路 蔓，付 強(qiáng)，張 靜△

空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.泌尿外科，陜西西安 710038

目前，越來越多的研究證實(shí)，惡性腫瘤的發(fā)生與炎癥密切相關(guān)[1]。膀胱癌患者普遍存在炎性反應(yīng)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種常見的炎性反應(yīng)指標(biāo)，有研究表明TNF-α水平與惡性腫瘤的進(jìn)展相關(guān)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞肝癌、前列腺癌、膀胱癌等惡性腫瘤中，核因子-κB(NF-κB)信號通路存在異常激活的現(xiàn)象，并且該因子直接影響著炎癥與癌癥的關(guān)系[3]。本研究擬了解TNF-α誘導(dǎo)對膀胱癌細(xì)胞NF-κB通路分子表達(dá)及細(xì)胞增殖水平的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料 人膀胱癌細(xì)胞2株，即T24和5637，均統(tǒng)一由中科院廣州研究所提供。

1.2儀器與試劑 酶標(biāo)儀(Bio-Rad 680，美國伯樂公司)；實(shí)時(shí)熒光PCR儀(ABI 7500，德國Eppendorf公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(批號：8114641，上海信帆生物科研所)；胎牛血清(批號：56H4627，上海江林生物科技有限公司)；重組人TNF-α試劑(批號：CYT-233-a，默克生命科學(xué))；CCK-8試劑盒(批號：WZ736，上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1培養(yǎng)并處理膀胱癌細(xì)胞 選取人膀胱癌細(xì)胞株T24和5637，采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在37.5 ℃、5%二氧化碳(CO2)條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期。觀察培養(yǎng)的情況，待以一定濃度鋪板生長后，對T24和5637進(jìn)行處理。需要注意的是，在處理之前必須要同步化處理，具體操作要求為使用無胎牛血清培養(yǎng)液進(jìn)行饑餓處理。根據(jù)不同的處理方法，分為兩組，TNF-α處理組采用50 ng/mL TNF-α處理，對照組采用同等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)處理。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 將對數(shù)生長期的細(xì)胞株，以(2～3)×107/mL的水平接種于24孔板中，同步化處理之后，將細(xì)胞分成3個(gè)不同的組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，且獨(dú)立重復(fù)3次。采用TNF-α分別作用1、3、6 h，然后進(jìn)行細(xì)胞的收集。提取細(xì)胞總RNA的方法為Trizol法，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA備用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)[4]操作進(jìn)行。各基因的檢測結(jié)果按2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.3.3癌細(xì)胞增殖活性的檢測 采用CCK-8法對膀胱癌細(xì)胞(T24、5637)的增殖活性進(jìn)行檢測：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以(1～2)×107/L的水平將其接種于細(xì)胞培養(yǎng)液(96孔)中，使用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，持續(xù)24 h。同步化處理：處理完成之后，設(shè)置TNF-α處理組和對照組，每孔設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，獨(dú)立重復(fù)5次。處理24 h，檢測膀胱癌細(xì)胞的增殖活性，檢測時(shí)嚴(yán)格參照CCK-8試劑盒要求和說明進(jìn)行操作。需要注意的是，為提高檢測的質(zhì)量，在檢測前應(yīng)更換培養(yǎng)液，每孔加入100 μL培養(yǎng)液和10 μL的CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。采用酶標(biāo)儀對450 nm波長處各孔的吸光度進(jìn)行檢測，并計(jì)算細(xì)胞存活率。按照以下方法計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=(A處理組-A空白對照組)/(A陰性對照組-A空白對照組)×100%。

1.4觀察指標(biāo) 分析TNF-α處理對不同膀胱癌細(xì)胞株NF-κB信號通路中RelA、RelB兩種基因表達(dá)的影響。比較TNF-α處理對不同膀胱癌細(xì)胞株細(xì)胞增殖能力的影響。

2 結(jié) 果

2.1TNF-α對膀胱癌T24細(xì)胞株NF-κB信號通路的影響 TNF-α處理T24細(xì)胞株后，TNF-α處理組的RelA、RelB基因表達(dá)水平均高于對照組(P<0.05)，且TNF-α處理后，不同時(shí)間RelA、RelB基因表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著時(shí)間的延長基因表達(dá)水平不斷上升。見表1。

表1 TNF-α對膀胱癌T24細(xì)胞株NF-κB信號通路的影響

2.2TNF-α對膀胱癌5637細(xì)胞株NF-κB信號通路的影響 TNF-α處理5637細(xì)胞株后，RelA基因表達(dá)水平在作用3 h后明顯上升，與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但是RelB基因表達(dá)水平與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 TNF-α對膀胱癌5637細(xì)胞株NF-κB信號通路的影響

2.3TNF-α處理對不同膀胱癌細(xì)胞株增殖活性的影響 膀胱癌細(xì)胞株T24和5367經(jīng)TNF-α處理后，對照組、TNF-α處理組的細(xì)胞存活率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組不同膀胱癌細(xì)胞株細(xì)胞存活率的比較

3 討 論

根治性膀胱全切除術(shù)是膀胱癌治療的重要手段，科學(xué)、合理地制訂手術(shù)方案，將病灶予以切除，有利于提高患者的生存質(zhì)量，延長患者的生存期[5]。但是，對于膀胱癌的根治性手術(shù)治療，必須要建立在對該惡性腫瘤全面了解的基礎(chǔ)上，以便能夠最大限度地提高治療水平，滿足患者的治療需求。因此，有必要加強(qiáng)對膀胱癌發(fā)病機(jī)制、原因的分析。

隨著臨床對膀胱癌研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)炎性反應(yīng)與其發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6]。研究表明，在腫瘤微環(huán)境中，經(jīng)常能夠檢測到高水平的炎性細(xì)胞因子或缺氧現(xiàn)象的存在，而細(xì)胞因子和缺氧應(yīng)激均是NF-κB信號通路激活的刺激物，NF-κB信號是連接炎癥與腫瘤的關(guān)鍵通路之一[4,7]。TNF-α是重要的促炎細(xì)胞因子，高度參與了相關(guān)炎性反應(yīng)，并且也參與了NF-κB信號通路的激活，從而“嫁接”起NF-κB信號通路和惡性腫瘤，使二者保持密切聯(lián)系[8-10]。為此，本研究以膀胱癌細(xì)胞株T24和5637為研究對象，對TNF-α這一促炎因子對NF-κB信號通路的影響展開分析。本研究結(jié)果顯示，TNF-α處理T24細(xì)胞株后RelA基因的表達(dá)水平均有所上調(diào)，而5637細(xì)胞株在處理3 h后有明顯上升(P<0.05)。但RelB基因的表達(dá)與RelA基因不同，在TNF-α作用1 h后顯著上調(diào)，可僅局限于T24細(xì)胞株，5637細(xì)胞株在各作用時(shí)間點(diǎn)均無明顯變化(P>0.05)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在TNF-α作用時(shí)間不斷延長的情況下，T24細(xì)胞株RelB基因的表達(dá)上調(diào)幅度逐漸下降，這一結(jié)果提示TNF-α對NF-κB信號的非經(jīng)典通路可能存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制來維持微環(huán)境的穩(wěn)定[2,10-11]。需要注意的是，TNF-α在作用6 h后，T24細(xì)胞株的RelB基因表達(dá)水平上調(diào)，5367細(xì)胞株的RelB基因表達(dá)水平則下調(diào)。由此可以看出，TNF-α作用前后的2個(gè)信號通路基因表達(dá)水平改變并不是完全一致，這在很大程度上表明了TNF-α對NF-κB信號的經(jīng)典和非經(jīng)典通路的作用機(jī)制具有選擇性，作用的過程可能不同。分析TNF-α處理對膀胱癌細(xì)胞增殖活性的影響，結(jié)果顯示無論是作用于T24細(xì)胞株還是5367細(xì)胞株，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，因此從這一結(jié)果可以認(rèn)為TNF-α可能對膀胱癌細(xì)胞株的增殖活性無較大影響。

綜上所述，TNF-α可誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞NF-κB信號通路RelA、RelB基因的表達(dá)，并且主要作用于早期階段，但對細(xì)胞株增殖活性的影響甚微。