)更高達49.8萬[8]。研究表明，“慢性胃炎-胃黏膜萎縮-IM-異型增生-胃癌”為胃癌的病理學發(fā)展模式，胃黏膜細胞凋亡率的進行性下降導致細胞持續(xù)增殖并呈高增生狀態(tài)，過度增殖狀態(tài)的細胞更易受到致癌物質的損傷，從而增加了DNA畸變的風險，最終可能導致胃癌的發(fā)生。研究表明Bcl-2和Caspase-3是重要的兩種凋亡抑制基因，其表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在密切的關系[9-10]。Bcl-2是TSUJIMOTO等最早從伴有t(14；18)(q32；q21)染色體易位的B細胞淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)的原癌基因，而Caspase-3是Caspase系統(tǒng)中導致細胞凋亡的關鍵成分，它是細胞線粒體依賴凋亡途徑的重要因素，處于凋亡級聯(lián)反應的下游，是細胞凋亡效應期的重要中心分子。Apo2.7最早是由ZHANG等[11]報道的新的細胞凋亡標志物，有促進細胞凋亡的作用，主要通過線粒體途徑介導細胞凋亡,在凋亡檢測中極具前景，是凋亡細胞的一個早期反應。線粒體結構和功能障礙是各種刺激因素誘導細胞凋亡的中心事件，單抗能與線粒體膜蛋白特異性結合，并由此導致線粒體內凋亡因子釋放，參與細胞凋亡的調控。Apo2.7參與該調節(jié)，與Bcl-2密切相關。

本研究顯示，Bcl-2、Caspase-3及Apo2.7的表達與細胞凋亡率亦存在相關性，通過Bcl-2的高表達及Caspase-3和Apo2.7基因的表達下調，使細胞凋亡過程受到抑制，細胞凋亡率呈趨勢性下降，細胞凋亡與增殖比例失調可致癌變概率增大，這與劉愛群等[12]或楊靜等[13]通過免疫組化方法檢測胃病變組織中Bcl-2及Caspase-3的研究結果一致。同時本研究也發(fā)現(xiàn)，Bcl-2、Caspase-3及Apo2.7的免疫組化陽性率進展與流式細胞表達率趨勢一致，Bcl-2陽性率漸行性增高，Caspase-3和Apo2.7漸行性降低，其蛋白表達陽性程度亦與其陽性率趨勢相符。流式細胞術檢測各指標可在胃黏膜病變中全程量化，而免疫組化染色各指標只能半定量監(jiān)測，各病變期仍存在陰性標本，特異性不足，體現(xiàn)了流式細胞術相對于免疫組化方法在臨床應用中的一大優(yōu)勢。

本研究資料顯示了在胃癌變過程中，細胞凋亡率、Bcl-2、Caspase-3及Apo2.7的量變關系，通過分析其變化趨勢可對胃癌的早期診斷及病程監(jiān)測提供參考，亦說明了細胞凋亡調控在胃黏膜細胞異常增殖及癌變過程中所起的作用。監(jiān)測細胞凋亡率以及Bcl-2、Caspase-3、Apo2.7在胃黏膜組織中的定量表達情況，可推斷其疾病進展情況。