陳 晨, 陳 紅 州, 王 晗
( 1.大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034;2.大連工業(yè)大學 食品學院, 遼寧 大連 116034 )
共軛亞麻酸(CLNA)是一組含有3個共軛雙鍵的十八碳三烯酸的位置、幾何異構(gòu)體的總稱,主要來源于植物的種子[1-2]。研究表明,共軛亞麻酸具有減肥、調(diào)節(jié)脂代謝和抗腫瘤等功效[3-4]。近年來的研究發(fā)現(xiàn),共軛亞麻酸的雙鍵位置和構(gòu)像的差異對其誘導腫瘤細胞凋亡的作用有一定的影響[5]。石榴酸(C18:3 c9,tl1,c13,PUA)是共軛亞麻酸的一種異構(gòu)體,主要存在于石榴籽和苦瓜籽中[6]。但是,石榴酸對子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡的影響及作用機理尚不明確。
研究表明,過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)可以通過二聚體化與特異的DNA作用元件結(jié)合,啟動下游靶基因的表達。PPARγ的激活可以抑制胰腺癌和非小細胞肺癌等腫瘤的進展和巨噬細胞活化[7]?;钚匝?ROS)的產(chǎn)生及脂質(zhì)過氧化也與共軛亞麻酸的抗腫瘤作用有關(guān)。Moon[8]和Sun[9]等分別證明α-桐酸(C18:3 c9,tl1,t13,α-eleostearic acid,α-ESA)能夠通過影響PPARγ的活化和ROS的產(chǎn)生誘導乳腺癌MCF-7細胞和膀胱癌T24細胞的凋亡。但是,石榴酸對腫瘤細胞的作用機理仍有待進一步研究。
子宮內(nèi)膜癌是一種女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[10-11],而子宮內(nèi)膜樣腺癌是子宮內(nèi)膜癌中最常見的類型[12-13]。目前的治療方法以化療和手術(shù)為主。但化療在降低致死率的同時,產(chǎn)生較大的副作用[14]。食品來源的活性物質(zhì)具有毒副作用小等特點,因此研究植物油來源的石榴酸對子宮內(nèi)膜樣腺癌細胞凋亡的影響及作用機理,以期為其輔助治療提供實驗依據(jù)。
本實驗以子宮內(nèi)膜樣腺癌細胞RL-952作為研究對象,以α-亞麻酸和α-桐酸為對照,分析了石榴酸對RL-952細胞凋亡的影響,并通過PPARγ抑制劑T0070907和ROS清除劑N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)對石榴酸的作用機理進行了初步探討。
α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸(純度98%),美國Cayman化學公司;子宮內(nèi)膜樣腺癌細胞RL-952,中國科學院細胞庫;DMEM/F12培養(yǎng)基,美國Invitrogen公司;MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒,杭州碧云天生物技術(shù)研究所;胎牛血清(FBS),天津市灝洋生物制品有限責任公司;Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒,鉑優(yōu)生物技術(shù)有限公司;抗β-actin、Bax、Bcl-2、PPARγ、Caspase-3、p53抗體,美國Santa Cruz生物技術(shù)公司;辣根過氧化物酶聯(lián)二抗,北京中杉金橋生物公司;T0070907,美國Cayman化學公司;Hoechst33342 熒光染料、2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(H2DCFDA)活性氧標記、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC),江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。
酶標儀,Tecan Austia GmbH;CO2恒溫培養(yǎng)箱,日本三洋電機株式會社;流式細胞儀,美國貝克曼公司;電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀,大連競邁生物科技有限公司。
1.2.1 細胞培養(yǎng)
接種RL-952細胞至含雙抗和10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中,在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3代后取對數(shù)生長期RL-952細胞進行實驗。
1.2.2 MTT檢測細胞活力
分別將α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸溶解在乙醇中。取對數(shù)期的RL-952細胞離心重懸至含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中,以2×103mL-1接種至96孔板,并于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h[15]。更換培養(yǎng)基并分別加入α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸,使終濃度為10、20、40、80、160 μmol/L。以單獨加入溶劑乙醇組為陰性對照,每組設(shè)置3次平行實驗。繼續(xù)在恒溫培養(yǎng)箱中孵育48 h,加入1.2 μmol/mL的MTT 20 μL,并在恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育。4 h后吸去上清,每孔加入DMSO 150 μL靜置10 min,振蕩1 min后用酶標儀檢測570 nm處吸光度。
1.2.3 Hoechst33342熒光染色觀察凋亡細胞核形態(tài)
RL-952細胞以40 μmol/L的α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸分別處理48 h后,以磷酸緩沖液洗滌細胞,加入培養(yǎng)基并使Hoechst33342終濃度達到1.6 μmol/mL,繼續(xù)孵育10 min,在熒光顯微鏡下應(yīng)用紫外激發(fā)觀察細胞核形態(tài)變化。
1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡
分別以40 μmol/L的α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸處理RL-952細胞48 h,胰酶消化后離心。500 μL Annexin V Binding Buffer重懸細胞后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI,室溫避光孵育10 min,流式細胞儀在激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長530 nm檢測細胞凋亡的情況。
1.2.5 蛋白免疫印跡
從RL-952細胞提取總蛋白,聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并通過轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)印至PVDF膜[16]。5%脫脂奶粉封閉PVDF膜一抗孵育過夜,PBST洗滌,二抗孵育1 h,PBST洗滌,ECL顯影并通過凝膠成像儀拍照,分析實驗結(jié)果。
1.2.6 ROS檢測
分別以40 μmol/L的α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸處理細胞48 h,PBS洗滌,以10 μmol/L的DCFH-DA孵育30 min后,用PBS洗滌后收集細胞,應(yīng)用熒光分光光度計,對各組的熒光強度進行測定(激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長525 nm),計算不同脂肪酸處理組相對于陰性對照組的相對熒光強度。每組設(shè)置3次平行實驗。
1.2.7 抑制實驗
T0070907抑制實驗:陰性對照組,單獨脂肪酸組(分別添加40 μmol/L α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸),單獨T0070907組(10 μmol/L),脂肪酸+T0070907組。每組設(shè)置3次平行實驗。
ROS清除劑NAC拮抗實驗:陰性對照組,單獨脂肪酸組(分別添加40 μmol/L α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸);單獨NAC組(5 mmol/L),脂肪酸+NAC組。處理細胞48 h后,檢測細胞活力。
1.2.8 統(tǒng)計學分析
實驗數(shù)據(jù)以(均值±SD)表示,采用Origin2017 軟件應(yīng)用t檢驗和方差分析進行顯著性分析,P<0.05表明數(shù)據(jù)間具有顯著性差異,具有統(tǒng)計學意義。
如圖1所示,與α-亞麻酸相比,α-桐酸和石榴酸能夠顯著降低RL-952細胞的相對細胞活力(P<0.05),且隨著脂肪酸處理濃度的增加,相對細胞活力的下降更為明顯。同時,在相同濃度脂肪酸處理下,與α-桐酸相比,石榴酸處理組相對細胞活力的下降更為顯著(P<0.05)。結(jié)果提示石榴酸抑制RL-952細胞活力的作用更強。
圖1 石榴酸對RL-952相對細胞活力的影響
如圖2所示,正常細胞核(陰性對照組)邊緣整齊,內(nèi)部均勻且熒光較弱。與α-亞麻酸對照組相比,α-桐酸組和石榴酸組的細胞核凋亡形態(tài)學改變明顯,均出現(xiàn)了較多的細胞核皺縮和顆粒狀強熒光的形態(tài)學變化。其中,石榴酸組細胞核的凋亡形態(tài)學改變較α-桐酸處理組更為明顯。
(a) 對照組
如圖3所示,與α-亞麻酸對照組相比,α-桐酸和石榴酸均具有較強的誘導RL-952細胞凋亡的作用,其細胞凋亡率分別達到44.9%和68.2%。表明石榴酸對子宮內(nèi)膜腺癌RL-952細胞的凋亡誘導作用強于α-桐酸。
(a) 對照組
Caspase-3是凋亡的關(guān)鍵蛋白酶,可直接導致細胞凋亡。Bax屬于促凋亡蛋白,可誘導細胞凋亡,而Bcl-2是一種抗凋亡蛋白,可抑制細胞凋亡,延長細胞生命。因此通過對不同脂肪酸處理的細胞進行蛋白免疫印跡分析,可比較石榴酸處理前后細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達情況。如圖4所示,與α-亞麻酸對照組相比,α-桐酸和石榴酸處理后Bax和Caspase-3蛋白的表達明顯上調(diào),Bcl-2 表達明顯降低,因此Bax/Bcl-2的表達比例明顯上調(diào)。石榴酸處理組Bax/Bcl-2的表達比例上調(diào)最明顯,與Hoechst33342熒光染色細胞核形態(tài)學變化以及流式細胞術(shù)的結(jié)果一致。由于Bcl-2蛋白家族可以通過影響線粒體膜通透性參與凋亡的內(nèi)源途徑,因此,石榴酸能明顯提高Bax/Bcl-2比值,提示其作用可能與凋亡的內(nèi)源途徑有關(guān)。
圖4 石榴酸對RL-952細胞中Bax,Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響
如圖5所示,與α-亞麻酸和α-桐酸的作用相比,石榴酸提高RL-952細胞PPARγ和p53蛋白表達水平的作用更為明顯。腫瘤抑制因子p53作為凋亡活化基因可以通過非轉(zhuǎn)錄依賴方式調(diào)節(jié)細胞的凋亡,且可以轉(zhuǎn)移定位到線粒體,參與Bcl-2蛋白家族對細胞凋亡的調(diào)節(jié)[17]。因此,p53蛋白表達的上調(diào)進一步證明石榴酸的作用與線粒體膜的通道作用有關(guān)。石榴酸處理后,RL-952細胞PPARγ蛋白表達水平的上調(diào),提示石榴酸的作用可能與PPARγ通路有關(guān)。
圖5 石榴酸對RL-952細胞中PPARγ和p53蛋白表達的影響
如圖6所示,單獨添加T0070907組細胞活力與對照組相比沒有顯著性差異。α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸分別處理后,相對細胞活力顯著下降,而α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸分別與T0070907聯(lián)合應(yīng)用處理RL-952細胞后,各組細胞的相對細胞活力顯著提高,其中石榴酸組細胞活力提高最明顯。結(jié)果提示石榴酸對RL-952細胞的影響與PPARγ信號通路有關(guān)。
圖6 T0070907對石榴酸處理的RL-952細胞相對細胞活力的影響
如圖7所示,與陰性對照組相比,α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸處理后,細胞內(nèi)ROS的水平分別增加至1.2、1.4和1.7倍左右,其中石榴酸促進細胞ROS產(chǎn)生的作用最顯著。
圖7 熒光分光光度法檢測石榴酸對RL-952細胞ROS產(chǎn)生的影響
如圖8所示,單獨添加NAC對RL-952細胞的相對細胞活力沒有顯著的影響;單獨添加α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸后,相對細胞活力顯著下降;聯(lián)合應(yīng)用NAC能夠顯著提高α-亞麻酸、α-桐酸和石榴酸處理細胞的相對細胞活力。NAC對石榴酸組細胞的拮抗作用最為顯著。結(jié)果提示ROS的產(chǎn)生可能參與了石榴酸對RL-952細胞凋亡的誘導作用。
圖8 NAC拮抗石榴酸對RL-952細胞活力的抑制作用
石榴酸可抑制子宮內(nèi)膜樣腺癌RL-952細胞的細胞活力,促進RL-952細胞的凋亡,且與另一種共軛亞麻酸異構(gòu)體α-桐酸相比,作用更強。在石榴酸的作用下,凋亡相關(guān)蛋白酶Caspase-3表達明顯上調(diào),凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2的比例明顯上調(diào)。同時,石榴酸可上調(diào)PPARγ和p53蛋白的表達,PPARγ抑制劑T0070907可以顯著拮抗石榴酸對RL-952細胞活力的影響。石榴酸能夠顯著提高RL-952細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,ROS清除劑NAC也可以顯著拮抗石榴酸抑制RL-952細胞活力的作用,提示石榴酸誘導子宮內(nèi)膜腺癌RL-952細胞凋亡的作用與其對PPARγ通路的調(diào)節(jié)和ROS產(chǎn)生的影響有關(guān)。
但是,本研究僅對石榴酸誘導RL-952細胞凋亡的作用機制進行了初步探討,在今后的實驗中,其他相關(guān)信號通路的作用以及信號通路之間的相互作用,仍有待深入的研究。